TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT F 7 G GIÁO TRÌNH VI SINH HỌC ỨNG DỤNG Giảng cho SV năm thứ ba - Ngành Sinh Học (SH 235 – 30 tiết) ThS. BẠCH PHƯƠNG LAN 2004 Vi sinh học ứng dụng - 1 - MỤC LỤC MỤC LỤC .- 1 - Lời tác giả - 3 - CHƯƠNG 1. SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN VÀ SINH KHỐI VI TẢO .- 4 - I. GIÁ TRỊ DINH DƯỢNG CỦA NẤM MEN .- 4 - II - NHÂN GIỐNG VÀ GIỮ GIỐNG NẤM MEN - 6 - III- KHẢO SÁT CÁC CHỈ TIÊU SINH HỌC CẦN THIẾT .- 8 - 1. Hoạt tính nhân lên: Thể hiện qua mức tăng sinh khối tổng cộng, được đánh giá qua 3 chỉ tiêu: - 8 - 2. Hoạt tính lên men: (bằng phương pháp Durgham) .- 8 - 3. Đònh lượng đạm Amin trong dòch nuôi cấy bằng phương pháp Formol - 10 - 4.Xác đònh hiệu quả của các tác nhân kich thích QT tự phân - 11 - IV- ỨNG DỤNG CƠ CHẾ TỰ PHÂN ĐỂ SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN DƯỚI DẠNG BỘT DINH DƯỢNG VÀ CỐM BỔ .- 14 - 1. Cơ sở lý thuyết .- 14 - 2. Quy trình công nghệ .- 16 - V - SẢN XUẤT SINH KHỐI VI TẢO - 19 - 1. Đặc điểm chung .- 19 - 2.Nuôi trồng Lục Tảo đơn bào (Chlorella) - 20 - 3. Nuôi trồng Tảo xoắn đa bào (Spirulina) - 20 - Chương 2. ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN THỰC PHẨM - 22 - I. Ô NHIỄM THỰC PHẨM VÀ HẬU QUẢ . - 22 - 1.Khái niệm chung .- 22 - 2. Tác nhân gây ô nhiễm thực phẩm: - 23 - 3 - Những bệnh nhiễm khuẩn do ăn thức ăn bò nhiễm khuẩn - 24 - 4.Cơ chế sinh hoá của quá trình gây hư hỏng thực phẩm - 26 - II. CÁC PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN THỰC PHẨM .- 27 - 1- Nguyên tắc Bioza (Bios = sự sống) - 28 - 2 - Nguyên tắc Abioza. (Abiosis = không sống) - 28 - 3. Nguyên tắc Anabioza (= giảm sự sống) - 30 - III. SỬ DỤNG NHÓM NẤM MỐC TRONG BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN THỰC PHẨM - 33 - 1. Cơ sở sinh học của việc sử dụng nấm mốc trong chế biến - 33 - và bảo quản thực phẩm. . - 33 - 2 Sản xuất nước chấm lên men từ khô dầu lạc - 34 - 3. Sản xuất chao từ đậu phụ .- 39 - ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 2 - IV. KIỂM NGHIỆM THỰC PHẨM - 41 - 1.Nhóm chỉ tiêu cảm quan .- 41 - 2.Nhóm chỉ tiêu hoá lý - 41 - 3.Nhóm chỉ tiêu Vi Sinh - 41 - 4- Ý nghóa của các chỉ tiêu vi sinh . - 41 - Chương 3. CÔNG NGHỆ LÊN MEN - 44 - I. . LÊN MEN ETILIC VÀ ỨNG DỤNG. .- 45 - 1. Cơ chế lý thuyết của quá trình lên men Etilic . - 45 - 2 - Phân biệt các dạng sản phẩm lên men rượu . - 46 - 3 – Quy trình sản xuất bia đại mạch - 46 - 4 - Quy trình sản xuất vang nho .- 48 - II . LÊN MEN LACTIC VÀ ỨNG DỤNG. . - 49 - 1. Cơ chế lý thuyết của quá trình lên men Lactic - 49 - 2.Một số công thức chế biến và bảo quản thòt, sữa, tôm bằng lên men Lactic. - 53 - III. LÊN MEN ACETIC VÀ ỨNG DỤNG .- 58 - 1. Cơ chế lý thuyết .- 58 - 2. Sản xuất dấm ăn: .- 60 - 3. Sản xuất thạch dừa (Nata de coco) .- 61 - Chương 4. CÔNG NGHÊÏ VI SINH TRONG XỬ LÝ CÁC CHẤT THẢI .- 62 - I. Xử lý nước - 62 - 1. Khái niệm, phân loại, thành phần hoá học của nước thải .- 62 - 2 . Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước thải - 62 - 3. Xử lý nước thải bằng công nghệ vi sinh (CNVS) - 63 - II- Xử lý rác .- 69 - 1- Phân loại rác thải .- 69 - 2 – Phân huỷ các hợp chất hữu cơ cao phân tử - 70 - III . XỬ LÝ MỘT SỐ CHẤT THẢI CÔNG NGHIỆP NHỜ VSV .- 73 - 1. Xử lý phế thải của CN chế biến sữa .- 73 - 2.- Xử lý phế thải của CNSX các chất tẩy rửa .- 75 - ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 3 - LỜI TÁC GIẢ Vi Sinh Vật Học ng Dụng là một trong 5 môn học thuộc hệ thống các giáo trình của chuyên ngành Ví Sinh Vật Học, tính theo trình tự thời gian mà sinh viên ngành Sinh Học Thực Nghiệm sẽ được học là: 1. Vi sinh vật học đại cương (năm thứ Hai) 2. Vi sinh vật học ứng dụng (năm thứ ba ) 3. Vi sinh y học và miễn dòch học (năm thứ tư ) 4. Công nghệ vi sinh (năm thứ tư - tự chọn) 5. Hoạt tính vi sinh vật đất (năm thứ tư - tự chọn) Vì thế, trong giáo trình này sẽ không nhắc đến những kiến thức đã hoặc sẽ được đề cập trong các giáo trình khác, trừ trường hợp thật cần thiết. Điều kiện tiên quyết là trước khi học giáo trình này sinh viên đã được trang bò những kiến thức cơ bản về Hoá Sinh, Di Truyền, Sinh Lý Thực Vật Và Vi Sinh Vật. Mục tiêu của môn học là giúp sinh viên tiếp cận với nhiều hướng ứng dụng khác nhau của Vi Sinh Học trong đời sống, đồng thời tạo cho sinh viên có thói quen liên hệ giữa lý thuyết với thực hành – bíêt dùng những kiến thức đã học để lý giải các hiện tượng diễn ra trong thực tiễn. Trong quá trình giảng dạy, ngoài việc truyền thụ kiến thức, giảng viên sẽ dành một tỷ lệ thời gian thích hợp để rèn luyện cho sinh viên một số kỹ năng liên quan đến môn học và đến nghề nghiệp mai sau – ví dụ : - Kỹ năng thu thập và xử lý tài liệu tham khảo để chắt lọc những thông tin cốt lõi - Kỹ năng xử lý và nhận xét những số liệu thu được qua khảo sát - thực nghiệm - Kỹ năng soạn thảo và thuyết trình theo chủ đề (ceminar) v.v… Về phía người học cũng cần phải hợp tác chặt chẽ với người dậy, chủ động tham gia vào những hoạt động trên lớp để có được những giờ học tích cực và bổ ích. Có thể xem những hoạt động trên lớp là cơ hội để sinh viên trau dồi khả năng tự học, tự nghiên cứu, chuẩn bò tốt cho việc vào đời trong tương lai. Tác giả xin chân thành cám ơn rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các bạn đồng nghiệp và những ai quan tâm. Th.s Bạch Phương Lan ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 4 - CHƯƠNG 1. SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN VÀ SINH KHỐI VI TẢO I. GIÁ TRỊ DINH DƯỢNG CỦA NẤM MEN Có thể nói không một loại động vật hay thực vật nào lại chứa trong tế bào một lượng các chất có giá trò dinh dưỡng phong phú như trong tế bào nấm men. Người ta có thể tìm thấy trong sinh khối nấm men tất cả các thành phần cần thiết cho sự sống của con người và động vật bậc cao. Bởi vậy các loại sản phẩm dinh dưỡng điều chế từ sinh khối nấm men được xem như “một thực đơn lý tưởng” Nhiều dẫn liệu về tỷ lệ thành phần trong nấm men cho biết như sau - Protein và các hợp chất chứa Nitơ: 40 -60% - Gluxit 30 -35% - Lipit 1 - 2% - Các chất khác 6 - 7% Trong thành phần Protein của nấm men có chứa đầy đủ 20 loại axit amin thông thường, bao gồm cả 9 loại axit amin không thay thế, chúng được phân bố với một tỷ lệ khá cân đối . Ví dụ: (Tính theo trọng lượng khô). - Lizin 4,4 - 5,7 % - Methionin 1,2 - 1,8 % - Sistein 1,2 - 1,8 % - Treonin 2,8 - 3,6 % - Tryptophan 0,57 - 0,7 %. So sánh với các loại bột mì và bột gạo thì tỷ lệ này cao hơn khoảng từ 3 - 10 lần Hàm lượng vitamin trong tế bào nấm men cũng rất phong phú, đặc biệt là vitamin nhóm B. So với các loại đậu tương, đậu nành và đậu Hà lan thì trong tế bào ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 5 - nấm men thì tỷ lệ vitamin B 3 cao hơn 5 - 10 lần, tỷ lệ vitamin B 4 cao hơn 4 - 6 lần, tỷ lệ vitamin B 2 cao hơn 20 - 75 lần. Seelay (1981) đã đưa ra những dẫn liệu về hàm lượng vitamin trong nấm men bia (loài Saccharomyces cerevisiae) như sau: - Thiamin (B1) 156,0 mg/Kg trọng lượng khô. - Riboflavin (B2) 100,0 ------- - Axit Pantotenic (B3) 100,0 ---- --- - Axit Cholic (B4) 710,0 ------- - Piridoxin (B6) 020,0 ------- - Niaxin (PP) 022,0 ------- - Axit Folic 013,0 ------- - Inoziton 500,0 ------- Ngoài ra còn có Esgosterin, một tiền chất của vitamin D2. Điều đáng chú ý là trong tế bào nấm men có chứa một hệ enzim nội bào và ngoại bào khá đầy đủ, bao gồm các loại quan trọng như: Protease, Pectinase, Amilase, Glucoamilase, Mantase, Lactase . Chính sự có mặt của các enzim này đã quyết đònh các đặc điểm sinh học đặc trưng của nấm men - trong đó có một cơ chế sẽ được đề cập đến ở phần sau, đó là “hiện tượng tự phân của tế bào nấm men”. Nấm men có tốc độ sinh trưởng và phát triển mạnh, thời gian thế hệ trung bình là từ 30 - 60 phút. Do vậy, việc nhân giống để dùng trong sản xuất rất dễ dàng thuận lợi . Trong công nghệ vi sinh, người ta thường sử dụng nấm men theo 3 mục đích chủ yếu: 1. Thu nhận sinh khối tổng cộng (sản xuất cốm bổ, bột dinh dưỡng, proteinthô…) 2. Thu nhận các sản phẩm lên men ( rượu trắng, rượu vang, bia, dòch trái cây lên men . ) 3. Thu nhận các sản phẩm sinh tổng hợp đặc trưng ( Axit amin, vitamin ) Dưới đây chúng ta sẽ tìm hiểu sâu hơn về công nghệ thu nhận sinh khối tổng cộng. ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 6 - II - NHÂN GIỐNG VÀ GIỮ GIỐNG NẤM MEN Theo phương pháp cổ điển, tế bào nấm men dùng làm gốc giống được giữ dưới các dạng sau: - Ống giống thạch nghiêng. - Giống đông khô dạng bột. - Giống men dạng bột quánh (dạng past) Từ các giống gốc như trên, trước khi đưa vào sản xuất cần tiến hành “hoàn nguyên “tế bào, tức là cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng dạng dòch thể với thành phần dinh dưỡng tối ưu để đưa chúng trở lại dạng hoạt động, phục hồi hoạt tính giống, sau đó từ giống đã hoàn nguyên người ta tiến hành nhân giống các cấp I, II, hoặc III (tuỳ mức độ cần thiết về số lượng) để có giống sản xuất . Bằng các phương pháp trên, quần thể giống đưa vào sản xuất có dạng “tế bào nấm men tự do“ (viết tắt là TBNMTD). Khi dùng TBNMTD như vậy có nhiều hạn chế : - Giống dễ bò thoái hóa, giảm hoạt tính - Mỗi quần thể giống chỉ dùng được một lần . - Dòch lên men bò đục nhiều, khâu lắng lọc khá công phu . Trong những năm gần đây, nhờ những tiến bộ vït bậc trong công nghệ sinh học, người ta đã đề xuất một phương pháp mới trong việc tạo giống nấm men - đó là kó thuật gắn tế bào nấm men trên các giá thể Polymer có phủ các nhóm chức hoạt động bề mặt. Tế bào nấm men được gắn cố đònh trên giá thể như vậy được gọi là quần thể “Tế bào nấm men cố đònh” (Viết tắt là TBNMCĐ). Dùng TBNMCĐ làm gốc giống sẽ khắc phục được các nhược điểm trên, các mảnh giá thể chứa TBNMCĐ có thể tái sử dụng nhiền lần, dòch lên men thường trong. Khi sử dụng giống TBNMCĐ trong những cơ sở sản xuất lớn có tốc độ quay vòng nhanh thì hiệu quả kinh tế tăng rõ rệt so với khi dùng phương pháp cổ điển. Các loại Polymer thường được dùng làm giá thể gồm 3 loại: - Polyethylene (PE) - Polystyrene (PS) - Polyvinyl chorid (PVC) ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 7 - Để tạo nên hoạt tính bề mặt cho các giá thể, người ta phủ trên bề mặt của chúng một loại Monomer thích hợp nhằm mục đích để lộ ra các nhóm chức -COOH hoặc - NH 2 hoặc OH - . Các nhóm chức này khi tiếp xúc với quần thể tế bào nấm men sẽ liên kết với các điểm thụ thể (Receptor) trên màng tế bào, nhờ vậy mà tế bào nấm men có thể liên kết bền trên giá thể. Các Receptor trên màng TBNM thực chất là những phân tử Protein xuyên màng, có các đầu chứa các nhóm chức -COOH hoặc -NH 2 để lộ trên bề mặt lớp màng sinh chất (Membrane). Những nhóm chức này tạo vò trí tiếp nhận cho những đối tượng nào có các nhóm hoạt động tương ứng (mà trong trường hợp này chính là các mảnh giá thể Polymer đã được phủ các Monomer). Hai loại Monomer thường được dùng để phủ lên bề mặt các mảnh gía thể Polymer là: - Methacrylic acid (MAAc) chứa nhóm chức Carboxyl (-COOH). - Acrylamide acid (Aam) chứa nhóm chức amni (-NH 2 ). Để tạo nên các mảnh giá thể có nhóm chức hoạt động bề mặt cần tiến hành công đoạn “ghép Monomer”. Có nhiều phương pháp khác nhau để ghép, một trong những phương pháp có thể thực hiện khá dễ dàng tại viện Nghiên cứu Hạt nhân (NCHN) Đà Lạt là “Dùng bức xạ γ với nguồn CO 60 ”. Sau khi đã tạo được giá thể, bước tiếp theo là gắn TBNM vào giá thể. Quy trình gắn TBNMCĐ đòi hỏi phải thực hiện qua nhiều công đoạn, với những điều kiện nghiêm ngặt về các mặt: - Độ trương nước của giá thể. - Độ pH và thành phần dung dòch đệm của môi trường trong đó diễn ra quá trình tiếp xúc giữa quần thể TBNM và giá thể. - Nhiệt độ và tốc độ lắc cần duy trì trong suốt thời gian tiếp xúc. - Khoảng thời gian cần thiết cho quá rình tiếp xúc - Hoạt tính còn lại của TBNM sau khi được gắn cố đònh trên giá thể. ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 8 - III- KHẢO SÁT CÁC CHỈ TIÊU SINH HỌC CẦN THIẾT Để tuyển chọn gốc giống dùng trong sản xuất, trước hết cần xác đònh “Hoạt tính sinh học chủ yếu” của các chủng nấm men hiện có Hoạt tính sinh học chủ yếu của các chủng thể hiện qua hai tiêu chí sau: 1. Hoạt tính nhân lên: Thể hiện qua mức tăng sinh khối tổng cộng, được đánh giá qua 3 chỉ tiêu: ♦ Thời điểm sinh khối đạt cực đại (tính bằng giờ) ♦ Lượng sinh khối tổng cộng tại thời điểm đạt cực đại (tính bằng chỉ số đo độ đục D%) ♦ Mức tăng sinh khối, thể hiện qua độ chênh lệch về chỉ số độ đục giữa thời điểm đạt cực đại so với lúc bắt đầu nuôi cấy (tính bằng số lần) 2. Hoạt tính lên men: (bằng phương pháp Durgham) Thể hiện qua chỉ số sinh CO 2 , được đánh giá qua 2 chỉ tiêu: ♦ Thời điểm tạo bọt khí CO 2 đầu tiên (giờ). ♦ Độ nổi tối đa của phao Durgham (L f ). Giống nấm men được dùng trong sản xuất bao gồm 6 chủng thuộc giống Saccharomyces cerevisae Những phương pháp dùng trong khảo sát: a. Thử khả năng lên men của giôáng gốc bằng phương pháp Durgham: ª Nguyên tắc: Dựa vào lượng CO 2 thoát ra trong quá trình nuôi cấy để đánh giá tốc độ lên men của quần thể tế bào. ª Cách tiến hành: • Chọn một loạt các ống nghiệm có độ dày đồng nhất và có dung tích bằng nhau, trên thành ống đã có vạch chia độ. ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 9 - • Cho vào mỗi ống 5ml môi trường Hansen. • Thả vào đáy mỗi ống một chiếc phao Durgham (phao Durgham đặt mua của Viện Vaccin Đà Lạt). • Cấy một lượng xác đònh giống tế bào nấm men vào các ống, duy trì nhiệt độ từ 30 - 32 0 C. Theo dõi các chỉ tiêu: ♦ Thời điểm tạo bọt khí CO 2 đầu tiên. ♦ Độ nổi tối đa của phao Durgham (được ký hiệu là L f ). b. So độ đục trên máy so màu quang phổ hấp phụ (Electrophotometre) ª Nguyên tắc: • Độ đục của dòch nuôi cấy sẽ phản ánh lượng sinh khối tổng cộng có trong môi trường. • Ứng với mỗi thời điểm cần khảo sát, lấy mẫu để đo độ đục trên máy, tính mức chênh lệch về độ đục để biết mức độ tăng sinh khối. ª Cách tiến hành: • Hỗn dòch nấm men nuôi cấy trên môi trường Hansen được pha loãng đến độ pha phù hợp cho việc sử dụng máy. Đổ mẫu đã pha loãng vào Cuvet, đưa vào máy. • Cho ánh sáng có bước sóng 520λ đi qua dung dòch. Chùm tia sáng gặp dung dòch sẽ bò hấp phụ một phần và bò tán xạ, chỉ có một phần xuyên qua. Kim đồng hồ cho biết phần ánh sáng đã bò ngăn cản không đi qua hỗn dòch. Bằng cách này chúng ta biết được “độ cản quang“ của dung dòch, tính theo %, được ký hiệu là “D” - đó cũng chính là Chỉ số độ đục của quần thể tế bào. Độ đục càng cao chứng tỏ lượng sinh khối càng lớn, số tế bào trong quần thể càng nhiều. ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học . ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT F 7 G GIÁO TRÌNH VI SINH HỌC ỨNG DỤNG Giảng cho SV năm thứ ba - Ngành Sinh Học (SH 235 – 30 tiết) ThS. BẠCH PHƯƠNG LAN 2004 Vi sinh học ứng. - ThS. Bạch Phương Lan Khoa Sinh học Vi sinh học ứng dụng - 3 - LỜI TÁC GIẢ Vi Sinh Vật Học ng Dụng là một trong 5 môn học thuộc hệ thống các giáo trình