BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học -&&& - KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TÁCH DỊNG, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN NOVS THAM GIA TỔNG HỢP ĐƯỜNG NOVIOSE TRONG CẤU TRÚC KHÁNG SINH NOVOBIOCIN Khoa : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS.Tạ Thị Thu Thủy Sinh viên thực tập : Phạm Văn Phú Hà nội, ngày 20 tháng năm 2010 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo TS Tạ Thị Thu Thủy, giao để tài, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp đõ em hồn hành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo, cán khoa công nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em trình em thực tập Phịng nghiệm sinh học phân tử khoa cơng nghệ sinh học Viện Đại Học Mở Hà Nội Em xin gửi lời cảm ơn anh, chị bạn phịng thí nghiệm Sinh học phân tử hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian vừa qua để em hồn thành tốt khóa luận Do thời gian khả thân có hạn, nên khóa luận khơng tránh khỏi thiều sót Rất mong nhận bảo thầy cô góp ý kiến bạn để khóa luận đầy đủ hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2010 Sinh viên Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Phạm Văn Phú MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ sinh học coi năm ngành công nghệ mũi nhọn nhân loại gồm công nghệ sinh học, công nghệ thông tin, công nghệ điện-điện tử, công nghệ vật liệu mới, công nghệ lượng Công nghệ sinh học môn tập hợp ngành khoa học công nghệ gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học, cơng nghệ học, nhằm tạo quy trình cơng nghệ khai thác quy mô công nghiệp hoạt động sống vi sinh vật, tế bào động, thực vật để sản xuất sản phẩm có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội bảo vệ môi trường CNSH ứng dụng vào nhiều lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, y học, dịch vụ, du lịch… nhằm phục vụ cho cầu sống dinh dưỡng, giải trí, chăm sóc sức khỏe Bằng kiến thức sinh học thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn, sử dụng “công nghệ ADN tái tổ hợp” nhà khoa học cố gắng tạo trồng, vật ni có suất chất lượng cao, loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho người Mục tiêu đề tài là: Tách dịng , giải trình tự thiết kế vector biểu gen novS tham gia tổng hợp đường noviose cấu trúc kháng sinh novobiocin NHỮNG TỪ NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic Amp Ampicillin EDTA Ethylen diamin tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulphate TAE Tris – Acetate –EDTA Taq Polymerase Polymerase Thermus aquaticus TBE Tris – Base –EDTA OD Optical Density TE Trophectoderm dNTP Deoxiribonucleotide 5’ - triphosphates Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội MỤC LỤC CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh Sự phát triển vi sinh vật học nói chung, vi sinh vật cơng nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming (1982) mở kỷ nguyên y học: Khai sinh ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho người Thuật ngữ "chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mơ tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885) nêu định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn chủng đặc tính tổng hợp hợp chất hố học có hoạt tính kìm hãm chủng đối kháng Nicolle (1907) người phát hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis có liên quan đến q trình hình thành bào tử loại trực khuẩn Gratia đồng nghiệp (1925) tách từ nấm mốc chế phẩm sử dụng để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn Mặc dù vậy, thực tế tới năm 1929 thuật ngữ " Chất kháng sinh" Alexander Fleming mô tả cách đầy đủ thức báo cáo chi tiết penicillin Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Thập kỷ 40 50 kỷ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt kiện như: Khám phá hàng loạt Chất