Đang tải... (xem toàn văn)
Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ NHA TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN NGUYỄN THỊ NHA TRANG KS. NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Kính dâng Bố và Mẹ, ngƣời đã sinh thành, dạy dỗ và luôn động viên con để có đƣợc kết quả hôm nay. Cảm ơn Anh hai đã hỗ trợ và động viên em trong suốt quá trình học tập. Cảm ơn gia đình thân yêu của tôi! iv LỜI CẢM ƠN Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: * PGS. TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã hƣớng dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực tập và giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng Quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt đẹp cũng nhƣ truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. * Xin cảm ơn KS. Lê Thị Thu Hà cùng các anh chị trong phòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ trong thời gian làm quen với thao tác phòng thí nghiệm và trong quá trình làm đề tài. * Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. Sinh viên thực hiện NGUYỄN THỊ NHA TRANG v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đề tài “XÁC ĐỊNH QUY TRÌNH LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG HEO” đƣợc tiến hành từ ngày 10 – 03 – 2007 đến ngày 10 – 07 – 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Hƣớng dẫn đề tài: 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. KS. Nguyễn Văn Út Việc ly trích DNA từ mẫu máu, mẫu da, mẫu cơ đã trở nên quen thuộc trong các thí nghiệm sinh học phân tử trƣớc đây và hiện nay. Tuy nhiên, nhiều khi chúng ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự, trong khảo cổ học, hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm, ta chỉ có đƣợc mẫu lông hay tóc. Do đó, việc lấy mẫu lông hay tóc và ly trích DNA từ loại mẫu này trở nên rất cần thiết trong những trƣờng hợp này. Ngoài ra, việc thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác (nhƣ máu, da, cơ…) trên thú sống. Chúng ta có thể nhổ hoặc cắt một vài lông trên thú một cách dễ dàng mà không phải giết mổ hay gây ra stress cho thú sống. Việc ly trích DNA từ lông sẽ mở rộng ra cho ly trích DNA từ các cấu trúc tƣơng tự lông nhƣ móng, mỏ, da, xƣơng… Với mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, từ nhiều vị trí trên sợi lông và xác định sự xuất hiện của gen halothane, đề tài đƣợc tiến hành trên lông heo. Kết quả ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phát hiện gen halothane. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Sử dụng buffer ly trích chứa proteinase K ở các nồng độ 0,8 mg/ml, 1 mg/ml và 1,2 mg/ml đều cho chất lƣợng DNA tốt với tỷ số OD từ 1,75 – 1,84. 2. DNA đƣợc ly trích với DTT ở nồng độ 50 mM khá tinh sạch (OD = 1,65) và thành công khi đƣợc dùng làm nguồn mẫu cho phản ứng PCR. vi 3. Sử dụng CTAB 0,2% cho DNA tinh sạch (tỷ số OD trung bình là 1,80) và phản ứng PCR khuếch đại đƣợc gen halothan ở nồng độ CTAB 0,2%. 4. Vị trí gốc lông cho DNA ly trích tinh sạch nhất (OD = 2,05), tiếp theo là vị trí thân lông (OD = 1,84), cả sợi lông (OD = 1,75) và vị trí ngọn lông (OD = 1,4). Phản ứng PCR khuếch đại gen halothane cho tỷ lệ thành công cao nhất đối với mẫu gốc lông (70%), tiếp theo là mẫu thân lông (60%) và cả sợi lông (50%). Phản ứng PCR không thành công đối với mẫu ngọn lông. vii MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn . iii Tóm tắt khóa luận v Mục lục . vii Danh sách các chữ viết tắt . x Danh sách các bảng . xi Danh sách các hình và biểu đồ . xii PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 2 1.2.1. Mục tiêu . 2 1.2.2. Yêu cầu 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1. Cấu trúc của lông 3 2.1.1. Cấu trúc tổng quan . 