Đang tải... (xem toàn văn)
Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola Wei gây bệnh trên cây cao su tại lai khê bằng phương pháp RFLP-PCR
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGƠ QUANG HƢỞNG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN NGÔ QUANG HƢỞNG ThS PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell Arg AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED OUT BY USING RFLP – PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD BUI CACH TUYEN NGO QUANG HUONG MSc PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS Bùi Cách Tuyến - hiệu trưởng trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh ThS Phan Thành Dũng - trưởng Bộ môn bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam Đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi thực hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường - Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực tập hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp - KS Nguyễn Ngọc Mai, KS Vũ Thị Quỳnh Chi tập thể cô chú, anh chị làm việc Bộ môn bảo vệ thực vật - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ, động viên ủng hộ trình thực khóa luận - ThS Nguyễn Văn Cường anh chị làm việc Trung tâm phân tích thí nghiệm hố sinh - Đại học Nơng Lâm TP HCM giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn để hồn thành tốt khóa luận Tập thể bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH Nông Lâm TP HCM bên tơi lúc khó khăn, tơi chia vui buồn trình học trình thực khóa luận Và đặc biệt xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, dƣỡng dục nên ngƣời, để Con đƣợc nhƣ ngày hôm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006 Sinh viên Ngơ Quang Hưởng TĨM TẮT NGƠ QUANG HƢỞNG, Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006 “Phân tích đa dạng di truyền quần nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) kỹ thuật RFLP – PCR” Hướng dẫn khoa học: PGS TS Bùi Cách Tuyến ThS Phan Thành Dũng Thời gian thực từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố – Sinh, trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Vấn đề bảo vệ thực vật nhận quan tâm lớn toàn xã hội Đối với nước sản xuất cao su thiên nhiên Việt Nam, nghiên cứu vi sinh vật, côn trùng, sâu hại cao su vô cấp thiết Bệnh rụng Corynespora nấm Corynespora cassiicola gây bệnh vơ nguy hiểm Nó gây thiệt hại lớn kinh tế Để tạo tiền đề cho nghiên cứu loại bệnh này, sử dụng phương pháp RFLP – PCR để phân tích tính đa dạng di truyền quần thể nấm C cassiicola Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương Nơi dung nghiên cứu: - Phân lập tách đơn bào tử dòng nấm Corynespora cassiicola - Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS primer ITS A ITS B - Phân tích RFLP sản phẩm PCR thu Các kết đạt được: - Phân lập 65 dòng nấm tách đơn bào tử 24 dòng nấm C cassiicolai dịng vơ tính cao su khác - Dùng PCR khuếch đại vùng gene nằm đầu 3’ rDNA 18S đầu 5’ rDNA 28S, với kích thước 540 bp - Phân cắt sản phẩm PCR với loại enzyme cắt Hae III, Sau3A I, EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I Kết khơng tìm thấy băng đa hình cắt loại enzyme Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm C cassiicola chưa cho kết mong muốn Khơng tìm thấy khác biệt phân cắt loại enzyme Do đó, cần có nghiên cứu sâu giải trình tự để có kết luận xác mức độ đa dạng di truyền quần thể nấm MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt x Danh sách bảng xi Danh sách hình xii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 2.1.1 Sơ lược cao su Hevea brasiliensis Muell Arg giới Việt Nam 2.