Đang tải... (xem toàn văn)
Phân lập vi khuẩn bacillus subtilus trong phân heo và thử đối kháng với E.Coli gây bệnh tiêu chảy trên heo
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN QUỲNH NAM PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATE BACILLUS SUBTILIS IN PIG FECES AND TEST THE ANTAGONISM WITH E. COLI K88 Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student Dr. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và trang bị cho em những kiến thức cần thiết nhất để em hoàn tất khóa luận này. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. Các Thầy, Cô tại phòng thực tập vi sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phòng vi sinh đã khuyến khích , ủng hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006 Nguyễn Quỳnh Nam iv TÓM TẮT Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13 chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12 giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ . i Tóm tắt . ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt . iv Danh sách các hình v Danh sách các bảng . vi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy . 3 2.2. Enterotoxigenic E. coli 4 2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT 4 2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 4 2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 . 4 2.2.2. Độc tố kháng nhiệt 5 2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa 5 2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb 6 2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC . 7 2.3. Chế phẩm sinh học 9 2.3.1. Định nghĩa . 9 2.3.2. Cơ chế tác động 9 2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học 9 2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học 10 2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10 2.4. Bacillus subtilis . 11 2.4.1. Đặc điểm phân loại 11 2.4.2. Đặc điểm hình thái 11 2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis 13 2.5.1. Giới thiệu 13 2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome . 14 2.5.2.1. Subtilin . 14 2.5.2.2. Subtilosin 15 2.5.2.3. Sublancin 16 2.5.2.4. TasA . 16 2.5.3. Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome . 18 2.5.3.1. Surfactin . 17 2.5.3.2. Fengycin . 19 2.5.3.3. Mycosubtilin . 29 2.5.3.4. Bacilysocin . 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 22 vi 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22 3.1.1. Thời gian . 22 3.1.2. Địa điểm 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm . 22 3.2.1. Mẫu thí nghiệm . 22 3.2.2. Hóa chất . 22 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 22 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu . 22 3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo 22 3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa 23 3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA . 24 3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSB 24 3.3.5. Thử kháng sinh đồ . 24 3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% . 24 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 25 4.1. Kết quả 25 4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo 25 4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA . 27 4.1.3. Kết quả đối kháng trên môi trƣờng TSB . 29 4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ . 30 4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột . 32 4.2. Thảo luận 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1. Kết luận . 33 5.2. Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 34 PHỤ LỤC 39 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ETEC : Enterotoxigenic E. coli EAEC : Enteroaggregative E. coli LT : Heat-labile toxin ST : Heat-stable toxin CT : Cholera enterotoxin EAST : Enteroaggreative stable-toxin ENS : Enteric nervous system GC-C : Guanylate cyclase C ABC : ATP-binding cassette viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA 25 Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2 . 27 Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ 31 Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm . 28 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng là 10-2 trên môi trƣờng TSA . 27 Bảng 4.2 : Kết quả số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ 29 Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng . 30 Bảng 4.4 : Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trên môi truờng thạch tinh bột 1% . 32 [...]... trên heo, nhằm phục vụ cho vi c ứng dụng vào trong chăn nuôi 1.2.2 Yêu cầu Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo ở Đồng Nai và Bình Dƣơng Chọn lọc đƣợc dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E coli Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E coli gây bệnh trong môi trƣờng TSB Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc... kính hiển vi, cân điện tử Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, phễu, bình tam giác, 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo Qui trình phân lập Bacillus subtilis trong phân heo Lấy 0,2g đến 0,3g phân heo cho vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất vô trùng, pha loãng thành 10-2, nung ở nhiệt độ 80°C trong 1 giờ, pha loãng thành 10-3 trang vào đĩa TSA ủ ở 37°C trong 24... đƣợc sự phân công của khoa công nghệ sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts Nguyễn Ngọc Hải chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối kháng với E coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ” 2 1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn. .. dụng que cấy, cấy các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc ủ ở 37°C trong 24 giờ, nhỏ dung dịch iod dùng compa đo vòng phân giải tinh bột, tính vòng phân giải là hiệu số giữa đƣờng kính vòng phân giải và đƣờng kính khuẩn lạc 25 6 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết Quả 4.1.1 Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo Phân heo đƣợc pha loãng ở nồng độ 10-2 nung ở 80oC trong 1 giờ, pha loãng ra... trƣờng của Vi t Nam nhƣ Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng đƣợc nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú Do đó tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn E... tử của Bacillus subtilis có khả năng nảy mầm đƣợc trên phần đầu của ruột non (3) Điều này làm cho vi c nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic đƣợc đẩy mạnh 2.4 Bacillus subtilis 2.4.1 Đặc điểm phân loại Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.4.2 Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn, ... của Bacillus subtilis với các nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli khác nhau: không pha loãng, 10- 24 1 , 10-2, 10-3, sau đó trang dung dịch vi khuẩn E coli của từng độ pha loãng lên bề mặt đĩa petri chứa 15 ml môi trƣờng TSA, dùng que cấy vòng lấy 1 vòng canh khuẩn trong ống canh khuẩn Bacillus subtilis cấy thành đốm trên đĩa petri, ủ 37°C trong 24 giờ, dùng compa để đo vòng kháng khuẩn, vòng kháng khuẩn. .. đƣợc các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo quản dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa… .Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống bacillus thì Bacillus subtilis đƣợc tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus subtilis không mang những gene gây độc cho ngƣời và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus subtilis... cùng plasmid hoặc đƣợc tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn, có một vài tính trạng riêng biệt đƣợc mã hóa trên transposome hay phage Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên heo 2.2 Enterotoxigenic E coli (ETEC) Enterotoxigenic E coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là một thành vi n trong trong 2 loại độc tố enterotoxin... hiệu số giữa đƣờng kính vòng kháng khuẩn với đƣờng kính khuẩn lạc, chọn 5 chủng cho vòng kháng khuẩn lớn nhất để thực hiện đối kháng trên môi trƣờng TSB 3.3.4 Đánh giá sự đối kháng với E coli trong môi trƣờng TSB Cấy E coli và chủng vi khuẩn Bacillus subtilis vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, lấy 0,5 ml canh khuẩn của từng chủng Bacillus subtilis cho vào mỗi bình . cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú. Do đó tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn. cho vi c ứng dụng vào trong chăn nuôi. 1.2.2 Yêu cầu Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo ở Đồng Nai và Bình
