BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UYỄ Ê ỨU M Ị SỐ Ặ ESCHERICHIA COLI ( Ừ BÒ, LỢ A Ợ LUẬ Á ỦY Í ỦA V K UẨ ĨM V E ) Â LẬ Ế MỔ Ế SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học hú y Mã số ih : 62 62 50 10 n n h học: S uyễn Bá S ỗ - 2012 iên ọc húy i L AM OA Tôi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội” cơng trình nghiên cứu riêng Những số liệu, kết nghiên cứu nêu luận án trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan giúp đỡ trình thực luận án cám ơn thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc ác iả luận án uyễn hị h nh hủy ii L ẢM Ơ Trong suốt trình thực đề tài hồn thành luận án, tơi ln nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp này, xin cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện Đào tạo Sau Đại học, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh - Truyền nhiễm, Cơ quan Thú y vùng I tạo điều kiện cho theo học chương trình đào tạo Nghiên cứu sinh trường Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo tập thể cán Chi cục Thú y Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tơi điều tra, lấy mẫu thực đề tài Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Bá Hiên - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội TS Đỗ Ngọc Thúy - Viện Thú y trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ q trình thực đề tài hồn thành luận án Tôi xin cảm ơn PGS.TS Cù Hữu Phú, ThS Lưu Thị Hải Yến tập thể cán Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Quốc gia giúp đỡ thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc Ban lãnh đạo tập thể cán Cơ quan Thú y vùng I, nơi công tác ủng hộ, giúp đỡ tơi q trình thực luận án Tơi xin đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bố mẹ, chồng hai trai bạn đồng nghiệp, bạn bè đồng hành, đóng góp cơng sức, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2012 ác iả luận án uyễn hị h nh hủy iii MỤ LỤ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng ix Danh mục hình xi MỞ ẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Những đóng góp luận án h ơn 1.1 Ổ QUA L U Vi khuẩn E coli 5 1.1.1 Phân loại E coli 1.1.2 Đặc tính vi khuẩn E coli 1.2 Verotoxigenic Escherichia coli (VTEC) 14 1.2.1 Danh pháp 14 1.2.2 Một số yếu tố độc lực vi khuẩn nhóm VTEC 15 1.2.3 Vai trị VTEC khơng thuộc nhóm O157 22 1.2.4 VTEC động vật 24 1.2.5 VTEC thực phẩm 28 1.2.6 Nhiễm VTEC người 29 1.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn E coli bệnh chúng gây Việt Nam 1.4 31 Phương pháp phát VTEC mẫu bệnh phẩm thực phẩm 32 iv 1.4.1 Phương pháp vi sinh vật 33 1.4.2 Phương pháp miễn dịch học 33 1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử 34 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng để phân loại vi sinh vật 1.5.1 40 Nguyên tắc 41 1.5.2 Kỹ thuật 1.5.3 h ơn Ứng dụng kỹ thuật phân tích PFGE DU Ê 2.1 42 , UYÊ L U V 44 Ơ Á ỨU Nội dung nghiên cứu 2.1.1 45 Thiết lập chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi khuẩn VTEC 2.1.3 45 Thực trạng công tác kiểm soát giết mổ, vệ sinh thú y địa bàn Hà Nội 2.1.2 45 45 Tỷ lệ nhiễm số đặc tính chủng VTEC phân lập 45 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 46 2.3 Đối tượng nghiên cứu 46 2.4 Ngun liệu nghiên cứu 46 2.4.1 Mơi trường, hóa chất, dụng cụ thí nghiệm 46 2.4.2 Các chủng vi khuẩn đối chứng dương âm 47 Phương pháp nghiên cứu 47 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu 47 2.5.2 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn canh khuẩn 2.5 nuôi cấy 48 2.5.3 Phương pháp tiến hành phản ứng PCR 48 2.5.4 Phương pháp xác định độ đặc hiệu phản ứng PCR 51 v 2.5.5 Phương pháp xác định độ nhạy phản ứng PCR 52 2.5.6 Phương pháp phân lập giám định vi khuẩn VTEC 52 2.5.7 Phương pháp xác định serotyp kháng nguyên O chủng vi khuẩn phân lập 2.5.8 54 Xác định đa dạng di truyền chủng VTEC có nguồn gốc khác phản ứng PFGE (Pulsed-field gel electrophoresis) 2.5.9 55 Xử lý số liệu 56 h ơn KẾ QUẢ V 3.1 ẢO LUẬ Thực trạng cơng tác kiểm sốt giết mổ, vệ sinh thú y địa bàn Hà Nội 3.1.1 3.1.2 60 Thực trạng vệ sinh khu giết mổ gia súc, gia cầm địa bàn Hà Nội 3.1.4 57 Kết điều tra điều kiện giết mổ phương tiện vận chuyển điểm giết mổ địa bàn Hà Nội 3.1.3 57 Thực trạng cơng tác kiểm sốt giết mổ điểm giết mổ gia súc, gia cầm địa bàn Hà Nội 64 Thực trạng điều kiện vệ sinh thú y sở kinh doanh, chợ, tiêu thụ sản phẩm thịt gia súc, gia cầm 3.2 57 69 Thiết lập chuẩn hóa phương pháp PCR dùng để xác định vi khuẩn VTEC 70 3.2.1 Lựa chọn PCR đơn mồi Multiplex - PCR 70 3.2.2 Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp để tách chiết DNA mẫu 73 3.2.3 Kết thực phản ứng PCR với chủng vi khuẩn E coli tham chiếu 3.2.4 75 Kết xác định độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR dùng để xác định VTEC môi trường nhân tạo 77 vi 3.2.5 Kết xác định độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp PCR dùng để xác định VTEC mẫu thịt 3.2.6 Quy trình xác định có mặt vi khuẩn VTEC mẫu thịt 3.3 83 85 Kết xác định tỷ lệ nhiễm VTEC bò, lợn điểm giết mổ chợ thuộc địa bàn Hà Nội 3.3.1 Thu thập mẫu 3.3.2 87 Phân lập giám định đặc tính sinh vật hóa học chủng 87 E coli 89 3.3.3 Kết phân lập VTEC thịt 93 3.3.4 Kết phân lập VTEC từ mẫu lau thân thịt mẫu phân lò mổ 3.3.5 96 Kết xác định loại độc tố chủng VTEC phân lập 98 3.3.6 Kết xác định serotyp O chủng VTEC phân lập 3.3.7 Kết phân tích quan hệ di truyền số chủng vi khuẩn VTEC phân lập có nguồn gốc khác KẾ LUẬ V Ề Ị 100 103 107 Kết luận 107 Đề nghị 108 Danh mục cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án 109 Tài liệu tham khảo 110 Phụ lục 125 vii DA MỤ Á ỮV Ế Ắ A/E Attaching and Effacing BHI Brain Heart Infusion bp base pair BPW Buffer Peptone Water Cs Cộng CT-SMAC Cefixime Tellurite Selective Supplement DNA Deoxyribonucleic Acid EaggEC Enteroaggregative E coli E coli Escherichia coli EHEC Enterohaemorrhagic E coli EIEC Entero invasive E coli EPEC Enteropathogenic E coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent asay ETEC Enterotoxigenic E coli FDA Food and Drug Administration HC Hemorrhagic colitis HUS Hemolytic uremic syndrome kDa Kilodalton LB Luria Bertani MR Methyl Red mDa Megadalton m-TSB modified Trypticase Soy Broth NB Nutrient Broth OMP Outer membrane protein PCR Polymerase chain reaction PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis viii SLT Shiga - like toxin TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TE Tris-EDTA buffer TTP Thrombotic thrombocytopenic purpure TSB Tryptic Soy Broth VK Vi khuẩn VP Voges-Proskauer VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic Escherichia coli WHO Tổ chức Y tế giới ix DAN MỤ Á BẢ Tên bảng STT Trang 1.1 Hoạt tính sinh học loại VT 19 1.2 Một số enzym cắt hạn chế dùng cho kỹ thuật PFGE 43 2.1 Trình tự mồi dùng để xác định gen VT1, VT2 eae 49 2.2 Thành phần chất phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1, VT2 eae 2.3 Các chu kỳ nhiệt phản ứng PCR dùng để xác định gen VT1, VT2 eae 2.4 50 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu chủng vi khuẩn E coli đối chứng dương 2.5 50 51 Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu chủng vi khuẩn đối chứng âm 51 3.1 Số lượng điểm giết mổ gia súc, gia cầm địa bàn Hà Nội 59 3.2 Kết điều tra điều kiện điểm giết mổ phương tiện vận chuyển điểm giết mổ địa bàn Hà Nội 3.3 Thực trạng vệ sinh điểm giết mổ gia súc, gia cầm thuộc địa bàn Hà Nội 3.4 73 Kết thực phản ứng Multiplex – PCR để phát chủng vi khuẩn E coli đối chứng dương 3.6b 72 Kết xác định mơi trường thích hợp ni cấy vi khuẩn E coli để chiết tách DNA cho phản ứng PCR 3.6a 68 Kết thử nghiệm phản ứng PCR đơn Multiplex - PCR để phát số gen độc lực VTEC 3.5 62 75 Kết thực phản ứng Multiplex – PCR với chủng vi khuẩn đối chứng âm 75 118 58 Matar G M., Abdo D., Khneisser I., Youssef M., Zouheiry H., Abdelnour G and Harakeh H S (2002), “The multiplex PCR based detection and genotyping of diarrhoeagenic Escherichia coli in diarrhoeal stools”, Ann Trop Med Parasitol, 96 (3), p 317 - 324 59 McMaster C., Roch E.A., Willshaw G.A., Doherty A., Kinnear W and Cheasty (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli serotyp O26:H11 outbreak in an Irish Creche”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 20(6), p 430 - 432 60 McPaeke S J W., Smyth J A and Ball H J (2005), “Characterisation of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) associated with colisepticaemia compared to faecal isolates from healthy birds”, Veterinary Microbiology, 110, p 245 – 253 61 Mechie S C., Chapman P A and Siddons C A (1997), “A fifteen month study of Escherichia coli O157:H7 in dairy herd”, Epidemiology and Infection, 118, p 17 – 25 62 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1996), “Polymerase chain reaction for detecting Escherichia coli O157:H7”, International Journal of Food Microbiology, 32, p 103 – 113 63 Meng J., Zhao S., Doyle M P., Mitchell S E and Kresovich S (1997), “A multiplex PCR for identifying Shiga-like toxin-producing Escherichia coli O157:H7”, Letters in Applied Microbiology, 24, p 172 – 176 64 Mohammad A Islam, Abdus S Mondol, Enne de Boer, Rijkelt R Beumer, Marcel H Zwietering, Kaisar A Talukder and Annet E Heuvelink (2008), “Prevalence and Genetic Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Isolates from Slaughtered 119 Animals in Bangladesh”, Applied and environmental microbiology, Vol 74, No 17, p 5414–5421 65 Montenegro M A., Bulte M., Trumpf T., Aleksic S., Reuter G., Bulling E and Helmuth R (1990), “Detection and characterization of fecal verotoxin-producing Escherichia coli from healthy cattle”, Journal of Clinical Microbiology, 28 (6), p 1417 – 1421 66 O’Brien A D and Samuel J E., Tesh V L., Burris J A., Owens J W., Gordon V M., Wadolkowski E A., (1993), “Comparison of the relative toxicities of Shiga-like toxins typ I and typ II for mice”, Infection and Immunity, 61, p 3392 – 3402 67 Orskov F., and Orskov I (1992), “Escherichia coli serotyping and disease in man and animal”, Can.J Micro., 38, pp.699-704 68 Osek J (2000), “Clonal analysis of Escherichia coli strains isolated from pigs with post-weaning diarrhea by pulsed-field gel electrophoresis”, FEMS Microbiol Lett., 186, pp.327-331 69 Paton A W., J C Paton, P N Goldwater, P A Manning (1993), “Direct detection of Escherichia coli Shiga-like toxin genes in primary fecal cultures using the polymerase chain reaction”, J Clin Microbiol, 31, p 3063 – 3067 70 Paton A W., Ratcliff R M., Doyle R M., Seymour-Murray J., Davos D., Lanser J A and Paton J C (1996), “Molecular microbiological investigation of an outbreak of hemolytic-uremic syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxinproducing Escherichia coli”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (7), p 1622 – 1627 71 Paton J C and A W Paton (1998), “Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections”, Clin Microbiol Rev., 11, p 450 – 479 120 72 Paton J C and A W Paton (2002), “Direct detection and characterization of Shiga toxigenic Escherichia coli by multiplex PCR for stx1, stx2, eae, ehxA and saa”, Journal of clinical microbiology, Vol 40, No 1, p 271 – 274 73 P Alexa, L Konstantinova, Z Sramkova-Zajacova (2011), “Faecal shedding of verotoxigenic Escherichia coli in cattle in the Czech Republic”, Veterinarni Medicina, 56 (4), p 149 – 155 74 Peiris J.S.M., P.H.M Leung, W.C Yam and W.W.S Ng (2001), “The prevalence and characterization of verotoxin-producing Escherichia coli isolated from cattle and pigs in an abattoir in Hong Kong”, Epidemiol Infect., 126, p 173 – 179 75 Pourbakhsh S., Dho-Moulin M., Bree A., Desautels C., Martineau-Doize B and Fairbrother J M (1997), “Localization of the in vivo expression of P and F1 fimbriae in chickens experimentally inoculated with pathogenic Escherichia coli”, Microbiol Pathog., 22, p 331 – 341 76 Pryor W., Hodson E., McIntyre P and Bettelheim K A (1990), “Toxigenic Escherichia coli in haemolytic ureamic syndrome” , The Medical Journal of Australia, 152, p 221 – 222 77 Rasmussen M A., Cray W C Jr., Casey T A and Whipp S C (1993), “Rumen contents as a reservoir of enterohemorrhagic Escherichia coli”, FEMS Microbiology Letters, 114, p 79 – 84 78 Saiki R K., Gelfand D H., Stoffel S., Scharf S J., Higuchi R., Horn G T., Mullis K B and Erlich H A (1987), “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”, Science, 239, p 487 – 491 79 Samadpour M., Onerth J E., Liston J., Tran N Nguyen D., Whittam T S., Wilson R A and Tarr P I (1994), “Occurrence of Shiga-like 121 toxin producing Escherichia coli in retail fresh seafood, beef, lamb, pork and poultry from grocery stores in Seattle, Washington”, Applied and Environmental Microbiology, 60 (3), p 1038 – 1040 80 Sambrook J., and Russell D.W (editor) (2001), “Chapter 5: Gel electrophoresis of DNA and Pulsed –field agarose gel electrophoresis”, In: Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 5.55-5.90 81 Sandhu K S., Clarke R C., McFadden K., Brouwer A., Louie M., Wilson J., Lior H and Gyles C L (1996), “Prevalence of the eaeA gene in verotoxigenic Escherichia coli strains from dairy cattle in Southwest Ontario”, Epidemiology and Infection, 116, p -7 82 Schmidt H., Rusmann H., Schwarzkoft A., Aleksic S., Heesemann J and Karch H (1994), “Prevalence of attaching and effacing Escherichia coli in stool samples from patients and controls”, Zentrablatt fur Bakteriologie, 281 (2), p 201 – 213 83 Schmidt H., Beutin L and Karch H (1995), “Molecular analysis of the plasmid-encoded hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933”, Infection and Immunity, 63 (3), p 1055 – 1061 84 Stein P E, Boodhoo A., Tyrrell G J., Brunton J L and Read R J (1992), “cvCrystal structure of the cell-binding B oligomer of verotoxin-1 from E coli”, Nature (London), 355, p 748 – 750 85 Xiaodong Xia, Jianghong Meng, Patrick F McDermott, Sherry Ayers, Karen Blickenstaff, Thu-Thuy Tran, Jason Abbott, Jie Zheng, and Shaohua Zhao (2010) Presence and Characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli and Other Potentially Diarrheagenic E coli Strains in Retail Meats Applied and environmental microbiology, 76, p 1709-1717 122 86 Takeda Y (1995), “Shiga and Shiga-like (Vero) toxins”, Bacterial toxins and virulence factors in disease (Edited by: Moss J., Iglewski B., Vaughan M and Tu A T ), Marcel Dekker Inc., p 313 – 326 87 Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., Mickelsen P.A., Murray B.E., Persing D.H., and Swaminathan B (1995), “Intrepreting chromosomal DNA restriction paterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing”, J.Clin Microbiol., 33, pp.2233-2239 88 Thomas A., Cheasty T., Frost J A., Chart H., Smith H R and Rowe B (1996), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli, particularly serogroup O157, associated with human infections in England and Wales: 1992 – 4”, Epidemiology and Infection, 117, p – 10 89 Thi Thu Thao Van, George Moutafis, Peter J Coloe (2007), “Antibiotic resistance in food-borne bacterial contaminants in Vietnam” Applied Environmental Microbiology, 73:7906-11 90 Tozzi A E., Niccolini A., Caprioli A., Luzzi I., Montini G., Zacchello G., Gianviti A., Principato F and Rizzoni G (1994), “A community outbreak of haemolytic-uraemic syndrome in children occurring in a large area of Northern Italy over a period of several months”, Epidemiology and Infection, 113, p 209 – 219 91 Vu Khac Hung (2004), “Escherichia coli – prevalence and comparison of virulence factors in strains isolated from pigs with diarrhea in Slovak Republic”, The degree of Doctor, Slovak Republic 92 Xu Jian-Guo, Cheng Bo-Kun and Jing Hual-Qi (1999), “Escherichia coli O157:H7 and Shiga like-toxin-producing Escherichia coli in China”, World Journal of Gastroenterology, ISSN 1007-9327 93 Yu J and Kapper J B (1992), “Cloning and characterization of the eae gene of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7”, Molecular biology, (3), p 411 – 417 123 94 Zhao T., Doyle M P., Shere J and Garber L (1995), “Prevalence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in