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến phát triển cao su 2.1.3 Tình hình bệnh hại cao su 2.2 Giới thiệu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 2.2.1 Lịch sử phát nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt ) Wei 2.2.2 Đặc điểm phân loại học nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 2.2.3 Hình thái học đặc tính sinh học nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 2.2.4 Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố triệu chứng bệnh rụng Corynespora 2.2.5 Tình hình bệnh rụng Corynespora nước trồng nhiều cao su giới 2.3 Giới thiệu phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10 2.3.1 Sơ lược kỹ thuật PCR 10 2.3.2 Thành phần phản ứng PCR yếu tố ảnh hưởng đến kết phản ứng PCR 10 2.3.3.1 DNA mẫu 10 2.3.3.2 Primer nhiệt độ lai 11 2.3.3.3 Enzyme 12 2.3.3.4 Mg2+ 12 2.3.3.5 dNTPs 12 2.3.3.6 Số lượng chu kỳ 12 2.3.3.7 Nhiệt độ pH 13 2.3.3.8 Thiết bị dụng cụ phản ứng PCR 13 2.3.4 Các bước thực phản ứng PCR 13 2.3.5 Ưu nhược điểm phản ứng PCR 14 2.3.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR 14 2.4 Giới thiệu kỹ thuật RFLP 15 2.4.1 Sơ lược enzyme cắt giới hạn 15 2.4.1.1 Giới thiệu chung 15 2.4.1.2 Tên gọi enzyme cắt giới hạn 15 2.4.1.3 Các loại RE 16 2.4.1.4 Ứng dụng enzyme RE 17 2.4.2 Sơ lược phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) 17 2.4.2.1 Giới thiệu chung 17 2.4.2.2 Quy trình thực phản ứng RFLP 17 2.4.2.3 Sơ lược kỹ thuật RFLP – PCR 18 2.6 Giới thiệu vùng ITS 19 2.7 Một số nghiên cứu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei nước nước 20 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 22 3.1.1 Thời gian 22 3.1.2 Địa điểm 22 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22 3.2 Nội dung nghiên cứu 22 3.3 Vật liệu phương pháp 22 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử thu sinh khối 22 3.3.1.1 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 22 3.3.1.2 Phương pháp lấy mẫu 23 3.3.1.3 Phương pháp phân lập nấm 23 3.3.1.4 Phương pháp tách đơn bào tử 23 3.3.1.5 Phương pháp nhân sinh khối 24 3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA nấm 24 3.3.2.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 24 3.3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA 24 3.3.2.3 Định tính DNA kỹ thuật điện di 25 3.3.2.4 Tinh sản phẩm ly trích 25 3.3.2 Khuếch đại vùng ITS nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei kỹ thuật PCR 26 3.3.2.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 26 3.3.2.2 Thực phản ứng PCR 26 3.3.2.3 Điện di sản phẩm PCR đánh giá kết điện di 27 3.3.3 Phân tích RFLP vùng ITS dịng nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei 28 3.3.3.1 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 28 3.3.3.2 Thực phân tích RFLP 28 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Phân lập tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola số dịng vơ tính cao su 29 4.1.1 Diễn biến mức độ gây hại tác nhân gây bệnh rụng Corynespora 29 4.1.2 Kết phân lập 32 4.1.3 Kết tách đơn bào tử 32 4.1.4 Kết nhân sinh khối 35 4.2 Kết ly trích tinh DNA sợi nấm 36 4.3 Kết khuếch đại vùng ITS nấm nhờ PCR 37 4.4 Phân tích RFLP vùng ITS dòng nấm Corynespora cassiicola 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 52 DNA xuất gel điện di Và đó, hai cá thể giống mặt di truyền sau cắt cho đoạn DNA có kích thước giống Sau tiến hành PCR, thu sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu tiến hành phân cắt enzyme cắt giới hạn Trong điều kiện cho phép sử dụng loại enzyme để phân cắt sản phẩm PCR Hae III, EcoR I, Sau3A I, Alu I, Cfo I, Nde II, Rsa I Sau tiến hành cắt enzyme cắt giới hạn, tiến hành điện di gel 1,5% để kiểm tra kết Đối với enzyme Hae III, sản phẩm PCR tất dòng cắt làm band với kích thước band 390bp 150bp, đồng thời không cho band đa hình (Hình 4.10) 540bp 300bp 100bp Hình 4.10: Sản phẩm PCR cắt Hae III 540bp 400bp 100bp Hình 4.11: Sản phẩm PCR cắt EcoR I Theo Hình 4.11 cắt sản phẩm PCR enzyme EcoR I cho hai band có kích thước 240 bp 300 bp 540bp 400bp 100bp Hình 4.12: Sản phẩm PCR cắt Sau3A I Tương tự với hai enzyme Hae III EcoR I, enzyme Sau3A I phân cắt sản phẩm PCR thu thành hai đoạn có kích thước khoảng 340 bp 200 bp (Hình 4.12) 540bp 400bp 100bp Hình 4.13: Sản phẩm PCR cắt Alu I 540bp 400bp 100bp Hình 4.14: Sản phẩm PCR cắt Cfo I 400bp 400bp Hình 4.15: Sản phẩm PCR cắt Rsa I 540bp 400bp 100bp Hình 4.16: Sản phẩm PCR cắt Nde II Ghi chú: 1: (LH9/0023) 6: 14 (LH99/0131) 11: 52 (LH99/0050) 2: 7A (LH99/0081) 7: 23 (LH99/0374) 12: 53 (LH99/0053) 3: 7B (LH99/0081) 8: 28 (LH99/0412) 13: 54 (LH99/0112) 4: 11 (LH99/0093) 9: 35 (LH99/0617) 14: 55 (LH99/0216) 5: 12 (LH99/0098) 10: 42 (LH99/0679) 15: 59 (LH99/0636) 16: 60 (LH99/0675) 19: 64 (LH99/0672) 17: 62 (LH99/0757) 20: 65 (RRIV4) 18: 63 (LH99/0778) DC: Đối chứng âm (sản phẩm PCR chưa cắt) Có kết phân cắt tương tự tiến hành cắt Alu I, Cfo I, Nde II Rsa 540bp I Các enzyme cắt sản phẩm PCR thành hai đoạn có kích thước mơ tả Bảng 4.4 Sản phẩm bị mờ nhiều nguyên nhân kích thước band nhỏ (nhỏ 200 bp), điện di bồn lớn đòi hỏi gel phải dày nên nhuộm ethidium bromide chưa đủ thời gian Bảng 4.4: Kích thƣớc đoạn DNA sau phân cắt enzyme RE Kích thƣơc tƣơng Kích thƣớc tƣơng đối đoạn DNA thứ đối đoạn DNA thứ hai Hae III 140 400 Đơn hình EcoR I 240 300 Đơn hình Sau3A I 340 200 Đơn hình Alu I 380 160 Đơn hình Cfo I 250 290 Đơn hình Nde II 200 340 Đơn hình Rsa I 200 340 Đơn hình Tên RE Ghi Như vậy, tất enzyme sử dụng có vị trí cắt sản phẩm PCR thu Tuy phân tích số lượng mẫu tương đối lớn (20 mẫu) sử dụng loại enzyme để phân cắt chúng tơi khơng tìm thấy sai khác mặt di truyền dòng nấm phân tích Các dịng nấm phân lập nhiều dịng vơ tính cao su khác tất dịng vơ tính thuộc quần thể Vườn tuyển non Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam (Lai Khê, Bình Dương) Rất có dịng nấm phân lập thuộc chủng Tuy nhiên vùng ITS nấm vùng bảo tồn, khó để khẳng định xác dịng nấm thuộc chủng Kết nghiên cứu đưa đến kết luận biến thiên khuẩn lạc trình tách đơn bào tử Hai dòng 7A 7B hai dòng tách từ đơn bào tử khác dòng nấm ban đầu, phân cắt enzyme cắt khơng tìm thấy khác niệt Điều khẳng định nấm C cassiicola lồi nấm có mức độ biến đổi sinh hóa cao Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu nước trước Mặt khác có khác biệt trình tự nucleotide khơng vị trí cắt enzyme sử dụng, sử dụng enzyme cắt khơng tìm thấy đa hình Vì vậy, cần phải có nghiên cứu sâu giải trình tự vùng ITS kết luận xác có khác biệt mặt di truyền dòng hay không PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Nấm C cassiicola loài nấm mới, mức độ gây hại cao có yếu tố phát sinh bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường, ký chủ vùng địa lý Triệu chứng bệnh biến thiên lớn, việc quản lý kiểm soát bệnh nấm gây gặp nhiều khó khăn Để việc kiểm sốt dễ dàng chúng tơi nghiên cứu tính đa dạng di truyền chúng đến số kết luận sau: - Nấm C cassiicola lồi nấm có khả biến đổi sinh hóa cao Màu sắc khuẩn lạc, sinh khối thay đổi tùy theo điều kiện ngoại cảnh - Có thể áp dụng quy trình ly trích DNA tổng số nấm phổ biến giới để tiến hành ly trích DNA tổng số nấm C cassiicola - Tuy có khác biệt màu sắc hình dạng khuẩn lạc chúng tơi khơng tìm thấy khác biệt mặt di truyền phân tích kỹ thuật RFLP – PCR - Qua nghiên cứu xây dựng quy trình PCR tương đối xác áp dụng để phân tích PCR vùng ITS nấm - Dựa vào khác ký chủ nấm tiến hành phân tích đa dạng di truyền nấm kỹ thuật RFLP – PCR khơng tìm thấy khác biệt mặt di truyền Có thể kết luận tạm thời dịng nấm phân tích thuộc chủng 5.2 Đề nghị Nấm C cassiicola lồi nấm có phổ ký chủ rộng, triệu chứng bệnh biến thiên tạp Sau thu số kết nghiên cứu đưa số đề nghị sau: - Cần có nghiên cứu rộng hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa để đánh giá xác tình trạng nhiễm bệnh cao su Việt Nam - Nghiên cứu sâu sử dụng phương pháp khác RAPD, AFLP… để đánh giá xác mức độ khác biệt di truyền dòng nấm C cassiicoal Việt Nam - Tiếp tục nghiên cứu vùng ITS với primer khác để chẩn đốn nhanh bệnh nấm gây kỹ thuật PCR - Xây dựng quy trình tiến hành giải trình tự vùng ITS để đánh giá xác khác biệt gene nấm - Tiến hành nghiên cứu thêm độ tố nấm để đề biện pháp ngăn ngừa điều trị bệnh rụng Corynespora - Tiến hành nghiên cứu bệnh ký chủ khác vườn cao su để từ đánh giá xác khả truyền bệnh qua ký chủ trung gian TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử Nhà xuất nông nghiệp Bùi Trang Việt, 2002 Sinh học phân tử Giáo trình học tập, trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Đặng Văn Vinh 2000 Một trăm năm cao su Việt Nam Nhà xuất Nông Nghiệp TP HCM 11-38 Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Huỳnh Ngọc Phương, 2005 “Xác định gene gây độc tính đa dạng di truyền nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trùng” Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Thị Huệ, 1997 Cây cao su kiến thức tổng quát kỹ thuật nông nghiệp Nhà xuất trẻ Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất nông nghiệp Phan Thành Dũng, 2004 Kỹ thuật bảo vệ thực vật cao su Nhà xuất Nông Nghiệp.124 trang Phan Thành Dũng, 2006 Báo cáo công tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt Nam, thực trạng thách thức Báo cáo hội thảo “Bảo vệ thực vật cao su Việt Nam - hợp tác nghiên cứu đào tạo Đại học Nông Lâm Ngành cao su Việt Nam” 10 Tổng công ty cao su, 2004 Quy trình kỹ thuật cao su Nhà xuất nông nghiệp 11 Trần Thị Thủy Tiên, 2005 “Xác định trình tự vùng ITS - rDNA nấm Beauveria bassiana Vuille ký sinh trùng gây hại” Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam 12 Trần Văn Lợt Giáo trình cơng nghiệp Học phần Cây Cao Su Tài liệu học tập, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 2005 70 trang 13 Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005 “Phân tích đa dạng di truyền số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasiliensis Muell Arg.) phương pháp RFLP – PCR” Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Tài liệu tiếng nƣớc 14 A Safiah and A.H Noor Hisham Preliminary results: differentiating races of Corynespora cassiicola using molecular marker techniques 15 Edel,V., Steinberg,C., Goutheron, N and Alabouvette, C (1996) Differentiation of Fusarium species by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR amplified rinosomal DNA Frist International Fusarium Biocontrol Workshop Beltsville Agricultural Research center, USA, p.21 16 Jayashinge, C.K and W.P.K., Silva, 1996 Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, indonesia 16-17, dec, 1996 17 Liyanage, A de., Jayashinge, C cassiicolak and Liyanage, N.I.S (1988) Biology, epidemiology and pathogenicity of corynespora leaf fall disease workshop held at Bogor Research Instute, Indonesia 12th to 13th February, 1988 18 Moukhamedov, R., Hu, X., Nazar, R.N and Robb, J (1993) Use of polymerase chain reaction amplified ribosomal intergenic sequences for the diagnosis of Vertiocillium tricorpus Phytopathology 84, 256-259 19 Nazar, R.N., Hu, X, Schmidt J., Culham, D and Robb, J (1991) Potential use of PCR amplified ribosomal intergenic sequences in the detection and differentiation of Verticillium wilt pathogen Physiological and Molecular Plant Pathology 39, 111 20 P.D Bridge, D.K Arora, C.A Reddy and R.P Elander, 2000 Application of PCR in mycology University Press, Cambbridge 21 P.Romruensukharom, S Tragoonrung, A Vanavichit and T Toojinda Genetic variability of Corynespora cassiicola population in ThaiLand 22 R.T.V Fox Principles of diagnostic techniques in plant pathology International Mycological Institute (an Institute of CAB International) 23 Sabu, P.I., 2000 Current status of Corynespora leaf fall in India Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 24 Saflah Atan and Noor Hisham Hamid Dfferentiating Races of Corynespora cassiicola using RAPD and internal transcribed spacer markers 25 Sambrook and Russell, 2001 Molecular cloning A laboratory manual 26 Silva, Deverall and Lyon Molecular physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka 27 Silva, W.P.K, Deverall, B.J Lyon, B.R., 1995 RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus C cassiicola Aust J Bot., 43, 609 – 618 28 Silva, W.P.K, Eric H Karunanayake, Ravi L.C Wijesundera and Uhanowita M.S Priyanka., 2003 Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence Mycol Res 2003 May;107(Pt 5):567-71 29 W.P.K Silva, D.S Multani, B J Deverall and B.R Lyon RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus Corynespora cassiicola Tài liệu internet 30 http://images.google.com.vn/images?q=%22RFLP%22&svnum=10&hl=vi&lr=&st art=0&sa=N 31 http://medstat.med.utah.edu/block2/biochem/Formosa/Figures/Lecture6/610%20PCR%20Steps%20Overall.GIF 32 http://origin.sundayobserver.lk/2003/05/04/bus08.html&h=259&w=180&sz=38&t bnid=BKvmI1A3S8P6fM:&tbnh=107&tbnw=74&hl=vi&start=5&prev=/images% 3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2522origin%2522%26svnum%3D10%26h l%3Dvi%26lr%3D 33 http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/) 34 http://www.agronomy.ucdavis.edu 35 http://www.ansinet.org/detail_issue.php?V_No=108&j_id=pjbs# 36 http://www.biology.duke.edu 37 http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm&h=201&w=235&sz=3& tbnid=U9tYIYl2DUuMxM:&tbnh=88&tbnw=104&hl=vi&start=1&prev=/images %3Fq%3D%2B%2522ITS%2522%252B%2522fungi%2522%26imgc%3Dmono% 26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D 38 http://www.cirad.fr/presentation/programmes/biotrop/resultats/biositecirad/diversit y/rubbgeo.htm&h=473&w=643&sz=35&tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn w=135&hl=vi&start=33&prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2 522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s a%3DN 39 http://www.cirad.fr/presentation/programmes/biotrop/resultats/biositecirad/diversit y/rubbgeo.htm&h=473&w=643&sz=35&tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn w=135&hl=vi&start=33&prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2 522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s a%3DN 40 http://www.elsevier-deutschland.de/jplhp 41 http://www.hair-loss-stop.com/ref-pathogen-3/pathogen-research-abs5.2476.html 42 http://www.metabase.net/docs/earth/12703.html 43 http://www.mku.edu.tr/genel/fakulte/ziraat/bitkikoruma/bitkikoruma_dosyalar/pag e0006.htm 44 