3 2.1.2. Cấu trúc của melanin . 4 2.1.3. Cấu trúc của keratin . 4 2.1.4. Các liên kết trong lông 5 2.1.4.1. Liên kết cuộn xoắn A . 5 2.1.4.2. Liên kết trong protein keratin . 6 2.1.4.3. Liên kết hydrogen . 6 2.1.4.4. Liên kết muối 6 2.1.4.5. Liên kết cystine . 6 2.1.4.6. Liên kết đƣờng 6 2.1.5. Chu kỳ phát triển của lông heo 6 2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông . 7 2.2.1. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở nƣớc ngoài . 7 viii 2.2.2. Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nƣớc 9 2.3. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) . 10 2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của PCR 10 2.3.2. Những thành phần tham gia vào phản ứng PCR . 10 2.4. Gen halothane . 11 2.4.1. Khái quát về gen halothane . 11 2.4.2. Ảnh hƣởng của gen halothane . 12 2.4.2.1. Ảnh hƣởng của gen halothane đến năng suất sinh sản . 12 2.4.2.2. Ảnh hƣởng của gen halothane đến sinh trƣởng và phẩm chất thịt . 13 2.5. Những công trình nghiên cứu về halothane 13 2.5.1. Nguyên tắc xác định gen halothane . 13 2.5.2. Những công trình nghiên cứu halothane ở nƣớc ngoài . 14 2.5.3. Những công trình nghiên cứu halothane trong nƣớc . 14 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1. Nội dung nghiên cứu 16 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 16 3.3. Vật liệu . 16 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA 16 3.3.2. Đoạn mồi . 16 3.3.3. Hóa chất . 16 3.3.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài 17 3.3.4.1. Dụng cụ . 17 3.3.4.2. Thiết bị 17 3.4. Phƣơng pháp tiến hành . 18 3.4.1. Lấy và trữ mẫu . 18 3.4.2. Tách chiết DNA . 19 3.4.2.1. Thiết lập quy trình ly trích DNA từ lông heo 19 3.4.2.2. Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của lông heo 20 3.4.3. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế 21 ix 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR 21 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả 22 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose . 22 3.4.5.2. Đọc kết quả 22 3.5. Xử lý số liệu . 22 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 23 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ proteinase K . 23 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ DTT 26 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ CTAB . 27 4.4. Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí lông heo . 29 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30 5.1. Kết luận . 30 5.2. Đề nghị . 30 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO . 31 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair cs cộng sự DNA deoxyribonucleic acid OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide PCR polymerase chain reaction PSE Pale, soft, exudative Taq Thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit international UV ultra violet W wave KAP keratin associated proteins HP halothane positive HN halothane negative [...]... lập quy trình ly trích DNA từ lông heo (1) Khảo sát nồng độ proteinase K (2) Khảo sát nồng độ DTT (3) Khảo sát nồng độ CTAB 3.1.2 Áp dụng quy trình ly trích DNA cho các vị trí khác nhau của lông (1) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu gốc lông (2) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu thân lông (3) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu ngọn lông (4) Áp dụng quy trình ly trích DNA cho mẫu cả sợi lông. .. hành tách chiết DNA trên mẫu lông và đƣa ra kết luận rằng DNA ly trích từ cơ khá tinh sạch và có hàm lƣợng cao hơn so với DNA ly trích từ lông; DNA ly trích từ gốc lông có độ tinh sạch cao hơn so với DNA ly trích từ ngọn lông Bùi Thị Ngọc Bích (2006) đã sử dụng một số hoá chất để cải thiện hiệu quả