kháng sinh, thí dụ như: griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol polymicin (1947), clotetracyclin Cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), amphotericin B vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin rifamycin (1957) Áp dụng phối hợp kỹ thuật tuyển chọn tạo giống tiên tiến (đặc biệt kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp gen ) tạo biến chủng công nghiệp có lực tổng hợp chất kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần chủng ban đầu Triển khai thành cơng cơng nghệ lên men chìm quy mơ sản xuất công nghiệp để sản xuất penicillin G (1942) việc hồn thiện cơng nghệ lên men sản phẩm khác Việc phát hiện, tinh chế sử dụng axit - aminopenicillanic (6APA, 1959) làm nguyên liệu để sản xuất chất kháng sinh penicilin bán tổng hợp cho phép tạo hàng loạt dẫn xuất penicilin số kháng sinh β - lactam bán tổng hợp khác 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh tất hợp chất tự nhiên, tổng hợp bán tổng hợp có tác dụng ức chế tiêu diệt chọn lọc vi sinh vật gây bệnh mà khơng có khơng có tác dụng lên người, động vật thực vật.(1) 1.1.2 Cơ chế tác dụng Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh (hay đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất(2) Cơ chế tác động chủ yếu kháng sinh: -Ức chế thành lập vách tế bào -Ức chế trình trao đổi chất màng tế bào -Ức chế tổng hợp protein -Ức chế tổng hợp acid nucleic 1.1.2.1 Ức chế thành lập vách tế bào Khi tổng hợp vách tế bào bị ức chế làm cho vi khuẩn Gr(+) biến thành dạng hình cầu khơng có vách (proto-plast) cịn vi khuẩn Gr(-) có Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội vách khơng hồn chỉnh (spheroplast) dẫn đến tế bào dễ vỡ môi trường có trương lực bình thường Kháng sinh thuộc nhóm :Bacitracin, cephalosporin, cycloserine, penicillin, rostocetin, vancomycin Cơ chế : Giai đoạn thuốc gắn vào thụ thể PBPs làm phong bế transpeptidase dẫn đến ngăn cản tổng hợp peptidoglycan Mỗi tế bào thương có Có - thụ thể PBP Những thụ thể khác có lực khác loại thuốc tác dụng thuốc khác Giai đoạn hoạt hóa enzym tự tiêu làm ly giải tế bào môi trường đẳng trương 1.1.2.2 Ức chế trình trao đổi chất màng tế bào Chức màng tế bào: Màng tế bào lớp màng bao bọc bên ngồi tế bào có Nó tham gia vào trình thẩm thấu chọn lọc, vận chuyển chủ động, kiểm soát thành phần bên màng tế bào Kháng sinh thuộc nhóm :Amphotericin B, colistin, imidazole, nystatin, polymycins Tác dụng: Imidazole làm suy yếu toàn vẹn màng tế bào vi nấm cách ức chế tổng hợp lipid màng tế bào Polymycins tác động lên vi khuẩn Gr (-) Polyenes tác động lên vi nấm 1.1.2.3 Ức chế tổng hợp protein Kháng sinh thuộc nhóm bao gồm: Chloramphenicol, erythromycins, lincomycins, tetracyclines, aminoglycosides Cơ chế tác dụng: Aminoglycosides :Giai đoạn thuốc gắn vào thụ thể tiểu đơn vị 30S Giai đoạn phong bế hoạt tính phức hợp trình thành lập chuỗi peptid Giai đoạn thông tin mRNA bị đọc sai dẫn đến acid amin không phù hợp Giai đoạn làm vỡ polysomes thành monosomes làm có chức tổng hợp protein Tetracyclines:Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 30S / ribô thể, ngăn chặn amino acid gắn vào chuỗi peptid thành lập Macrolides:Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 50S/ ribô thể, ngăn cản thành lập phức hợp để tổng hợp chuỗi peptid Lincomycins: Cơ chế giống nhóm Macrolides 1.1.2.4 Ức chế tổng hợp acid nucleic Kháng sinh thuộc nhóm này: Actinomycin, Mitomycin, nalidixicacid, novobiocin, pyrimethamin, rifampin, sulfonamides, trimethoprim Cơ chế tác dụng: Actinomycin: Thuốc gắn vào ADN tạo nên phức hợp làm ức chế polymerase dẫn đến ngăn tổng hợp ARN (mARN) Rifampin: Thuốc gắn vào polymerase làm ức chế tổng hợp ARN Nalidixic acid: Phong bế ADN gyrase làm ức chế tổng hợp AND Sulfonamides:PABA tiền chất để tổng hợp acid folic có vai trị tổng hợp acid