Đang tải... (xem toàn văn)
Phân lập vi khuẩn bacillus subtilis từ đất và khảo sát tính đối kháng với vi khuẩn E.coli gây bênh tiêu chảy trên heo
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO SÁT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực : ĐẶNG NGỌC PHƢƠNG UYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TỪ ĐẤT VÀ KHẢO SÁT TÍNH ĐỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN E COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực TS NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẶNG NGỌC PHƢƠNG UYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn ba mẹ khuyến khích, động viên tạo điều kiện cho cho đƣợc học tập Cám ơn gia đình thân u ln chỗ dựa vững cho vững bƣớc qua khó khăn Em xin chân thành cảm ơn thầy TS Nguyễn Ngọc Hải tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, động viên, quan tâm hết lòng giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Xin cảm ơn TS Lê Anh Phụng BSTY Nguyễn Thị Kim Loan tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn tất khóa luận Cảm ơn anh chị, bạn thực tập phịng vi sinh ln động viên, khuyến khích nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian thực tập phịng Chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2007 Đặng Ngọc Phƣơng Uyên iii TĨM TẮT Đặng Ngọc Phƣơng Un, Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Đai học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất khảo sát khả đối kháng với vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy’’ Đề tài đƣợc tiến hành phịng Thí nghiệm vi sinh Khoa Chăn Ni Thú Y từ tháng đến tháng năm 2007 Giáo viên hƣớng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hải Với đối tƣợng nghiên cứƣ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc phân lập từ đất, tiến hành thử đối kháng với vi khuẩn E coli K88 Qua thí nghiệm đối kháng B subtilis E coli, ghi nhận đƣợc số kết sau: - Kết thí nghiệm đối kháng trực tiếp B subtilis E coli môi trƣờng thạch đĩa TSA cho thấy B subtilis đối kháng mạnh với E coli nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli 10-3 thời điểm sau 24 ủ 370C tủ ấm - Kết thí nghiệm thử đối kháng dịch ly tâm từ canh khuẩn B subtilis E coli thạch đĩa TSA cho thấy dịch ly tâm canh khuẩn B subtilis sau 24 nuôi cấy 370C có khả kháng E coli mạnh nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli 10-1 - Kết thí nghiệm đếm số lƣợng khuẩn lạc vi khuẩn B subtilis E coli phƣơng pháp trang đĩa cho thấy tỷ lệ mật độ tế bào ban đầu B subtilis/ E coli sau 24 nuôi cấy chung môi trƣờng TSB 107/ 107(tế bào/ml) B subtilis cho khả đối kháng cao - Thử nghiệm khả đối kháng B subtilis chủng L211với E coli đối tƣợng chuột bạch cho thấy chủng B subtilis L211 làm giảm tỷ lệ chuột chết nhiễm E coli O157:H7 (chủng EDL 933) đến 60% so với lô chuột không đƣợc sử dụng thức ăn có B subtilis iv ABSTRACT DANG NGOC PHUONG