quy trình ly trích DNA từ lông và đƣa ra kết quả nhƣ sau: DTT và CTAB trong dung dịch đệm ly trích đã cải... Tìm ra vị trí tốt nhất trên sợi lông heo để ly trích DNA 1.2.2 Yêu cầu - Khảo sát nồng độ các hoá chất để cải tiến quy trình ly trích DNA từ lông heo - Kiểm tra hiệu quả quy trình ly trích thông qua đo OD và phản ứng PCR - Áp dụng quy trình ly trích DNA lên các vị trí khác nhau của sợi lông heo 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cấu trúc của lông 2.1.1 Cấu trúc tổng quan Lông gồm 3 lớp chính: lớp tủy... trí nào của lông heo, thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ mô tả bên dƣới * Thí nghiệm 4: Áp dụng quy trình ly trích lên các vị trí khác nhau của lông Thí nghiệm 4 đƣợc tiến hành nhằm khảo sát hiệu quả của việc tách chiết DNA theo quy trình tối ƣu trên đối với các vị trí khác nhau của lông Từ đó rút ra vị trí tốt nhất trên lông để ly trích DNA Thí nghiệm 4 đƣợc thực hiện theo các trình tự của quy trình tham khảo... đo OD 3.4.4 Thực hiện phản ứng PCR DNA sau khi đƣợc ly trích từ lông heo theo các quy trình trên đƣợc sử dụng làm mẫu để thực hiện PCR xác định gen halothane Kết quả PCR sẽ là một trong những chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng DNA ly trích Quy trình PCR xác định gen halothane đƣợc tham khảo từ Lƣơng Quý Phƣơng (2006) Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối... phút Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C Lấy tủa Thu hồi DNA: Thêm 300 µl NaCl 1,2 M; 150 µl sodium acetate 2 M, 1.000 µl ethanol tuyệt đối lạnh Ủ 2 giờ Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút, 250C Lấy tủa Làm khô tủa Thêm 100 µl TE 1 X 21 Quy trình trên là quy trình tham khảo Từ đó, tiến hành các thí nghiệm nhƣ mô tả bên dƣới để tìm quy trình ly trích DNA từ lông phù hợp 3.4.2.1 Thiết lập quy trình ly trích. .. nhanh chóng, chính xác gen halothane ở thú trƣớc khi đƣa vào sử dụng là rất cần thiết Đƣợc sự chấp thuận của Bộ môn Công nghệ sinh học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM và sự hƣớng dẫn của PGS TS Trần Thị Dân và KS Nguyễn Văn Út, tôi đã tiến hành đề tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo 1.2 Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu - Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông heo - Tìm ra vị trí... trên thị trƣờng thƣờng không phù hợp vì giá thành cao Vì vậy, 10 tùy theo mục đích thí nghiệm mà chúng ta sẽ sử dụng quy trình ly trích hay bộ kit có sẵn trên thị trƣờng 2.2.2 Những công trình tách chiết DNA từ lông ở trong nƣớc Ở nƣớc ta, việc tách chiết DNA từ mẫu lông chƣa đƣợc phổ biến Việc tìm ra một quy trình ly trích DNA từ mẫu lông phù hợp với điều kiện hóa chất và thiết bị ở Việt Nam đang là... lông chứa một lƣợng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phƣơng pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là nó có lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu Do đó, hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có thể đƣợc... để so sánh 3 quy trình ly trích: quy trình 1 sử dụng proteinase K nồng độ 0,8 mg/ml; quy trình 2 sử dụng proteinase K nồng độ 1 mg/ml và quy trình 3 sử dụng proteinase K nồng độ 1,2 mg/ml (các yếu tố khác đƣợc giữ nguyên nhƣ trong quy trình tham khảo) Các bƣớc tiến hành theo quy trình tham khảo Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố Mẫu thí nghiệm là mẫu gốc lông heo Số mẫu . tài “ Xác định quy trình ly trích DNA từ lông heo . 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu - Xác định quy trình tách chiết DNA từ lông heo. . Việc ly trích DNA từ lông sẽ mở rộng ra cho ly trích DNA từ các cấu trúc tƣơng tự lông nhƣ móng, mỏ, da, xƣơng… Với mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly
