LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban giám hiệu Viện Đại Học Mở Hà Nội cùng quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình dạy dỗ và tạo điều kiện học tập tốt nhất cho tôi trong suốt 4 năm vừa qua Để hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Phạm Thị Khoa - Trưởng Khoa Hóa Thực Nghiệm, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh Học Phân Tử - Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương cùng các bạn sinh viên trong nhóm thực tập đã góp ý và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Hà Nội , ngày 18 tháng 05 năm 2010 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hà Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về bệnh giun chỉ bạch huyết (LF_Lymphatic filarias 3 1.1.1.Bệnh giun chỉ bạch huyết . 3 1.1.2.Sự truyền bệnh . 3 1.1.3.Các triệu chứng nhiễm bệnh 4 1.1.4.Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết trên thế giới . 5 1.1.5.Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết tại Việt Nam 5 1.1.6.Vector truyền bệnh giun chỉ bạch huyết . 6 1.2.Các hóa chất diệt muỗi .8 1.3.Các cơ chế kháng hóa chất diệt ở muỗi .11 1.3.1.Kháng trao đổi chất 11 1.3.2.Kháng đột biến gen 12 1.4.Các phương pháp đã và đang được áp dụng trong nghiên cứu phát hiện tính kháng hóa chất ở muỗi 16 1.4.1.Phương pháp thử sinh học xác định độ nhạy cảm của WHO/CDS/CPC/MAL/98.12 16 1.4.2.Phương pháp hóa sinh 16 1.4.3.Phương pháp phân tử xác định tính kháng hóa chất diệt côn trùng .21 1.5.Chiến lược kiểm soát tình trạng kháng hóa chất diệt côn trùng .24 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 2.1.Đối tượng nghiên cứu . 26 2.2.Vị trí phân loại . 26 2.3.Thời gian nghiên cứu 26 2.4.Địa điểm nghiên cứu 26 2.5.Phương pháp nghiên cứu 26 2.5.1.Phương pháp thu mẫu vật 26 2.5.2.Phương pháp định loại bằng hình thái dựa theo tác giả: Chester J.Stojanovish và Harold George Scott, 1966 . 27 2.5.3.Phương pháp thử sinh học xác định độ nhạy cảm của WHO/CDS/CPC/MAL/98.12 27 2.5.4.Phương pháp tách chiết DNA bằng Chelex 100 .28 2.5.5.Kỹ thuật PCR . 29 2.5.5.1.Các thành phần trong PCR 29 2.5.5.2.Tiến hành PCR .30 2.5.6.Kỹ thuật điện di .31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Kết quả định loại đặc điểm hình thái .33 3.2.Kết quả phương pháp thử nghiệm sinh học xác định độ nhạy cảm theo WHO/CDS/CPC/MAL /98.12 35 3.3.Kết quả xác định đột biến kháng bằng kỹ thuật PCR 40 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1.Kết luận .43 4.2.Kiến nghị 43 Tài Liệu Tham Khảo 44 Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Phụ Lục 49 Danh Mục Các Từ Viết Tắt W. bancofti: Wuchereria bancrofti B. malayi: Brugia malayi B. timori: Brugia timori Cx. quinquefasciatus: Culex quinquefasciatus Ae. aegypti: Aedes aegypti OP: Organophosphate AChE: Enzyme Acetylcholinesterase ACh: Chất dẫn truyền thần kinh (Acetylcholine) ChAT: Enzyme Choline Acetyl-Trasferase Vg-Na + : Cổng điện thế kênh vận chuyển Na + (Voltage-gated Sodium channel) MACE: Acetylcholinesterase biến đổi (Modified Acetylcholinesterase) Kdr: Kháng ngã gục (Knock-down resistance) GST: Enzyme Glutathione S-transferase EST: Enzyme Esterase ADN: Axit Deoxyribonucleic ARN: Axit Ribonucleic cDNA: ADN bổ sung (complementary DNA) TBE: Tris-Borate-EDTA PCR: Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction) Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học MỞ ĐẦU Cơ chế kháng hóa chất ở muỗi được chia thành 2 nhóm chính 1) Trao đổi chất (tăng tiết enzyme liên quan đến khả năng giải độc của côn trùng như esterase, monooxygenase, glutathione-S-transferases) 2) Kháng tại vị trí đích (gồm có đột biến trên gen kdr và sự biến đổi enzyme acetylcholinesterase) Thêm vào đó, nhiều hoá chất diệt côn trùng như là DDT và permethrin cũng ảnh hưởng làm thay đổi tập tính côn trùng- ví dụ, bằng cách giảm tỷ lệ muỗi vào trong nhà, tăng tỷ lệ muỗi ngoài nhà đó là những sự thay đổi trong những thời gian hoạt động (Mathenge và cộng sự, 2001). Một số loài côn trùng cũng tạo ra những lớp kitin dày hơn hoặc làm biến đổi cấu trúc nhằm làm giảm quá trình xâm nhập của hoá chất gặp ở loài ruồi ngựa [25, 31] Theo WHO, năm 2006 có hơn 500 loài muỗi đã kháng với các loại hóa chất diệt côn trùng, trong đó có hơn 50% là các loại muỗi truyền sốt rét, sốt xuất huyết Dengue, truyền bệnh giun chỉ. Người ta đã chứng minh sự kháng chéo DDT với nhóm Pyrethroid. Anopheles gambiae ở châu phi đã kháng với permethrin, deltamethrin, lambda - cyhalothrin. Anopheles sacharovi kháng với DDT propoxur, bendiocarb, permethrin và lambda - cyhalothrin ở Thổ Nhỉ Kỳ (WHO 2006). Loài muỗi truyền giun chỉ Culex quinquefasciatus được liệt vào danh sách những loài muỗi đa kháng. Một số bệnh tật từ xưa nay có thể quay trở lại do môi trường ô nhiễm và muỗi kháng hóa chất (WHO, 2006) [25] Ở Việt Nam từ năm 1975 người ta đã phát hiện tính kháng với hóa chất diệt côn trùng của loài muỗi truyền bệnh giun chỉ Culex quinquefasciatus, loài muỗi truyền bênh sốt Dengue/SXH Dengue Aedes aegypti, một số loài muỗi ruyền bệnh sốt rét ven biển Nam Bộ như Anopheles epiroticus, Anopheles sinensis, Anopheles vagus, .[7] Phun hóa chất diệt là biện pháp quan trọng để giảm mật độ muỗi. Đặc biệt là khi dịch bệnh do muỗi truyền đang có nguy cơ gia tăng người ta phải tăng liều lượng, thay đổi chủng loại hoặc kết hợp các loại hóa chất diệt. Việc sử dụng hóa Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội chất diệt không chọn lọc với quần thể muỗi làm thay đổi cấu trúc di truyền của quần thể muỗi đó Có thể giám sát sự kháng hóa chất diệt ở các loài muỗi truyền bệnh bằng phương pháp thử sinh học, ứng dụng phương pháp điện di enzyme esterase - một trong những enzyme liên quan đến khả năng giải độc của muỗi với các hóa chất diệt và kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với các cặp mồi đặc hiệu giúp tìm ra những đột biến trên gen của một số loài muỗi. Từ đó đề ra các chiến lược phòng chống các bệnh do muỗi truyền, lựa chọn các biện pháp thích hợp để tránh lãng phí, ô nhiễm môi trường và nguy hại đến hệ sinh thái đang là biện pháp cấp thiết hiện nay Chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định đột biến điểm trên gen của muỗi Culex quinquefasciatus kháng hóa chất diệt tại Hà Nội” Với mục tiêu: 1. Xác định thực trạng mức độ nhạy, kháng của muỗi truyền bệnh giun chỉ Culex quinquefasciatus tại Hà Nội bằng phương pháp thử sinh học theo WHO/CDS/CPC/MAL/ 98.12 2. Ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện đột biến trên gen mã hóa protein xuyên màng của kênh vận chuyển ion Na + liên quan đến tính kháng hóa chất nhóm Pyrethroid, DDT, Photpho hữu cơ đã và đang sử dụng tại Việt Nam với loài muỗi Culex quinquefasciatus Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học 2 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Tổng quan về bệnh giun chỉ bạch huyết 1.1.1. Bệnh giun chỉ bạch huyết (LF_Lymphatic filariasis) Bệnh GCBH là 1 bệnh do ký sinh trùng gây ra xảy ra phổ biến ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới. Bệnh do ký sinh trùng truyền giun chỉ là Wuchereria bancrofti và Brugia malayi, Brugia timori có hình dạng giống sợi chỉ sống chủ yếu trong cơ [4] Bệnh giun chỉ Bancrofti, do loài giun chỉ W. bancrofti gây nên. Bệnh này do muỗi Culex quinquefasciatus, và 1 số loài muỗi Anopheles, Aedes truyền qua vết đốt. Năm 1996 ước tính có đến 107 triệu người mắc, tại nhiều vùng ở Trung Quốc, Ấn Độ, các đảo ở Thái Bình Dương, châu Phi, Trung và Nam Mỹ, Đông Nam Á bao gồm cả Việt Nam [4] Bệnh giun chỉ Brugia do Brugia malayi và Brugia timori gây nên. Năm 1996 ước tính có tới 13 triệu người mắc, chủ yếu ở các nước vùng Đông Nam Á. Muỗi truyền bệnh là các loài thuộc giống Mansonia. B. timori có mặt ở các đảo Flores, Timor, miền đông Java và do muỗi loài Anopheles barbirostris truyền [4] 1.1.2. Sự truyền bệnh Giun chỉ trưởng thành sống trong các mạch bạch huyết của cơ thể, sinh ra các ấu trùng, chúng di chuyển trong mạch máu và vào cơ thể muỗi khi muỗi đốt người bệnh. Ấu trùng khi phát triển trong cơ thể muỗi nhiều ngày tùy loài, chúng sang người lành khi muỗi nhiễm hút máu, chúng di chuyển đến các hạch bạch huyết và phát triển thành giun chỉ trưởng thành. Khả năng mắc bệnh do 1 lần bị muỗi đốt là rất thấp. Giun chỉ trưởng thành có thể sống nhiều năm sinh ra 1 lượng lớn ấu trùng trong máu [4] Giun chỉ Bancrofti có 2 thể: Ở thể phổ biến nhất, ấu trùng giun chỉ di chuyển trong máu về đêm, trong khi ở thể thứ 2, ấu trùng có mặt liên tục trong máu nhưng số lượng lại tăng lên vào ban ngày. Muỗi Cx. quinquefasciatus là vector chính truyền bệnh và một số loài Anopheles (đốt mồi về đêm). Thể thứ Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học 3 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 2 được thấy ở Nam Thái Bình Dương và một số vùng nông thôn ở Đông Nam Á nơi mà loài truyền bệnh chính là các loài muỗi đốt Bệnh giun chỉ Brugia, do loài B. malayi gây ra, cũng có hai thể, trong đó phổ biến nhất được truyền về đêm, và thể kia, được truyền cả đêm lẫn ngày. Thể thứ nhất xảy ra tại các vùng trồng lúa ở châu Á. Thể này do các loài Anopheles đốt mồi ban đêm, và các loài Mansonia đẻ trứng tại các vùng đầm lầy ở Indonesia và Malaysia có thể nhiễm sang người ở gần đó [4] Hình 1. Chu kỳ sinh học của bệnh giun chỉ ( www.impe-qn.org.vn) 1.1.3. Các triệu chứng nhiễm bệnh (PGS.TS. Cao Văn Viên - ThS. Nguyễn Văn Dũng Khoa Truyền nhiễm - Bệnh viện Bạch Mai) Thời kỳ nhiễm bệnh thường được chia làm 3 giai đoạn Thời kỳ ủ bệnh: Bệnh nhân không có bất kỳ triệu chứng gì nhưng