UYEN, Nong Lam University, Ho Chi Minh city, “Isolation Bacillus subtilis in soil and their antagonism with E coli’’ The thesis was carried out in Microbiology and Infectious diseases Department of Faculty of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Nong Lam University, Ho Chi Minh city from March to July, 2007 Supervisor: DR NGUYEN NGOC HAI experiments to test the antagonism of Bacillus subtilis strains with E coli was realized and the results showed: - Experiment 1: Antagonism directly between Bacillus subtilis and E coli in TSA plates Experiment result showed that: the inhibitory efficiency of Bacillus subtilis was highest at 10-3 dilution of E coli culture in 24 hour incubated at 370C - Experiment 2: Antagonism between centrifuged cell– free extract of Bacillus subtilis culture and E coli in TSA plates Experiment result showed that: the inhibitory efficiency of cell-free extract of Bacillus subtilis in 24 hour incubated at 370C was highest at E coli 24 hour culture dilution of 10-1 - Experiment 3: The number of Bacillus subtilis and E coli in co–culture fluid were estimated and the result showed that the growth of E coli was inhibited by B subtilis at an initial proportion of B subtilis / E coli was 107/107 in 24 hour incubated at 370C - Experiment 4: Experimental treatment infection of E coli O157:H7 strain EDL 933 with B subtilis L211 showed that this isolate could signficantly reduce mortality of mice caused by E coli O157:H7 strain EDL 933 (60%) v MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Abstract v Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình x Danh sách bảng xi Danh sách biểu đồ xi Chƣơng PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc E coli 2.1.1 Nhắc lại E coli: 2.1.2 Đặc điểm E coli 2.1.2.1 Tính chất vật lý, hóa học 2.1.2.2 Sức đề kháng 2.1.2.3 Cấu tạo kháng nguyên 2.1.2.4 Các chất E coli tổng hợp nên 2.1.2.5 Đặc tính gây bệnh 2.1.2.6 Các E coli gây bệnh 2.1.2.7 Khả gây bệnh 2.1.2.8 Cơ chế phòng vệ vật chủ E coli 10 2.1.2.9 Kiểm soát dich bệnh E coli 11 2.2 Sơ lƣợc B subtilis 11 2.2.1 Lịch sử phát 11 2.2.2 Tìm hiểu vi khuẩn Bacillus subtilis 12 2.2.2.1 Đặc điểm phân loại 12 2.2.2.2 Đặc điểm phân bố 12 2.2.2.3 Đặc điểm hình thái 12 2.2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 14 2.2.2.5 Khả tạo bào tử 14 2.2.2.6 Các chất kháng sinh B subtilis tổng hợp 15 2.2.2.7 Tính đối kháng Bacillus subtilis 16 2.2.2.8 Độc tính Bacillus subtilis 17 2.2.2.9 Một số phƣơng pháp nghiên cứu tính đối kháng Bacillus subtilis vi sinh vật gây bệnh 18 2.2.2.10 Một số nghiên cứu ứng dụng Bacillus subtilis 20 vi 2.2.3 Tình hình nghiên cứu tác dụng đối kháng với bệnh tiêu chảy E.coli Bacillus subtilis 21 Chƣơng 23 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 23 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 23 3.2 VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM 23 3.2.1 Đối tƣợng khảo sát 23 3.2.2 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 23 3.2.3 Môi trƣờng nuôi cấy 23 3.2.4 Hóa chất 24 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.4.1 Phân lập vi khuẩn B subtilis từ đất 24 3.4.1.1 Cách lấy mẫu 24 3.4.1.2 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis 25 3.4.1.2.1 Lựa chọn khuẩn lạc 26 3.4.1.2.2 Kiểm tra đặc điểm sinh hóa 26 3.4.2 Đánh giá khả đối kháng Bacillus subtilis E coli 26 3.4.2.1 Thí nghiệm 1: Thử đối kháng với E coli môi trƣờng thạch TSA 26 3.4.2.2 Thí nghiệm 2:Khảo sát tính đối kháng từ dịch ly tâm Bacillus subtilis dịch khuẩn E coli 27 3.4.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đối kháng B subtilis với nhiều nồng độ E coli khác môi trƣờng TSB 27 3.4.2.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm khả đối kháng chủng B subtilis E coli O157:H7 (chủng EDL 933) chuột bạch 27 3.4.3 CHỈ TIÊU THEO DÕI VÀ PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ 28 3.4.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu 29 Chƣơng 30 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết phân lập B subtilis đất 30 4.2 Kết đối kháng trực tiếp B subtilis E coli môi trƣờng TSA 32 4.3 Kết đối kháng dịch ly tâm canh khuẩn B subtilis nuôi cấy 24 giờ/370C với E coli môi trƣờng TSA 35 4.4 Kết đối kháng B subtilis E coli môi trƣờng TSB 38 4.5 Kết đối kháng chủng B subtilis L211 E coli O157:H7 (chủng EDL 933) chuột bạch 41 Chƣơng 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT E coli Escherichia coli B subtilis Bacillus subtilis E.P.E.C Enteropathogenic Escherichia coli E.I.E.C Enteroinvasive Escherichia coli E.H.E.C Enterohaemorrhagic Escherichia coli E.Agg.E.C Enteroaggregative Escherichia coli E.T.E.C Enterotoxingenic Escherichia coli LT Heat labile enterotoxin ST Heat stable enterotoxin TSA Trypticase Soya Agar TSB Trypticase Soya Broth viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn E coli độ phóng đại x1000 Hình 2.2 Cơ chế tác động độc tố vi khuẩn E coli Hình 2.3 Hình thái vi khuẩn B subtilis độ phóng đại x1000 13 Hình 3.1 Phân lập vi khuẩn B subtilis 25 Hình 4.1 Kết phân lập mơi trƣờng TSA 30 Hình 4.2 Hình thái vi khuẩn B subtilis độ phóng đại x1000 31 Hình 4.3 Hình thái bào tử vi khuẩn B subtilis độ phóng đại x1000 31 Hình 4.4 Kết thử số phản ứng sinh hóa khẳng định B subtilis 32 Hình 4.5 Vịng kháng khuẩn B subtilis E coli môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli 10-3 35 Hình 4.6 Vịng kháng khuẩn dịch ly tâm canh khuẩn B subtilis (chủng L211) E coli nồng độ pha loãng canh khuẩn E coli 10-1 38 Hình 4.7 Chuột chết nhiễm E coli O157:H7 (chủng EDL 933) 42 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các nhóm huyết yếu tố độc lực E coli Bảng 2.2 Các lớp E coli gây bệnh đƣờng ruột cho ngƣời động vật dƣỡng 10 Bảng 2.3 Các phản