a survey of a dairy herds”, Applied and Environmental Microbiology, 61 (4), p 1290 – 1293 95 Wachsmuth (1994), “Summary: public health, epidemiology, food safety, laboratory diagnosis”, Recent advances in Verocytotoxinproducing Escherichia coli infection, Karmali M A and Goglio A G (eds.), Elsevier, Amsterdam, p -6 96 Waters J R., Sharp J C M and Dev V J (1994), “Infection caused by Escherichia coli O157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland: a five year review, 1987 – 1991”, Clinical Infectious Disease, 19, p 834 – 843 97 Wieler L H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind R., Byomi A and Baljer G (1996), “Shiga toxinproducing Escherichia coli strains from bovines association of adhesion with carriage of eae and other genes”, Journal of Clinical Microbiology, 34 (12), p 2980 – 2984 98 Willshaw G A., Smith H R., Roberts D., Thirlwell J., Cheasty T and Rowe B (1993), “Examination of raw beef products for the presence of verocytotoxin producing Escherichia coli, particularly those of serogroup O157”, Journal of Applied Bacteriology, 75, p 420 – 426 99 Willshaw G.A., Cheasty T., Smith H.R., O'Brien S.J and Adak G.K (2001), “Verocytotoxin-producing Escherichia coli (VTEC) O157 and other VTEC from human infections in England and Wales: 1995-1998”, J Med Microbiol, 50 (2), p 135 – 142 100 Winkle S M., Refai M and Rhode R (1972), “On the antigenic relationship of Vibrio cholera to Enterobacteriaceae”, Annales de L’institut Pastuer, 123, p 775 – 781 124 TRANG WEB 101 Phương Thuận (2011), “Hơn 6000 người bị ngộ độc thực phẩm năm”, ttp://giadinh.net.vn/2011032509425334p1044c1045/hon-6000 nguoi-bi-ngo-doc-thuc-pham-moi-nam.htm 125 Ụ LỤ Phụ lục Môi tr n , hó chất phân lập, iám định vi huẩn E coli (nhóm V E ) thực phản ứn Mơi tr hác n , hó chất phân lập, iám định vi huẩn E coli  Môi tr n M c n ey (Oxoid - England): Hịa tan 52g mơi trường lít nước cất vơ trùng, hấp 1210C 15 phút, sau để nguội 500C đổ đĩa Petri  Môi tr n thạch máu (Blood agar base) hãng Sanofi - France: Hòa tan 40g lít nước cất, hấp tiệt trùng 1210C 15 phút, để nguội đến 45-500C Bổ sung thêm 5% máu thỏ máu cừu tách sợi huyết lắc đều, pH =7,4±0,2  Môi tr n utrient br th (Merck – Germany): Hòa tan 8g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2, 250C  Môi tr n m SB (Merck – Germany): Hịa tan 33g lít nước cất, hấp vô trùng 1210C 15 phút, pH =7,3±0,2, đổ ống farcol lấy mẫu  Môi tr n B W (Oxoid - England): ): Hòa tan 20g lít nước cất, hấp vơ trùng 1210C 15 phút, pH =7,3±0,2  Môi tr n EMB A r (Merck – Germany): Hịa tan 36g lít nước cất, hấp vô trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2  Môi tr n S M (Eiken – Japan): Hịa tan 39g lít nước cất, chia ống nút vặn khoảng 3-5ml/ống, hấp vô trùng 1210C 15 phút, pH =7,4±0,2  Môi tr n -SMAC (Cefixime Tellurite Selective Supplement) hãng Oxoid – England: lọ cho 2ml nước cất vô trùng vào lắc đến tan hết, bổ sung vào 500ml môi trường SMAC (Sorbitol MacConkey Agar) vô trùng, lắc đều, đổ đĩa petri 126  Môi tr n đ n l ại: Pha dung dịch đường loại 20%, hấp cách quãng 1000C vòng 30 phút/ ngày, hấp ngày ó chất ùn tr n phản ứn , Multiplex-PCR  Mồi l ại: hãng