xét nghiệm ngẫu nhiên thấy có ấu trùng giun chỉ trong máu ngoại vi.thời gian ủ bệnh có thể kéo dài từ 4-7 năm ,thường bệnh nhân có các biểu hiên như ngứa ngoài da ,sốt nhẹ,bạch cầu ái toan trong máu tăng cao, mệt mỏi. Thời kỳ này có khả năng lây bệnh cao [23] Thời kỳ khởi phát: Bệnh nhân xuất hiện các đợt viêm hạch bạch huyết kèm theo sốt, diễn biến như các bệnh nhiễm trùng. Các đợt viêm hạch bạch huyết ngày càng tăng, có thể thấy hoặc sờ thấy hạch vùng nách, bẹn hoặc các Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học 4 Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội bạch mạch nổi cứng. Đối với loài W. bancrofti hay xuất hiện hiện tượng đái ra dưỡng chấp, có khi có máu và dưỡng chấp. Bệnh nhân gầy sút nhanh. Những đợt phát bệnh tự hết và xuất hiện dần hiện tượng phù chân voi. Phù chân voi thường xuất hiện ở chi dưới, bộ phận sinh dục. W. bancrofti hay gây hiện tượng phù ở bộ máy sinh dục còn đối với B. malayi hay gây hiện tượng phù voi ở chi. Thời kỳ này kéo dài nhiều năm. Trong thời kỳ này nếu xét nghiệm máu ngoại vi có thể tìm thấy ấu trùng giun chỉ [23] Thời kỳ tiềm tàng: Ở thời kỳ này, bệnh nhân không thấy xuất hiện các đợt viêm bạch mạch cấp tính, nhưng các hạch bạch huyết có thể to lên thường xuyên. Quan trọng nhất thời kỳ này là xuất hiện phù voi. Các đợt phù voi liên tiếp, da dày dần, ở chân có thể thấy phù từ dưới lên trên. Thường bệnh nhân phù một chân hoặc 1 tay, ít trường hợp phù cả 2 chân. Bộ máy sinh dục nam, nữ cũng có hiện tượng phù to, không đỏ, không đau. Trong thời kỳ này rất ít khi tìm thấy ấu trùng giun chỉ trong máu ngoại vi.[23] 1.1.4. Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết trên thế giới Bệnh giun chỉ bạch huyết được biết ảnh hưởng lên người cách nay khoảng 4000 năm. Các tài liệu mô tả về triệu chứng bệnh đầu tiên là thế kỷ 16, khi Jan Huyghen van Linschoten viết về bệnh trong suốt quá trình tìm ra Goa. Những nổ lực từ Chương trình toàn cầu loại trừ bệnh giun chỉ (Global Programme to Eliminate LF) được đánh giá là đã phòng ngừa được 6.6 triệu ca mắc mới từ các trẻ em và làm dừng diễn tiến bệnh trên 9.5 triệu người khác nhiễm chúng. Tiến sĩ Mwele Malecela-chủ tịch chương trình cho biết chúng ta vẫn còn đối mặt và cần nổ lực nhiều hơn để tiến đến mục tiêu loại trừ giun chỉ vào năm 2020.Hiện nay, hơn 1 tỉ người ở trên 80 quốc gia trên khắp thế giới đang sống trong vùng lưu hành của bệnh giun chỉ bạch huyết. Hàng năm, có hơn 120 triệu người mắc phải căn bệnh này và đã có 40 triệu người trong tình trạng tàn phế với nhiều bộ phận cơ thể bị biến dạng [4] 1.1.5. Tình hình bệnh giun chỉ bạch huyết tai Việt Nam Bệnh rất phổ biến ở các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới, trên thế giới có khoảng 120 triệu người ở 73 quốc gia nhiễm bệnh và 1,1 tỷ người ( khoảng Nguyễn Thị Thu Hà Lớp 0602 - Khoa Công Nghệ Sinh Học 5 . đề tài Ứng dụng kỹ thuật PCR xác định đột biến điểm trên gen của muỗi Culex quinquefasciatus kháng hóa chất diệt tại Hà Nội Với mục tiêu: 1. Xác định thực. giải độc của muỗi với các hóa chất diệt và kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với các cặp mồi đặc hiệu giúp tìm ra những đột biến trên gen của một