ứng sinh hóa B subtilis 14 Bảng 3.1 Thí nghiệm khảo sát tính đối kháng B subtilis E coli với nhiều nồng độ khác 28 Bảng 3.2 Thử nghiệm tác dụng đối kháng B subtilis E coli O157:H7 (chủng EDL 933) chuột bạch 29 Bảng 4.1 Kết đối kháng trực tiếp chủng B subtilis E coli môi trƣờng TSA 34 Bảng 4.2 Kết đối kháng dịch ly tâm canh khuẩn từ chủng B subtilis phân lập đƣợc với E coli môi trƣờng TSA 37 Bảng 4.3 Bảng số lƣợng vi khuẩn Bacillus subtilis E coli qua thời điểm 24 giờ, 36 40 Bảng 4.4 Số lƣợng tỷ lệ chuột chết lơ thí nghiệm đối kháng B subtilis L211 E coli O157: H7 (chủng EDL 933) 43 x PHỤ LỤC Thành phần môi trƣờng 1.1 Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Soya peptone 15g Tryptone peptone 5g NaCl 5g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g môi trƣờng TSB + 18g agar, hoà tan vào 1000ml nƣớc cất, đun sơi cho hồ tan Đem hấp tiệt trùng 121oC 20 phút 1.2 Môi trƣờng Trypticase Soya Broth (TSB) Soya pepton 15g Tryptone pepton 5g NaCl 5g Nƣớc cất 1000ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30g bột môi trƣờng TSB hồ tan vào 1000ml nƣớc cất, đun sơi cho hoà tan.Đem hấp khử trùng 121oC 20 phút 1.3 Môi trƣờng lên men đƣờng maltose Cao thịt 5g Pepton bột 10g Đƣờng maltose 10g Phenol red 0,01g Nƣớc cất 1000ml pH = 6,7 – 7,1 Hấp khử trùng 121oC 10 phút 1.4 Môi trƣờng Simmons Citrate Agar Sodium citrate 2g K2PO4 1g MgSO4 0,2g Brothynol blue 0,008g NaCl 5g NH4H2PO4 1g Agar 18g Nƣớc cất 1000ml pH 6,9 ± 0,2 1.5 Môi trƣờng khử nitrate Cao thịt 3g Pepton bột 5g NaNO3 1g Agar 7g Nƣớc cất 1000ml pH = 7,0 ± 0,2 1.6 Mơi trƣờng lịng đỏ trứng Cao thịt 1g Pepton bột 10g Manitol 10g NaCl 10g Phenol Red 0,0025g Agar 15g Nƣớc cất 1000ml pH = 7,2 ± 0,2 Phân 225ml môi trƣờng vào bình tam giác Khử trùng 1210C/15 – 20 phút Khi môi trƣờng nguội đến 500C thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà Trộn phân vào đĩa petri vơ trùng Cách pha dung dịch lịng đỏ trứng: rửa trứng, sát trùng bên trứng cồn Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lịng đỏ vào bacher có chứa 25 – 30ml nƣớc muối sinh lý vô trùng Bảo quản dung dịch 40C để dùng 1.7 Môi trƣờng Clark Lubs Pepton bột 7g Glucose 5g KH2PO4 5g Nƣớc cất 1000ml pH = 6,7 – 7,1 2.Hoá chất 2.1.Nƣớc muối sinh lý ‰ NaCl 9g Nƣớc cất 1000ml 2.2.HCl 1% HCl đđ 10ml Nƣớc cất 1000ml 2.3 NaOH 1% NaOH đđ 10ml Nƣớc cất 1000ml 2.4 NaOH 40% NaOH 40g Nƣớc cất 1000ml Cân 40g NaOH tinh thể hòa vào 50ml nƣớc cất, lắc đều, để yên sau 24 giờ, gan lấy nƣớc rooig bổ sung thêm nƣớc cất cho đủ 1000ml 3.Thuốc thử chất thị màu 3.1.Thuốc thử catalase Dung dịch 3% H2O2 (Hydogen peroxide) 3.2.Thuốc thử methyl red Methyl Red 0,1g Ethanol 95% 300ml Nƣớc cất (vừa đủ) 500ml Hòa tan đỏ methyl vào 300ml ethanol Thêm nƣớc cất vào cho đủ 500ml 3.3 Thuốc thử α-naphton 10% α-naphton 10g Cồn 960 vừa đủ 100ml 3.4 Thuốc thử xác định khả khử nitrate Giess A: Axit