Fermentas cung cấp Mồi hoàn nguyên đệm TE (Invitrogen, USA)  AMP x bufer, dNTP stock, 50 x TAE, Taq-DNA polymerase, Gel loading bufer hãng Fermentas cung cấp  Ethidium bromide 10mg/ml: Invitrogen, USA cung cấp  Dun ịch điện di TBE 10X (Tris – Borate – EDTA): Hòa tan 108g Tris- Base (Merck), 55g axit Boric (Sigma) 5,84g EDTA (Fluka) lít nước cất, lắc cho tan hết Khi sử dụng, pha loãng 10 lần với nước cất  hạch r se 0,8-2% : Cân xác lượng agarose (US-Bio) cần sử dụng cho vào bình tam giác, bổ sung đệm TBE vừa đủ để đạt nồng độ theo yêu cầu Làm tan chảy tồn thạch lị vi sóng Khi thạch nguội đến 500C, bổ sung ethidium bromide (0,5µl ethidium bromide /10ml thạch agarose), lắc đổ khuôn chuẩn bị trước, gắn lược Để thạch đông tự nhiên khoảng 15 - 30 phút Gỡ bỏ lược, đặt thạch vào bể điện di, bổ sung đệm TBE ngập mặt thạch tiến hành bơm mẫu để điện di sản phẩm PCR ó chất ùn tr n phản ứn  Dun F E ịch rử (Wash buffer): Hòa 40ml NaCl 5M, 10ml Tris-HCl 1M (pH 7,2), 200ml EDTA 0,5M (pH 8,0) 750 ml nước cất Lắc hấp 1210C 15 phút  Dun ịch phá vỡ tế bà vi huẩn (bacterial cell lysis solution) Hòa tan 0,5ml Tris-HCl 1M (pH 7,5), 0,5ml NaCl 5M, 10ml EDTA 0,5M (pH 8,0), 100mg sodium deoxycholate, 250 mg N-lauroylsarcosine/sodium salt với 39ml nước cất Lắc cho tan hết vô trùng cách lọc qua giấy lọc 127 0,22µm Sau đó, bổ sung 50mg lysozyme, lắc cho tan đều, bảo quản 40C  Dun ịch pr tein se K (Bacterial cell protenase K solution) Hòa tan 0,5g N-lauroylsarcosine/sodium salt 50ml EDTA 0,5M (pH 8,0) Lắc nhẹ làm ấm dung dịch tan hết, vô trùng dung dịch cách lọc qua giấy lọc 0,22µm Sau đó, bổ sung 1,25 ml proteinase K (nồng độ 20mg/ml), lắc cho tan đều, bảo quản 40C  Dun ịch đệm E (Tris –EDTA buffer) Hòa tan 5ml Tris-HCl 1M ml EDTA 0,5M (pH 8,0) 495 ml nước cất  Dun ịch MSF 1mM Hòa tan 17,4 mg PMSF 100ml nước cất Lắc hấp 121 0C 15 phút  Dun ịch BSA/spermi ine restricti n enzyme Trộn 100µl Restriction enzyme buffer 10X (promega), 10µl acetylated BSA (10mg/ml), 20µl spermidine trihydrochloride (100mM) với 0,87 ml nước cất Dung dịch chuẩn bị trước tiến hành phản ứng 128 Phụ lục Một số hình ảnh lấy m u sở iết mổ Minh iền, run Văn 129 Phụ lục Một số hình ảnh thực trạn h ạt độn iết mổ số sở iết mổ nhỏ lẻ lôn bẩn h lọc thân thịt bẩn ách lòn thân thịt bẩn ách lòn thân thịt bẩn Làm lịn cạnh thân thịt Khơn có hu làm lịn riên biệt 130 ình thức vận chuyển phổ biến Vận chuyển thân thịt bằn xe máy hôn che đậy Phụ lục Một số hình ảnh mu bán thịt chợ ằn s u quầy bán thịt chợ hạch Bàn 131 Phụ lục 5: Một số hình ảnh tr n phịn thí n hiệm 132 ... cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội ” Mục tiêu củ đề tài - Xác định đặc tính vi khuẩn E coli nhóm VTEC phân lập từ bò, lợn điểm giết mổ -... xin cam đoan: Luận án ? ?Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Escherichia coli (nhóm VTEC) phân lập từ bị, lợn giết mổ Hà Nội? ?? cơng trình nghiên cứu riêng Những số liệu, kết nghiên cứu nêu luận án trung... bàn Hà Nội 89 3.12 Kết phân lập chủng E coli từ mẫu ban đầu 90 3.13 Kết kiểm tra đặc tính vi khuẩn E coli phân lập 91 3.14 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ mẫu thịt 93 3.15 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn