Đang tải... (xem toàn văn)
MỤC LỤCLỜI CẢM ƠNiMỤC LỤCiiDANH MỤC CHỮ VIẾT TẮTivDANH MỤC BẢNGvDANH MỤC HÌNHviTÓM TẮTviiPHẦN I. MỞ ĐẦU11.1. Đặt vấn đề11.2. Mục tiêu của đề tài11.2.1. Mục tiêu chung11.2.2. Mục tiêu cụ thể1PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU22.1. Giới thiệu chung về cellulose và cellulase22.1.1. Giới thiệu về cellulose22.2.2. Giới thiệu về cellulase22.2. Vi sinh vật sản xuất cellulase52.3. Các ứng dụng của cellulase82.3.1. Chất tẩy rửa và công nghiệp dệt may82.3.2. Công nghiệp giấy và bột giấy82.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm92.3.4. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi92.3.5. Nhiên liệu sinh học102.3.6. Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh112.4. Tình hình nghiên cứu122.4.1. Nghiên cứu trong nước122.4.2. Nghiên cứu trên thế giới13PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP143.1. Vật liệu143.1.1. Đối tượng143.1.2. Thiết bị143.1.1. Hóa chất153.2. Môi trường163.3. Các phương pháp nghiên cứu173.3.1. Phân lập vi khuẩn từ dịch nước thải nhà máy giấy173.3.2. Đánh giá đặc điểm hình thái173.3.3. Định tính cellulase bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ183.3.4. Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Miller183.3.5. Thu nhận enzyme203.3.6. Điện di SDS - PAGE21PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN234.1. Phân lập vi khuẩn từ nguồn nước thải234.2. Đặc điểm sinh học của chủng PK 4 – 9264.3. Hoạt độ enzyme cellulase274.4. Kết quả điện di SDS – PAGE28PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ305.1. Kết luận305.2. Đề nghị30TÀI LIỆU THAM KHẢO31Tài liệu tiếng Việt31Tài liệu tiếng Anh32
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------ ------ BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn” HÀ NỘI – 2011 MỤC LỤC Hình 2.2. Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB 1JS4) .4 Hình 3.1. Thu nhận enzyme .21 Hình 4.1. Hình ảnh các mẫu nước thải và dịch nuôi cấy 23 Hình 4.2. Đồ thị thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian 24 26 Hình 4.3. Hoạt tính cellulase của 8 chủng nghiên cứu .26 Hình 4.5. Đồ thị chuẩn glucose .28 Hình 4.6. Hoạt tính cellulase .28 i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APS Amonium persulphat Cellulase C1 Enzyme có hoạt tính exocellulase Cellulase Cx Enzyme có hoạt tính endocellulase CMC Carboxymethyl-cellulose CMCase Enzyme carboxymethyl cellulas D halo Đường kính vòng sáng DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid ĐC Đối chứng kDa Kilodalton. OD pI Optical density Isoelectrics point SDS Sodium dodecyl sulfat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED Tetramehtylethyenediamine U Unit V Thể tích w/v khối lượng/thể tích ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất cellulose .7 Bảng 3.1. Tên thiết bị dùng trong đề tài 14 Bảng 3.2. Các hóa chất sử dụng trong đề tài .14 Bảng 3.3. Thành phần môi trường .16 Bảng 3.4. Xây dựng đồ thị chuẩn 19 Bảng 3.5. Thành phần gel điện di SDS - PAGE .22 Bảng 4.1. Lượng đường khử sinh ra theo thời gian 23 Bảng 4.2. Hoạt tính cellulose ngoại bào của 8 chủng nghiên cứu 25 iii DANH MỤC HÌNH Hình 2.2. Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB 1JS4) .4 Hình 3.1. Thu nhận enzyme .21 Hình 4.1. Hình ảnh các mẫu nước thải và dịch nuôi cấy 23 Hình 4.2. Đồ thị thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian 24 26 Hình 4.3. Hoạt tính cellulase của 8 chủng nghiên cứu .26 Hình 4.5. Đồ thị chuẩn glucose .28 Hình 4.6. Hoạt tính cellulase .28 iv TÓM TẮT Từ nguồn nước thải nhà máy giấy Phong Khê, Bắc Ninh 8 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose đã được phân lập. Hầu hết các chủng đều phát triển tốt trên môi trường chọn lọc có agar. Khả năng sản xuất cellulase ngoại bào của các chủng vi khuẩn được kiểm tra bằng khuếch tán đĩa thạch và nhuộm Congo đỏ. Hoạt độ cellulase được xác định bằng phương pháp đường khử. Trong số 8 chủng phân lập, chúng tôi đã chọn được 1 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulase hiệu quả nhất (chủng PK 4 – 9). Kiểm tra hoạt độ bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch thu được đường kính vòng sáng có kích thước 7mm. Hoạt độ cellulase ngoại bào thu được đạt 792,5218 U/ml dịch nuôi. Enzyme ngoại bào thu được bằng cách kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy bằng ethanol (80%). Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy, enzyme cellulase ngoại bào của chủng vi khuẩn này có kích thước khoảng 32 kDa. Từ khóa: Nước thải nhà máy giấy, vi khuẩn phân hủy cellulose, hoạt tính cellulase. v PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hằng năm có khoảng 230 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo ra từ quá trình quang hợp ở thực vật, trong đó có khoảng 70 tỉ tấn (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuất nông nghiệp, chất thải các nhà máy giấy, đường và dệt may. Cellulose không tan trong nước và chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với kiềm hay acid hoặc bị thủy phân bởi các enzyme cellulase (Trần Xuân Nghạch, 2005). Hiện nay, lượng phế, phụ phẩm nông nghiệp cũng như chất thải từ các nhà máy đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường. Để giải quyết vấn đề trên, việc phân lập được các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân huỷ cellulose có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm vi sinh vật để xử lý ô nhiễm môi trường. Từ yêu cầu đó, đề tài nghiên cứu“Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn” đã được tiến hành nhằm tạo nguồn vi sinh vật ban đầu cho các nghiên cứu ứng dụng sau này. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1.2.1. Mục tiêu chung Phân lập và sàng lọc một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme celulase ngoại bào cao, trong đó tập trung vào đối tượng vi khuẩn. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase ngoại bào. - Mô tả đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn đã phân lập được. - Đánh giá được khả năng sản xuất enzyme ngoại bào bằng các kỹ thuật hóa sinh. 1 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cellulose và cellulase 2.1.1. Giới thiệu về cellulose Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên. Hằng năm một lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012 tấn) được tạo thành chủ yếu từ quá trình quang hợp (Klemm D và cộng sự, 2002). Cellulose được cấu tạo từ các gốc β-D glucopyranose được liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glucoside. Có công thức cấu tạo là (C 6 H 10 O 5 )n hay [C 6 H 7 O 2 (OH) 3 ]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật (Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến, 2007). Trong gỗ lá kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích. Hình 2.1. Một số hình ảnh về cấu trúc của cellulase 1. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose. 2. Hình ảnh ba chiều hợp chất cao phân tử Cellulose: Màu nâu - carbon, màu đỏ -oxy, màu trắng – hydro. 2.2.2. Giới thiệu về cellulase Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiều enzyme khác nhau. Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D – glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides. 2 1 2 Có 3 loại enzyme cellulose chính: - Cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobioydrolase, EC 3.2.1.91): Enzym này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Khối lượng phân tử của các enzyme thuộc nhóm này trong khoảng 53 - 75 kDa. Các enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng. - Endo-β-1,4-cellulase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase, EC 3.2.14) có khối lượng phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa. Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và β-D-glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. - β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21): có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4 – 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Enzyme thủy phân cellulose có thể được tách thành nhiều thành phần, chẳng hạn như enzyme cellulase của vi sinh vật có thể bao gồm một hoặc nhiều CBH, một hoặc nhiều EG và có thể có β-glucosidase. Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm CBH celulase, EG và BG phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose. Các enzyme exo- cellobiohydrolases và endocellulases cùng hoạt động để thủy phân cellulose thành các đoạn ngắn oligosaccharides. Các oligosaccharides (chủ yếu là cellobiose) sau đó được thủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase (Bguin P và Henrissat B, 1994). Celulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men. Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme. Cellulase được sử dụng trong công nghiệp dệt (Gusakov AV và cộng sự, 2000; Belghith H và cộng sự, 2001), trong chất tẩy rửa (Maurer KH, 1997; Kottwitz B và Schambil F, 2005), ngành công nghiệp giấy (Buchert J và cộng sự, 1996), cải thiện thức ăn chăn nuôi (Lewis GE và cộng sự, 1996), trong công nghiệp thực phẩm các enzyme 3 này chiếm một phần đáng kể của thị trường (Galante YM và cộng sự, 1998). Sản xuất ethanol sinh học từ cellulose, hemicellulose và lignin (lignocellulosic) sẽ giải quyết được mối quan tâm về tình trạng thiếu nhiên liệu hóa thạch, cũng như ô nhiễm không khí do đốt các nguyên liệu hóa thạch. Đặc biệt là sử dụng cellulase và hemicellulase để thủy phân lignocellulosic (Himmel ME và cộng sự, 1999; Zaldivar J và cộng sự, 2001). Tuy nhiên việc sản xuất ethanol cũng cần chú ý đến hiệu quả kinh tế (Sheehan J và Himmel M, 1999). Sản xuất cellulase thương mại đã được thử nghiệm bằng cách nuôi cấy cùng lúc trên môi trường rắn hoặc nuôi cấy chìm và nuôi cấy liên tục. Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có chứa các nguồn cellulose khác nhau (Person I và cộng sự, 1991; Domingues FC và cộng sự, 2000), hoặc lignocellulosic (Doppelbauer R và cộng sự,1987; Reczey K và cộng sự, 1996), đặc biệt trong lên men chất rắn. Hình 2.2. Mô hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB 1JS4) 4 . NGHỆ SINH HỌC ------ ------ BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng. tiêu chung Phân lập và sàng lọc một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme celulase ngoại bào cao, trong đó tập trung vào đối tượng vi khuẩn. 1.2.2.