sunfanilis 0,5g Axit acetic 30ml Nƣớc cất 100ml Giess B: α-naphhthylamin 0,8g Axit acetic 30g Nƣớc cất 100ml Hòa tan 0,8g α-naphhthylamin 10ml nƣớc đun sôi để nguội bổ sung thêm 30ml axit acetic, đem lọc Đựng chai màu, bảo quản tủ lạnh để sử dụng 4.Thuốc nhuộm 4.1.Crystal violet a Crystal violet Cồn 96 b Phenol Nƣớc cất 0,4g 10ml 1g 100ml Trộn hai dung dịch a b lại với nhau, khuấy cho tan đem lọc Dung dịch thuốc nhuộm đƣợc bảo quản chai màu để tránh ánh sáng 4.2 Lugol KI 2g Iod tinh thể 1g Nƣớc cất 300ml Hoà 2g KI vào 5ml nƣớc , sau thêm 1g Iod,chờ cho Iod tan hết thêm nƣớc cất vừa đủ 300ml 4.3 Fuschine kiềm loãng a Fuschine kiềm Cồn 96o b Phenol Nƣớc cất 0,3g 10ml 5g 35ml Trộn dung dịch a với dung dịch b cho hoà tan Đem bảo quản chai màu 5.Thử phản ứng sinh hoá 5.1 Kiểm tra khả lên men đƣờng maltose Chuẩn bị Môi trƣờng đƣờng:maltose Giống vi khuẩn Bacilius subtili Ống nghiệm, ống durham Tiến hành Cho vào ống nghiệm ống durham, đem hấp khử trùng 121 oC 10 phút Sau cấy vi khuẩn vào mơi trƣờng mơi trƣờng, đem ủ 37 oC/24 Quan sát đổi màu, sinh Nếu vi khuẩn có khả lên men đƣờng đƣờng bị lên men rƣợu, rƣợu hố acid làm pH mơi trƣờng giảm làm chuyển màu môi trƣờng Kết Phản ứng (-): môi trƣờng có màu hồng đỏ Phản ứng (+): mơi trƣờng có màu vàng 5.2.Thử phản ứng catalase Chuẩn bị Dung dịch H2O2 30% Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng pipete lấy vi khuẩn phết lên lame kính khơ Sau nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn Đọc kết sau khoảng 15 giây Kết Phản ứng (-): khơng có tƣợng sủi bọt Phản ứng (+): Có tƣợng sủi bọt 5.3 Phản ứng lecithinase Chuẩn bị Môi trƣờng lòng đỏ trứng Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành: Dùng que cấy vịng, thao tác vơ trùng lấy cấy sinh khối vi khuẩn cấy lên đĩa mơi trƣờng lịng đỏ trứng, ủ đĩa 370C/24 Kết Phản ứng catalase dƣơng tính: có vịng xung quanh khuẩn lạc Phản ứng catalase âm tính: khơng có vịng xung quanh khuẩn lạc 5.4 Phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trƣờng Clark Lubs Alpha-naphtol 10%, NaOH 40% Tiến hành Dùng que cấy vịng lấy vi khuủân vào mơi trƣờng Clark Lubs, nuôi nhiệt độ 37oC 24 Sau nhỏ 3-5 giọt NaOH 40% 3-5 giọt alpha-naphtol 10% Sau 15 phút đọc kết Kết Phản ứng VP (-): Mơi trƣờng có màu vàng Phản ứng VP (+): Mơi trƣờng có màu đỏ 5.5 Phản ứng Methyl-Red Chuẩn bị Môi trƣờng Clark Lubs Thuốc thử Methyl-Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng que cấy vịng lấy vi khuẩn vào mơi trƣờng Clark Lubs, ni 37oC 24 Sau nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Methyl-Red vào canh khuẩn va đọc kết Kết Phản ứng (-): Môi trƣờng có màu vàng Phản ứng (+): Mơi trƣờng có mau đỏ 5.6.Phản ứng khử nitrate (NO3) Chuẩn bị Môi trƣờng nitrate Dung dịch thuốc thử giess A, giess B Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Tiến hành Dùng que cấy lấy vi khuẩn vào môi trƣờng thạch