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=nucleotide&cmd=search&term =corynespora+cassiicola 45 http://www.protocol-online.org/tools/sms2/index.html 46 http://www.publish.csiro.au/paper/BT9950609.htm 47 http://www2.uni-jena.de/biologie/mikrobio/tipps/rapd.html 48 http://www-ang.kfunigraz.ac.at PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các dòng nấm Corynespora cassiicola phân lập từ mẫu bệnh Vƣờn tuyển non Lai Khê - Bến Cát, Bình Dƣơng STT Kí Hiệu DVT đƣợc mã hóa RRIV2 LH82/122 7/24 LH99/0019 26/20 LH9/0023 39/19 LH99/0028 19/86 LH9/0042 29/93 LH99/0053 4/48 LH99/0081 11/85 LH99/0083 20/85 LH9/0084 10 11/89 LH99/0090 11 28/37 LH99/0093 12 19/38 LH99/0098 13 4/19 LH99/0122 14 4/84 LH99/0131 15 29/10 LH99/0217 16 28/80 LH99/0266 17 25/75 LH99/0296 18 28/77 LH99/0309 19 32/86 LH99/0337 20 26/7 LH99/0347 21 26/11 LH99/0360 22 4/24 LH99/0365 23 1/24 LH99/0374 24 6/92 LH99/0383 25 41/69 LH99/0396 26 15/51 LH99/0396 27 22/84 LH99/0411 28 2/55 LH99/0412 29 2/41 LH99/0431 30 30/88 LH99/0431 31 29/79 LH99/0460 32 7/2 LH99/0489 33 14/1 LH99/0513 34 19/8 LH99/0581 35 21/55 LH99/0617 36 19/5 LH99/0622 37 15/61 LH99/0627 38 24/72 LH99/0638 39 15/13 LH99/0648 40 27/62 LH99/0670 41 5/8 LH99/0670 42 7/70 LH99/0679 43 17/8 LH99/0696 44 4/9 LH99/0698 45 20/6 LH99/0699 46 10/3 LH99/0775 47 15/32 LH99/0780 48 15/36 LH99/0818 49 16/29 LH99/0863 50 16/29 LH99/0863 51 35/17 TD95/5 52 19/82S LH99/0050 53 29/93S LH99/0053 54 28/81S LH99/0112 55 22/25S LH99/0216 56 29/22S LH99/0219 57 26/88S LH99/0347 58 20/70S LH99/0599 59 7/8S LH99/0636 60 22/70S LH99/0675 61 7/69S LH99/0679 62 10/11S LH99/0757 63 10/34S LH99/0778 64 16/28S LH99/0672 65 RRIV4 LH99/0657 Phụ lục 2: Cách pha số hóa chất A Pha lysis buffer Lysis buffer có thành phần cụ thể sau: Tris HCl 50 mM, EDTA 50 mM, SDS 3%, - mercaptoethanol 1% - Cho vào becher thể tích nước siêu gần với thể tích dung dich buffer mong muốn - Lần lượt cho thành phần khác: Tris HCl, EDTA SDS vào dung dịch với lượng cho đảm bảo nồng độ cuối mong muốn - Khuấ y cho hỗn hợp hòa tan, sau cho - mercaptoethanol vào - Khuấ y chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH = Nếu sau chuẩn độ thể tích cuối chưa đạt mong muốn cần thêm nước siêu vào cho đạt thể tích mong muốn B Pha Phenol - Hòa tan 100g phenol (tinh thể) đặt bồn ủ nhiệt 650C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol hòa tan) - Sau phenol tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch Tris bazơ 0,5 M, pH = - Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên cách cẩn thận Lưu ý thao tác nên thực tủ hood phải giữ phenol tối để tránh oxy hóa nguy hiểm đến sức khỏe - Tiếp tục cho vào 100ml dung dịch Tris HCl 0.5 M, pH - Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên - Lập lại chu kỳ lần Sau phủ lên dung dịch phenol thu lớp TE 1X (50ml) - Lưu ý phải bảo quản dung dịch phenol tối (dùng bình đựng có màu tối bịt kín bình giấy bạc) C Pha dung dịch TE 1X Thành phần gồm: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH8 Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8 Cho dung dịch Tris HCl EDTA vào nước tinh Khuấy chuẩn độ pH đến ... ***000*** PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP... Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, thực đề tài: ? ?Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasliensis Muell Arg) Lai Khê (Bến Cát... bệnh này, sử dụng phương pháp RFLP – PCR để phân tích tính đa dạng di truyền quần thể nấm C cassiicola Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương Nơi dung nghiên cứu: - Phân lập tách đơn bào tử dòng nấm