nucleic Sulfonamides có cấu trúc tương tự PABA, Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội cạnh tranh với PABA tạo chất tương tự acid folic khơng có chức làm cản trở phát triển vi khuẩn Trimethoprim: Kháng sinh ức chế dihydrofolic acid reductase tham gia vào chuyển Dihydrofolic acid thành tetrahydrofolic acid trình tổng hợp purines/ ADN 1.2 Kháng sinh Novobiocin 1.2.1 Giới thiệu 1.2.1.1 Khái niệm Novobiocin kháng sinh thuộc nhóm aminocaumarin sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces Spherodes sp có tác dụng hiệu điều trị bệnh bị nhiễm nhóm vi khuẩn Gram (+) Staphylococcus spp, Streptococcus spp, đồng thời có khả kháng lại với enzim thuộc nhóm beta – lactamase Hiện novobiocin sử dụng để bào chế kháng sinh dùng điều trị bệnh cho người thú y dùng điều trị số bệnh cho đại gia súc (3) Về cấu tạo, novobiocin bao gồm tiểu phần, gốc đường khử noviose (vòng C), gốc coumarin (vòng B) gốc axit prenylated 4hydroxylbenzoic (ring A) (hình 1) Trong gốc đường noviose có tác dụng tăng tính tan thuốc tăng tương tác thuốc với tác nhân gây bệnh, vòng B vịng A có vai trị q trình gây bất hoạt chức enzyme trung tâm hoạt động enzim ADN gyrase(4) Hình Cấu trúc hóa học kháng sinh novobiocin Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Trong kháng sinh đại phân tử gốc đường khử có vai trị vơ quan trọng việc tăng tính tan chúng dung môi tăng khả tương tác thuốc với tác nhân gây bệnh gốc đường cịn có vai trị gây bất hoạt chức tác nhân gây bệnh Trong gốc đường noviose (vịng C) (hình 2) có vai trị lớn việc xác định phổ kháng khuẩn gốc coumarin nhóm methyl tromg phân tử đường phân tử noviose giúp cho gốc coumarin kháng sinh tương tác tốt với enzim gyrase (GyrB) Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình Dự đốn đường sinh tổng hợp đường noviose (ring C) Các nghiên cứu ngồi nước novobiocin Năm 2000 nhóm gen tham gia vào đường sinh hóa tổng hợp novobiocin tách dịng thành cơng nhóm nghiên cứu M Steffensky cộng Toàn đoạn ADN với tổng số 26,5 kb với 23 gen (ORFs) nằm hệ gen xạ khuẩn Streptomyces Spheroides sp NCIB 11891 giải trình tự cơng bố ngân hàng gen (genbank – NCBI) Bằng cách so sánh trình tự với gen tương tự ngân hàng gen tất chức ORF nhóm gen dự đốn Tuy nhiên để chứng minh chức nayg cần phải có nghiên cứu nghiên cứu thực nghiệm.(5) Theo cơng bố nhóm nghiên cứu C T Walsh năm 2008 cộng sự, gốc coumarin gốc tương tác với enzim gyrase vi khuẩn thể hoạt tính kháng khuẩn Gốc bắt đầu tổng hợp từ tyrosin xúc tác enzyme tạo từ novH, novJ, novK cuối kết thúc hoạt tính enzim NovH Các gen tách dòng chứng minh hoạt tính phương pháp gây đột biến ngồi gen tách dòng biểu vật chủ E.coli enzim được tinh chứng minh hoạt tính phương pháp khối phổ Theo Heide cộng công bố năm 2008 , xu hướng ngày nghiên cứu kháng sinh ứng dụng công nghệ gen để tạo hệ kháng sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao có khả không bị kháng lại vi sinh vật gây bênh Để tạo hệ coumarin mới, vật chủ ngoại xạ khuẩn Streptomyces coelicolor vật chủ chuyển gen E coli M512 phage PhiC31 sử dụng để chuyển nhóm gen tạo novobiocin để kết hợp vào hệ gen vật chủ ngoại Toàn cosmid có chứa 23 gen tham gia tổng hợp novobiocin chuyển vào hệ gen Streptomyce coelicolor từ tạo chủng tái tổ hợp mới, với phương pháp gây đột biến điểm đột biến thay số gen nhóm gen vật chủ tái tổ hợp tạo hàng loạt chất dẫn xuất aminocoumatin hệ aminocoumarin Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội 1.2.1.2 Cấu trúc Novobiocin có công thức tổng quát C31H36N2O11 Khối lượng phân tử 612.624 đvc Novobiocin hợp chất vòng thơm Novobiocin bị tách thành chất: Một dẫn xuất axit benzoic ( vòng A), dẫn xuất coumarin ( vòng B), đường novobiose (vòng C) Đường noviose (vịng C) gắn vào vào vị trí số 7’ dẫn xuất coumarin( vòng B) liên kết glycorit Phương pháp X quang tìm phức hợp thụ thể novobiocin ADN Gyrase ATP novobiocin có vị trí bám phân tử Gyrase giống nhau[6] Sự trùng khớp điểm bám coumarin ATP sở vững để kháng sinh aminocoumarin nhân tố ức chế cạnh tranh với hoạt động enzyme ATPase 1.2.2 Cơ chế hoạt động Cơ chế phân tử hoạt động novobiocin, kháng sinh clorobiocin khác coumermycin A1 nghiên cứu Nhóm Aminocoumarin có hiệu lực ức chế mạnh enzyme mạnh ADN gyrase vi khuẩn công vào tiểu phần GyrB enzym tham gia vào việc di truyền tính trạng Novobiocin mạnh kháng sinh aminocoumarin khác hoạt động chất ức chế cạnh tranh với phản ứng xúc tác enzym ATPase GyrB Hoạt lực novobiocin cho cao fluoroquinolones, có mục tiêu cơng enzyme ADN gyrase, vị trí khác enzym Tiểu phần GyrA có liên quan tới việc trình tháo xoắn phân tử ADN 1.2.3 Ứng dụng novobiocin Novobiocin kháng sinh chống lại hoạt động Staphylococcus epidermidis dùng để nhận biết vi khuẩn coagulase-negative Staphylococcus saprophyticus – Một vi khuẩn kháng lại với novobiocin Trong nuôi cấy novibiocin đặt dùng với tên albamycin (Pharmacia And Upjohn) năm 1960 Hiệu chứng minh thử nghiệm thuốc điều trị bệnh cho người gia súc Novobiocin có hiệu lực điều trị MRSA (Methicillinresistant Staphylococcus aureus ) 1.3 Đường khử cấu trúc Novobiocin 1.3.1.Giới thiệu chung đường khử Đường khử gốc đường đặc biệt tìm thấy nhiều cấu trúc tế bào vi khuẩn, tế bào nấm, cấu trúc nhiều chất có hoạt tính sinh học thành phần cấu trúc nhiều thuốc kháng sinh hay chất chống ung thư Về cấu tạo chất đường khử chất mà phân tử chúng có hay nhiều nhóm hydroxyl (OH) thay nguyên tử H hay nhóm chức khác amino, methyl, alkyl….Các loại đường khử tồn dạng đường đơn hay đường đa phân nhánh dẫn xuất sản phẩm trao đổi chất bậc hợp chất tự nhiên (8) Trong chất có hoạt tính sinh học đuờng khử đóng vai trị quan Phạm Văn Phú lớp 06-04 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội trọng xác định hoạt tính chất này, có nhiều nghiên cứu chứng minh chất hoạt tính sinh học bị hoàn toàn hoạt tinh gốc đừờng cấu trúc bị loại bỏ.(9) Trong cấu trúc tế bào vi sinh vật đường khử tham gia tạo thành cấu trúc peptidoglycon thành phần lớp thành tế bào nhiều loài vi sinh vật đặc biệt số vi khuẩn gram dương hình thành lớp Lipopolyscharide cấu trúc màng tế bào nhóm gram âm Theo nghiên cứu (10) gốc đường khử nhóm kháng sinh enedine có vai trị định hoạt tính kháng khuẩn chất kháng khuẩn, nghiên cứu cho thấy gốc đường rhamnose kháng sinh calicheamicin đóng vai trị làm cầu nối liên kết phân tử kháng sinh với enzyme tham gia vào trình mã hay sinh tổng hợp mRNA Các nghiên cứu gốc đường khử nhóm kháng sinh macrolide erythromycin, tylosin, pikromycin đóng vai trị gắn kháng sinh với enzyme tham gia tổng hợp protein vi khuẩn (11) Việc nghiên cứu vai trò gốc đường gốc đường khử cấu trúc tế bào số vi sinh vật gây ức chế sinh truởng tế bào tiêu diệt vi sinh vật (6) Xu hướng nghiên cứu hoá dược giới nghiên cứu tạo hệ kháng sinh cách thay gốc đường vào gốc đường cũ số nhóm kháng sinh (7) Vì kháng sinh hệ có hoạt tính kháng khuẩn cao hơn, tránh đựơc tượng kháng thuốc vi khuẩn đồng thời khả thải trừ thuốc nhanh 1.3.2 Vai trò đường noviose kháng sinh novobiocin Gốc đường noviose (ring C) có vai trò lớn việc xác định phổ kháng khuẩn gốc coumarin nhóm methyl tromg phân tử đường phân tử noviose giúp cho gốc coumarin kháng sinh tương tác tốt với enzim gyrase (GyrB) 1.3.3 Con đường sinh tổng hợp gốc đường khử tế bào vi sinh vật Hầu hết đường khử cấu trúc kháng sinh đựợc sinh từ vi sinh vật đường 6- deoxyhexose Tiền chất tham gia trình sinh tổng hợp gốc đường glucose -1- phosphate qua chuỗi phản ứng sinh hoá tế bào xúc tác nhóm enzyme kết tạo đựoc gốc đừờng khử hay nhiều nhóm OH nguyên tử H, nhóm -CH3, nhóm =O, hay nhóm CHO- … (hình 3) Phạm Văn Phú lớp 06-04 10 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Tách chiết DNA plasmid Điện di DNA plasmid gel agarose Kỹ thuật cắt gen Nhân gene phản ứng PCR Tạo vector tách dòng pGEM -3Z Giải trình tự gen Tạo vector tái tổ hợp pET -32 a(+) Biến nạp vector pETnovS vào tế bào vi khuẩn E.Coli XL1 Blue 2.2.1 Tách chiết ADN plasmid Nuôi vi khuẩn E.coli môi trường LB lỏng máy lắc với tốc độ 180-200 vòng/phút, nhiệt độ 37 0C, ni qua đêm đến OD khoảng 0,6 tiến hành tách plasmid Quá trình tách plasmid tiến hành sau: Cho – 1,5ml dịch nuôi cấy vào ống eppendorf ly tâm lần 10 phút Sau ly tâm dùng pipet hút hết dịch ni cấy Cho 30µl solution vào lấy 100 µl dung dịch vừa pha cho vào ống eppendorf dùng pipet bơm lên bơm xuống Cho tiếp 100 µl solution II vào hai ống eppendorf sau dùng tay lắc nhẹ Tiếp tục cho 100 µl dung dịch solution III vào lại dùng tay lắc nhẹ Sau cho ba dung dịch solution I, II, III tiến hành ly tâm lạnh lần hai 10 phút với tốc độ 10000/phút, sau dùng pipet hút hết dịch chuyển sang ống eppendorf Tiếp theo lấy 600-800 µl Iso propanol vào hai ống eppendorf, tiến hành lắc lên lắc xuống nhằm mục đích làm đơng tụ ADN Cuối ly tâm lần sau tách phần dịch lỏng phía rửa ADN thu cồn 70 độ 2-3 lần thu ADN bảo quản Để ADN hịa tan hết quản tốt bổ sung 40µl TE buffer nước cất 2.2.2 Chạy điện di ADN plasmid Agarose - Chuẩn bị đệm điện di TAEx1 TBEx1 - Đổ gel 0.4 – 0.8 agarose - Đặt gel vào hộp điện di đổ dung dịch đệm ngập gel sau chấm mẫu vào giếng gel - Chạy điện di 120-140 V 30 – 40 phút - Rửa gel kiểm tra két máy UV Phạm Văn Phú lớp 06-04 16 Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội 2.2.3 Kỹ thuật cắt gen Công thức thực phản ứng cắt gen Buffer: 3µl Enzym EcoRI: 1,5µl Enzym NdeI: 1,5µl ADN plasmid: 10-16µl Nước: Bổ sung tổng thể tích phản ứng đạt 30µl Thực phản ứng ống eppendorf 370C 1-2h Sau tiến hành cắt xong kiểm tra kết thông qua điện di gen agarose.( tương tự trình điện di nêu mục 2.2.2) 2.2.4 Nhân gene phản ứng PCR Thiết kế mồi: Dựa vào trình tự gen novS cơng bố ngân hàng liệu gen Quốc tế để thiết kết cặp mồi: Mồi xi: 5’–GCGGTACCCATATGACGGATCGCTGG - 3’ Với vị trí cắt NedI Mồi ngược: 5’-CACCAGAATTCGCATCTGCGGCCC - 3’ Với vị trí cắt EcoRI Thực phản ứng PCR: Hỗn hợp phản ứng gồm: 1.0 µl ADN khn (100 ng/µl) 2.5 µl mồi, 1.25 µl cho mồi(100 ng/µl) 1.0 µl Taq ADN Polymerase 1.0 µl nucleotide 5.0 µl đệm 89.5 µl H2O Tổng thể tích 100 µl hỗn hợp phản ứng ( sử dụng ống eppendorf 200 μl) đưa vào máy PCR Phản ứng nhân (PCR) có chu trình nhiệt sau: Biến tính chu kỳ Lưu giữ Giữ sản phẩm 940C phút 940C 50 giây 520C 50 giây 720C phút 25 giây 780C phút 40C 2.2.5 Tạo vector tách dòng pGEM -3Z Đoạn gen sau khuếch đại phản ứng PCR tinh chế chuyển vào vector tách dòng pGEM -3Z Quá trình Phạm Văn Phú lớp 06-04 17 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội thực sau: Thành phần phản ứng gồm: 2x Rapid Ligation Buffer, T4 ADN ligase: μl Vector pGEM -3Z: μl Sản phẩm PCR Enzym nối T4 ADN Ligase: μl Nước cất : Bổ sung để tổng thể tích phản ứng đạt 10 μl Phản ứng thực 40C ủ qua đêm Sau phản ứng dự kiến gen novS gắn vào vector tách dòng pGEM-3Z, plasmid gọi pGEMnovS 2.2.6 Biến nạp ADN vào tế bào vi khuẩn E.coli XL1 Blue (hình 8) Tạo tế bào khả biến: Giống vi khuẩn chọn để tạo tế bào khả biến E.coli XL1 Blue Quá trình ni thực máy ni lắc với tốc độ 180-200 vịng/phút, nhiệt độ 37 0C, ni 20h để đạt OD600 = 0.5 Sau nuôi cấy, lấy 1ml dịch nuôi cho vào ống eppendorf, ly tâm lạnh 10 phút loại bỏ dịch nuôi, thu sinh khối Bổ sung 1ml CaCl2 vào ống chứa sinh khối, dùng pipet bơm hút để hòa tan CaCl2 tế bào Sau ly tâm lạnh 10 phút, sau ly tâm bỏ dịch bổ sung tiếp 1ml CaCl2 ly tâm tiếp 10 phút Sau ly tâm hút bỏ dịch, lấy 40μCaCl2 cho vào phần cặn lại ống eppendorf, dùng pipet bơm hút nhẹ nhàng để trộn Sau ngâm ống eppendorf vào nước đá vòng 1h thu tế bào E.coli XL1 Blue khả biến Biến nạp: Lấy 40μ tế bào khả biến 0C cho vào ống eppendorf 1,5ml Lấy 10μ dung dịch chứa vector tái tổ hợp chuyển gene cho vào ống eppendorf vừa chuẩn bị Dùng pipet bơm hút nhẹ nhàng để trộn Sau ngâm ống eppendorf chứa vector vào tế bào vào nước 00C 30 phút Thực sốc nhiệt: Ngâm cố định ống eppendorf chứa vector tế bào 00C vào nước 420C 50 giây Ngay sau lại ngâm ống efenof chứa vector vào tế bào vào nước đá vòng phút Bố sung 950μ dịch mơi trường LB có chứa ampicilin (tỷ lệ ampicilin/ Lb 1mg / ml) , trộn pipet nuôi máy nuôi lắc với tốc độ 180 vịng/ phút, ni 1,5 Sau phản ứng hoàn thành thể biến nạp chọn lọc ni cấy Sau tách plasmid kiểm tra điện di gel agarose Phạm Văn Phú lớp 06-04 18 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 6: Sơ đồ thiết kế vector tách dòng pGEM -3Z mang gen novS 2.2.7 Giải trình tự gen Để giải trình tự gen ta tiến hành tách plasmid tái tổ hợp pGEMnovS tế bào vi khuẩn E.coli XL1 Blue biến nạp trên, sau gửi giải trình tự 2.2.8 Tạo vector tái tổ hợp pET -32 a(+) Đoạn gen sau giải trình tự xác định xác gen novS chuyển vào vector tái tổ hợp pET -32a(+) Kỹ thuật chuyển gen vào vector pET -32a(+) tiến hành tương tự chuyển vào vector tách dòng nói mục 2.2.5 Vector pET -32a(+) gắn gen novS đặt tên pETnovS Để kiểm tra vector tái tổ hợp có chứa gen hay khơng, vector tái tổ hợp tiếp tục biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli BL21 (phương pháp tiến hành tương tử mục 2.2.6) Dịng tế bào biến nạp (có chứa pETnovS) ni cấy chọn lọc Sau lại tách plasmid, plasmid sau tách lại cắt hai enzym NedI/EcoRI ( mục Phạm Văn Phú lớp 06-04 19 Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội 2.2.3) Sản phẩm cắt kiểm tra gel agarose ( mục 2.2.2) CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết 3.1.1 Kết PCR kiểm tra cắt gen novS NedI EcoRI Đoạn gen novS đuợc khuếch đại thu nhận phản ứng PCR, sử dụng AND cosmid với cặp mồi: Mồi xuôi :5’–GCGGTACCCATATGACGGATCGCTGG - 3’ Mồi ngược: 5’ -CACCAGAAT TCGCATCTGCGGCCC - 3’ Để tìm nhiệt độ phản ứng tối ưu nhất, tiến hành thử nghiệm qua phản ứng với điều kiện nhiệt độ khác nhau(từ 64.5 0C – 680C) Sau phản ứng PCR kết thúc, thu kết Sau kiểm tra điện di gel agarose Kết trình bày hình Từ kết điện di sản phẩm ADN hình cho thấy ADN hệ gen cột với nhiệt độ gắn mồi Tm = 67,5 0C sáng rõ nét, khơng bị đứt gãy, có kích thước khoảng 0.8 kb Từ ta tìm nhiệt độ gắn mồi thích hợp Tm = 67,5 0C; đồng thời dự đốn gen có kích thước 0.8 kb gen novS Hình 7: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR Trong đó: M: Marker ( Thang AND chuẩn ) Đường chạy 1, 2, 3, 4, ,6 ,7 ,8 : PCR mẫu AND tương ứng với mức thử nghiệm nhiệt độ khác Mẫu Tm( 0C ) 64.5 65 Phạm Văn Phú lớp 06-04 65,5 66 66.5 67 67,5 68 20 Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội 3.1.2 Kết PCR chuyển gen novS vào vector pGEM -3Z Đoạn gen novS cắt NedI/EcoRI nối vào plasmid pGEM -32a(+) NedI/ EcoRI nhờ T4 ADN ligase Các plasmid đặt tên pGEMnovS Sản phẩm nối sau biến nạp vào E.coli XL1 Blue (trình bày phần phương pháp mục 2.2.5 2.2.6) Các dòng E.coli XL1 Blue tái tổ hợp mang plasmid pGEMnovS nuôi cấy qua đêm 37 0C 3ml mơi trường LB có chứa ampicilin nồng độ mg/ml Sau 16 nuôi cấy, tế bào thu lại Để kiểm tra trình biến nạp có thành cơng hay khơng, tiếp tuc tách plasmid từ tế bào ni cấy để kiểm tra Sau tách, plasmid cắt hai enzym NedI/EcoRI điện di gel agarose (hình 8) Từ ảnh điện di hình 10 cho thấy mẫu ADN plasmid sau xử lý với enzym NedI/ EcoRI xuất hai đoạn ADN, có kích thước tương đương gen NovS 0,8 kb, đoạn cịn lại có kích thước tương ứng với pGEM -3Z 2743 kb Điều cho phép ta khẳng định sản phẩm PCR gắn vào vectơ pGEM -3Z Hình 10: Điện di kiểm tra ADN plasmid pGEMnovS đuợc cắt NedI/EcoRI Trong đó: M: Thang ADN chuẩn Đường chạy 1-5: mẫu plasmid pGEMnoS cắt NedI EcoRI Phạm Văn Phú lớp 06-04 21 Khoa Công Nghệ Sinh Học 3.0 kb 0.86kb Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội 3.1.3 Kết xác định trình tự đoạn gen NovS Đoạn gen novS plasmid pGEM -3Z đuợc giải trình tự Kết giải trình tự gen novS sau: ATTGGAGCTCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAG GAATTCCATGGATGCGGTACCCATATGACGGATCGCTGGCTGGTCACCGGTGCGGCG GGAATGCTCGGGCGAGATCTGGTGGCGCTCCTGCGAGGGCTGAACGAACCGGTGGTC GCCATCACCCGGCACGATCTCGACATCACCGACCGCCTCTCGGTCCGGGCCGTTGTC GACAGGCACCGGCCGACGACCATCGTCAACTGCGCCGCCTGGACACGATTCGGCGAG GCGGAGGCCGGCGAATCGGCGGCCCTTCTCGTCAACGGAGGAGGGGCCCGGGAGCTG GCCGCGGTATGCCGTGATCGATCGATACGGCTGGTCCACCTCTCCACCGATTACGTC TTCGACGGCACGAGCCGCCGCCCCTACGCCGAAAGCGCGGTCACGAGCCCGATCAAC GCGTACGGCCGGACGAAGCAGGCCGGCGAACAGGCGGTGCTCGACCTGCTGCCGGAC GACGGCACGATCGTACGAACCGCCTGGCTGTACGGGCGGCACGGCATGAACTTCATC CGCAAGATGGTCCGGCTGGAGCAGCTGCGCGAGACCGTGGACGTGGTGGACGACCAG TGGGGCCAGCCGACCTGGACCGTGGATCTGGCACAGCAGATCGTGGCACTCGTCCGG CACGGTGCGTCAGGCGTGTTCCACGGAAAGCGCGGGCGAGGCCACTGGTACGACCTC GCCCGCATGACCTTCCGGCTGCTCGGCGCGGACCCCGGACGAGTGCGCCCGGTGCCC AGCGACCGGATCGCGGCGGTGAACTGCGGCCCCGGTACACGGTGTTGGGGCATGACG CCTGGCGGGAGGCCGGGCTGACACCGATCCGGCACTGGACCACCGCTCTGAGCAGGC GTTCCCCCTGCTGAACGCCGATGAATCGTAGTAGTCCTCGACCGAGAGAAAGGAGGG GCCGCAGATGCGAATTCTGGTG Từ trình tự gen thu cho thấy gen novS gồm 861 bp ( mã hóa cho 287 axit amin ) Khơng thấy trình tự bị gián đoạn (khơng đọc được), có mã mở đầu mã kết thúc, đoạn mồi xuôi mồi ngược So sánh trình tự nucleotide gen novS với trình tự nucleotide số gen có chức dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase ngân hàng gen giới NCBI (thông qua phần mềm Blast Phạm Văn Phú lớp 06-04 22 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Có độ tuơng đồng 100% với gen novS có mã số AAF67512.1 thuộc chủng Streptomyces caeruleus Tuơng đồng 77% với gen có mã số AAN65241.1 thuộc chủng Streptomyces roseochromo Tuơng đồng 76% với gen có mã số AAG29801.1 thuộc chủng Streptomyces sp ACTE ( hình 9) So sánh trình tự axit amin gen novS với trình tự axit amin số gen chức dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase ngân hàng gen giới ta có kết sau: Có độ tuơng đồng 91% với gen novS có mã số AAF67512.1 thuộc chủng Streptomyces caeruleus Tuơng đồng 77% với gen có mã số AAN65241.1 thuộc chủng Streptomyces roseochromo Tuơng đồng 69% với gen có mã số AAG29801.1 thuộc chủng Streptomyces sp ACTE ( hình10) Từ kết so sánh khẳng định đoạn gen novS giải trình tự mẫu gen novS cơng bố ngân hàng gen giới với mã số AAF67512.1 thuộc chủng Streptomyces caeruleus Hình 9: So sánh trình tự nucleotide gen novS với trình tự nucleotide số gen có chức dTDP-4-keto-6-deoxyhexose reductase ngân hàng gen giới NCBI Phạm Văn Phú lớp 06-04 23 Khoa Công Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 10a Hình 10b Phạm Văn Phú lớp 06-04 24 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 10c Hình 12: 10a So sánh trình tự axit amin gen novS với gen mã số AAF67512.1 10b So sánh trình tự axit amin gen novS với gen mã số AAN65241.1 10c So sánh trình tự axit amin gen novS với gen mã số AAG29801.1 3.1.4 Kết chuyển gen novS vào vector biểu pET -32 a(+) Với mục đích thu lượng lớn protein enzym dTDP-glucose reductase tham gia chuyển hóa 4-ketoreduction phân tử đuờng dTDP4-keto 6-deoxyglucose tạo nên đường L –noviose cấu trúc Novobiocin, đoạn gen novS sau nhân dòng giải trình tự đưa vào vector biểu pET 32 a(+) Gen NovS đuợc cắt từ vectơ pGEMnovS NedI EcoRI Sau đựơc tinh nối vào vector biểu pET 32a(+) T4 ADN ligaza Sản phẩm nối biến nạp vào tế bào E.coli BL21 Sau kiểm tra dòng plasmid thể biến nạp E.col BL21 Các dòng E.coli BL21 mang plasmid pETnovS nuôi cấy qua đêm 37 0C mơi trường LB có chứa ampicilin, sau tế bào thu lại đuợc tách cắt plasmid để kiểm Phạm Văn Phú lớp 06-04 25 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội tra Kết điện di gel agarose (hình 11, 12) Kết điện di thu cho thấy gen novS có kích thước tương đương với kích thước gen novS giải trình tự Kết chúng minh việc chuyển gen novS vào vector biểu pET -32a(+) thành cơng Hình 11: Kết chuyển gen novS vào vector biểu pET -32(a+) Trong đó: M: Thang ADN chuẩn Đường chạy 1-5: mẫu plasmid pETnovS cắt enzyme EcoRI Phạm Văn Phú lớp 06-04 26 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 12: Phân tích sản phẩm cắt dòng pETnovS NedI EcoRI gel agaroza Trong đó: M: Thang ADN chuẩn Đường chạy 1-5: Các dòng pETnovS cắt NedI EcoRI 3.2 Thảo luận Như vậy, nghiên cứu thành cơng việc tạo vector tách dịng pGEMnovS, vector biểu pETnovS biến nạp thành công vector tách dịng vector biểu vào vi khuẩn E.coli XL1 Blue, đồng thời giải trình tự gen novS gồm 861 bp mã hóa cho 287 axit amin NovS gen đóng vai trị quan trọng trình sinh tổng hợp protein enzym tham gia tổng hợp đường L-noviose- khâu cuối để tạo nên kháng sinh novobiocin Vì vậy, việc nghiên cứu tạo vector tách dịng để giải trình tự gen thiết kế vector biểu gen novS có vai trị quan trong trình nghiên cứu nghiên cứu kháng sinh novobiocin Trong tuơng lai cần tiếp tục nghiên cứu biểu protein gene novS, phân tích tìm chức protein đường sinh tổng hợp kháng sinh Novobiocin, đồng thời nghiên cứu sâu gen tham gia trình tổng hợp nên đường novoise, điều kiện cần thiết gene tham gia vào Phạm Văn Phú lớp 06-04 27 Khoa Cơng Nghệ Sinh Học Khóa Luận Tốt Nghiệp K13 Viện Đại Học Mở Hà Nội đường sinh tổng hợp nên kháng sinh novobiocin TÀI LIỆU THAM KHẢO PGS.TS Cao Văn Thu (2000) Bài giảng kháng sinh vitamin Liu, C., Smith, B M., Ajito, K., Komatsu, H., Gomez, P L., (1996) Proc.Natr Acad Sci USA, 93, 940-944 Kampranis, S.C., Gormley, N.A., Tranter, R., Orphanides, G and Maxwell, A (1999) Probing the binding of coumarins and cyclothialidines to ADN gyrase Biochemistry 38, 1967- 1976 Hooper, D.C., Wolfson, J.S., McHugh, G.L., Winters, M.B and Swartz, M.N (1982) The effects of novobiocin, coumemycin A1, clorobiocin, and their analogs on Escherichia coli ADN gyrase and bacterial growth Antimicrob Agents Chemother 22, 662-671 Steffensky, M., Muhlenweg, A., Wang, Z.X , Li, S.M and Heide, L (2000) Identification of the novobiocin biosynthetic gene cluster of S spheroides NCIB 11891 Antimicrob Agents Chemother 44, 1214–1222 ^ Steffensky M, Mühlenweg A, Wang ZX, Li SM, Heide L (May 2000) "Identification of the novobiocin biosynthetic gene cluster of Streptomyces spheroides NCIB 11891" Antimicrob Agents Chemother 44 (5): 1214–22 doi:10.1128/AAC.44.5.12141222.2000 PMID 10770754 PMC 89847 http://aac.asm.org/cgi/pmidlookup?view=long&pmid=10770754 Thuy TT, Lee HC, Kim CG, Heide L, Sohng JK (April 2005) "Functional characterizations of novWUS involved in novobiocin biosynthesis from Streptomyces spheroides" Liu, H W., Thorson, J S., (1994) Annu Rew Microbiol., 48, 223256 Weymouth-wilson, A C., (1997) Nat Pro Rep., 14, 99-110 10.Liu, C., Smith, B M., Ajito, K., Komatsu, H., Gomez, P L., (1996) Proc.Natr Acad Sci USA, 93, 940-944 11.Hansen, J L., Ippolito, J A., Ban, N., Nissen, P., Moore, P B., Steitz, T A., (2002) Mol Cell., 10, 117–128 12.http://vi.wikipedia.org/wiki/Enzym_gi%E1%BB%9Bi_h%E1%BA %A1n Phạm Văn Phú lớp 06-04 28 Khoa Công Nghệ Sinh Học ... spheroids tách dịng giải trình tự orfs tạo nên phân tử đường deoxysugar dTDP -noviose Quá trình sinh tổng hợp đường Noviose gồm gen tham gia, gen novV, novT, novW, novS novU Các gen tổng hợp nên... Smith, B M ., Ajito, K ., Komatsu, H ., Gomez, P L ., (1996) Proc.Natr Acad Sci USA, 9 3, 940-944 11.Hansen, J L ., Ippolito, J A ., Ban, N ., Nissen, P ., Moore, P B ., Steitz, T A ., (2002) Mol Cell ., 1 0,. .. trọng trình sinh tổng hợp protein enzym tham gia tổng hợp đường L -noviose- khâu cuối để tạo nên kháng sinh novobiocin Vì vậy, việc nghiên cứu tạo vector tách dịng để giải trình tự gen thiết kế vector