Nitrate bán lỏng, nuôi 37oC Sauu 24 giờ, nhỏ vào môi trƣờng 2-3 giọt Giess A, sau nhỏ tiếp 2-3 giọt Giess B Kết Phản ứng (-): Mơi trƣờng có màu vàng Phản ứng (+): Mơi trƣờng có màu đỏ 5.7.Khả sử dụng Citrate Chuẩn bị Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trƣờng Simmon citrate Tiến hành Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng citrate, nuôi 37oC 24 Kết Phản ứng (-): Mơi trƣờng có màu xanh mạ non Phản ứng (+): Mơi trƣờng có nàu xanh dƣơng 6.Phƣơng pháp nhuộm Gram Cố định tiêu Đặt giấy lọc lên vết bôi Nhuộm crystal violet – phút Rửa nƣớc Cố định Lugol phút Rửa nƣớc Tẩy cồn 90o 15 giây Rửa nƣớc Nhuộm fuschine kiềm loãng phút Rửa nƣớc Châm khơ, soi kính hiển vi Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị đĩa môi trƣờng TSA hấp tiệt trùng để khô mặt thạch Lấy ml dịch vi khuẩn cần đếm pha loãng nhiều nồng độ liên tiếp (theo phƣơng pháp pha loãng thập phân) dung dịch nƣớc muối sinh lí Cấy trang 0,1 ml dịch pha lỗng lên mơi trƣờng TSA (mỗi nồng độ trang đĩa), ủ 37oC 24 Đem đếm số lƣợng vi khuẩn Đếm số lƣợng bào tử phƣơng pháp đếm khuẩn lạc: Lấy dịch ni cấy vi khuẩn pha lỗng xử lí tế bào sinh dƣỡng cách đun 100 oC giờ, sau thực bƣớc nhƣ Tính kết *Số khuẩn lạc 1g mẫu hay ml dịch mẫu độ pha lỗng Cơng thức: X= A h V Trong đó: X: Số lƣợng vi khuẩn 1g mẫu hay ml dịch mẫu A: Số khuẩn lạc trung bình có đĩa (trong tổng số đĩa có nồng độ pha lỗng) h: Độ pha lỗng tứ (10-7, 10-8, 10-9, …) V: Thể tích dịch mẫu cấy lên đĩa *Số khuẩn lạc trung bình 1g mẫu hay ml dịch mẫu độ pha lỗng liên tiếp nhau: Cơng thức: Y= X1 X2 X3 Trong đó: Y: Số khuẩn lạc trung bình độ pha lỗng X1, X2, X3: Số khuẩn lạc trung bình có 1g mẫu hay ml dịch mẫu nồng độ pha loãng Kết xử lý thống kê 9.1 Thí nghiệm 1: Đối kháng khuẩn lạc B subtilis E coli môi trƣờng TSA Bảng ANOVA 9.1 : 24 H, 36 H, 48 H Analysis of Variance Source DF SS Factor 194.30 Error 321 1610.45 Total 323 1804.75 Level 24 H 36 H 48 H N 108 108 108 Pooled StDev = Mean 4.157 2.731 2.361 2.240 MS 97.15 5.02 StDev 2.357 2.228 2.129 F 19.36 P 0.000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ ( * ) ( * ) ( -* ) + -+ -+ -+ 2.40 3.20 4.00 4.80 Bảng ANOVA 9.2 : Chủng B subtilis versus nồng độ Analysis of Variance for C2 Source DF SS MS C1 37.76 12.59 Error 104 486.10 4.67 Total 107 523.86 Level 10^0 10^-1 10^-2 10^-3 N 27 27 27 27 Mean 2.494 2.642 3.210 4.000 Pooled StDev = F 2.69 P 0.050 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+-( -* -) ( -* ) ( -* -) ( -* -) + -+ -+ -+-2.0 3.0 4.0 5.0 StDev 1.873 2.132 2.443 2.162 2.162 Bảng ANOVA 9.3 : 24 H versus CHủng, Nồng độ Analysis of Variance for 24 H Source CHUNG NONGDO DF SS MS F P 232.57 29.07 8.44 0.000 3.01 0.034 31.06 10.35 Error 96 330.69 3.44 Total 107 594.32 Individual 95% CI CHUNG Mean L16 3.50 L211 6.33 L216 2.67 L219 3.08 L220 5.17 L25 6.75 L26 4.08 L29 2.83 L51 3.00 + -+ -+ -+( * ) ( * ) ( * ) ( -* ) ( * -) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) + -+ -+ -+3.00 4.50 6.00 7.50 Individual 95% CI NONGDO Mean -+ -+ -+ -+ 10^0 4.04 ( -* -) 10^-1 3.33 10^-2 4.70 10^-3 4.56 ( * -) ( -* -) ( -* -) -+ -+ -+ -+ -2.80 3.50 4.20 4.90 9.2 Thí nghiệm 2: Đối kháng dịch ly tâm từ B subtilis E coli môi trƣờng TSA Bảng ANOVA 9.4 : 24 H, 36 H, 48 H Analysis of Variance Source DF SS Factor 615.1 Error 240 5447.1 Total 242 6062.3 Level 24 H 36 H 48 H N 81 81 81 MS 307.6 22.7 Mean 6.926 3.926 3.272 Pooled StDev = F 13.55 P 0.000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ ( -* ) ( * -) ( -* ) -+ -+ -+ 3.2 4.8 6.4 StDev 7.443 2.301 2.720 4.764 Bảng ANOVA 9.5 : Chủng B subtilis versus Nồng độ Analysis of Variance for C2 Source DF SS C1 66.6 Error 78 1804.7 Total 80 1871.3 Level 10^0 10^-1 10^-2 N 27 27 27 F 1.44 P 0.243 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev StDev + -+ -+ -4.771 ( -* ) 5.461 ( -* ) 4.102 ( -* ) + -+ -+ -3.2 4.8 6.4 Mean 3.457 5.568 5.111 Pooled StDev = MS 33.3 23.1 4.810 Bảng ANOVA 9.6 : 24 H versus CHUNG, NONGDO Analysis of Variance for 24 H Source DF SS MS F P CHUNG 3894.00 486.75 83.74 0.000 NONGDO 130.67 65.33 11.24 0.000 Error 70 406.89 5.81 Total 80 4431.56 Individual 95% CI CHUNG Mean L16 2.44 L211 13.56 L219 2.11 L220 0.78 ( * ) 21.78 L216 + -+ -+ -+ - L25 2.67 L29 3.78 ( *-) ( *-) (-* ) 13.00 L26 (-* ) ( *-) (-* ) (-* ) L51 2.22 ( *-) + -+ -+ -+ 0.00 6.00 12.00 18.00 Individual 95% CI NONGDO Mean -+ -+ -+ -+ 10^0 5.37 ( -* ) 10^-1 8.48 10^-2 6.93 ( -* ) ( -* ) -+ -+ -+ -+ -4.80 6.00 7.20 8.40 9.3 Thí nghiệm 3: Đối kháng dịch chiết từ canh khuẩn B subtilis E coli môi trƣờng TSB Chủng L25-24 Bảng ANOVA 9.7 : Số lượng VK B subtilis E coli versus Nồng độ Analysis of Variance for SLG VK B Source DF SS MS F P NONG DO 11 727.37 66.12 15.79 0.000 Error 60 251.22 4.19 Total 71 978.59 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev E6B7-B 10.049 1.633 + -+ -+ -( -* -) E6B7-E 10.063 0.397 ( -* -) E6B8-B 10.471 0.876 E6B8-E 9.849 0.605 E7B7-B 12.690 0.966 E7B7-E 2.500 3.674 E7B8-B 12.535 0.872 E7B8-E 2.667 4.082 E8B7-B 11.013 0.806 E8B7-E 10.038 0.931 E8B8-B 10.453 0.863 E8B8-E 8.065 3.488 ( -* -) ( * -) ( -* -) ( -* -) ( -* ) ( * -) ( * -) ( -* -) ( -* -) ( -* -) + -+ -+ Pooled StDev = 2.046 4.0 8.0 12.0 Chủng L211-24 Bảng ANOVA 9.8 : SLG VK B subtilis va E coli versus NONG DO Analysis of Variance for SLG VK B Source DF SS MS F P NONG DO 11 271.29 24.66 21.30 0.000 Error 60 69.46 1.16 Total 71 340.75 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+ -+ -+ - E6B7-B 10.293 0.643 E6B7-E 9.294 0.954 E6B8-B 9.773 0.585 E6B8-E 10.563 1.048 E7B7-B 15.700 0.639 E7B7-E 14.130 2.675 E7B8-B 11.927 0.455 E7B8-E 13.145 0.534 E8B7-B 10.221 0.928 E8B7-E 9.897 0.763 ( -* ) E8B8-B 9.917 1.082 ( -* ) E8B8-E 10.249 0.677 ( * -) ( * -) ( * -) ( * -) ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( -* ) ( -* -) -+ -+ -+ - Pooled StDev = 1.076 10.0 12.5 15.0 Chủng L220- 24 Bảng ANOVA 9.9 : Số lượng VK B subtilis E coli versus NONG DO Analysis of Variance for SLG VK B Source DF SS MS NONG DO 11 308.65 28.06 Error 60 500.11 8.34 Total 71 808.76 Level E6B7-B E6B7-E E6B8-B E6B8-E E7B7-B E7B7-E E7B8-B E7B8-E E8B7-B E8B7-E E8B8-B E8B8-E N 6 6 6 6 6 6 Pooled StDev = Mean 8.588 9.679 7.693 9.175 12.583 9.157 5.746 11.466 8.724 11.599 5.463 9.622 2.887 StDev 1.153 0.929 0.694 0.576 0.618 6.428 5.209 0.949 3.845 0.533 3.473 0.389 F 3.37 P 0.001 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ -( * -) ( * -) ( * ) ( * ) ( * ) ( * ) ( -* ) ( * -) ( * ) ( * ) ( * -) ( -* ) + -+ -+ -+ -3.5 7.0 10.5 14.0 9.4 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm khả đối kháng chủng B subtilis E coli O157:H7 chủng EDL 933 chuột Chi-Square Test: Lô đối chứng, Lơ thí nghiệm Expected counts are printed below observed counts Chết Sống Total Chi-Sq = LÔ Đ/c 5.00 Lô TN 5.00 Total 10 5.00 5.00 10 10 10 20 1.800 + 1.800 + 1.800 + 1.800 = 7.200 DF = 1, P-Value = 0.007 10 Số lƣợng vi khuẩn B subtilis E coli đếm phƣơng pháp trang đĩa thí nghiệm CHỦNG THỜI GIAN CHỦNG KHUẨN VI SỐ LƯỢNG VI KHUẨN Ở CÁC TỶ LỆ NUÔI CẤY CHUNG (CFU/ml) E6B7 E7B7 12 36 H 24 H L25 36 H 1,16.10 5,31.10 B subtilis 3,75.10 1,03.10 B subtilis 2,32.10 3,98.10 B subtilis 1,22.10 E.coli L211 B subtilis E.coli 24 H 2,18.10 E.coli 36 H 3,9.10 E.coli L220 B subtilis E.coli 24 H E8B7 1,68.10 B subtilis 1,77.10 E.coli 5,31.10 E6B8 E7B8 10 6.10 13 7,72.10 2,14.10 10 9,48.10 10 1,63.10 4,30.10 6,87.10 11 2,09.10 10 1,67.10 2,11.10 2,14.10 10 9,9.10 11 7,23.10 2,84.10 1,03.10 1,19.10 4,14.10 1,45.10 2,81.10 10 3,82.10 6,79.10 E8B8 10 5.10 12 5,74.10 1,7.10 1,5.10 12 6,32.10 13 4,42.10 4,64.10 1,74.10 13 9,32.10 10 4,65.10 3,07.10 1,5.10 2,33.10 3,35.10 1,08.10 15 5,79.10 9,75.10 1,19.10 15 1,8.10 10 1,26.10 11 2,19.10 3,44.10 1,17.10 1,32.10 7,63.10 3,94.10 2,73.10 13 3,32.10 11 1,05.10 11 1,23.10 5,12.10 10 1,43.10 10 1,67.10 1,15.10 5,69.10 8,52.10 1,08.10 1,45.10 2,81.10 11 10 10 10 9 11 ... tài ? ?Phân lập vi khẩn Bacillus subtilis từ đất khảo sát tính đối kháng với vi khuẩn E coli gây bênh tiêu chảy heo? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH, U CẦU 1.2.1 Mục đích Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. .. Chí Minh “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất khảo sát khả đối kháng với vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy? ??’ Đề tài đƣợc tiến hành phịng Thí nghiệm vi sinh Khoa Chăn Ni Thú Y từ tháng... vi? ?n hƣớng dẫn: TS Nguyễn Ngọc Hải Với đối tƣợng nghiên cứƣ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đƣợc phân lập từ đất, tiến hành thử đối kháng với vi khuẩn E coli K88 Qua thí nghiệm đối kháng B subtilis
