1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG TR N TH THU NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C D CH CHI T THÂN R RI NG R NG NGH AN TRONG DUNG MƠI METHANOL VÀ HEXAN Chun ngành: Hóa H u Cơ Mã s : 60 44 27 TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C Đà N ng - Năm 2011 Cơng trình ñư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Ngư i hư ng d n khoa h c : TS Tr nh Đình Chính Ph n bi n : GS.TS Đào Hùng Cư ng Ph n bi n : PGS.TS T Ng c Đôn Lu n văn ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n văn t t nghi p th c sĩ khoa h c h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 26 tháng năm 2011 * Có th tìm hi u lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin - H c li u, Đ i h c Đà N ng - Thư vi n Trư ng Đ i h c Sư ph m, Đ i h c Đà N ng M Đ U Lí ch n đ tài Trên đ a bàn xóm Tân Hồnh, xã Nghĩa Phúc, huy n Tân Kỳ, t nh Ngh An có m t lo i Ri ng m c hoang mà ngư i dân g i Ri ng r ng, ngư i ñ a phương thư ng s d ng vào nhi u công d ng khác làm gia v , thu c ch a đ y b ng, kích thích tiêu hóa, ch a đau d dày, ch a s t rét, ch ng nôn m a, say tàu xe… Tuy nhiên, cho đ n theo chúng tơi ñư c bi t v n chưa tìm th y tài li u công b v thành ph n hóa h c cơng d ng c a lo i Ri ng mà ngư i dân s d ng chúng ch mang tính kinh nghi m Vì v y chúng tơi ch n đ tài “Nghiên c u thành ph n hóa h c d ch chi t thân r Ri ng r ng Ngh An dung mơi methanol hexan” nh m góp ph n b sung vào thành ph n hóa h c cơng d ng loài thu c chi Ri ng, ñ ng th i góp ph n vào vi c nghiên c a, khai thác s d ng thu c có hi u qu Đ i tư ng m c tiêu nghiên c u 2.1 Đ i tư ng nghiên c u + Tinh d u thân r , r c a loài Ri ng r ng ñư c thu hái vào tháng 10 năm 2009 t i xóm Tân Hồnh, xã Nghĩa Phúc, huy n Tân Kỳ, t nh Ngh An + D ch chi t t thân r loài Ri ng r ng xã Nghĩa Phúc, huy n Tân Kỳ, t nh Ngh An 2.2 M c tiêu nghiên c u + Kh o sát thành ph n hóa h c c a loài Ri ng r ng xã Nghĩa Phúc, huy n Tân Kỳ, t nh Ngh An + Phân l p xác ñ nh c u trúc c a c u t tách t d ch chi t thân r loài Ri ng r ng Ngh An N i dung phương pháp nghiên c u 3.1 N i dung nghiên c u - T ng quan tài li u v đ c m hình thái th c v t, thành ph n hóa h c, ng d ng c a m t s loài chi Ri ng (Alpinia) - Th c nghi m + Chưng c t tinh d u thân r , r Ri ng r ng xác ñ nh thành ph n hóa h c + Xác đ nh thành ph n hóa h c c a d ch chi t thân r loài Ri ng r ng + Phân l p xác ñ nh c u trúc c u t t d ch chi t thân r loài Ri ng r ng 3.2 Phương pháp nghiên c u - Nghiên c u lý thuy t: phương pháp nghiên c u h p ch t t nhiên, - Nghiên c u th c nghi m + Phương pháp tách tinh d u: chưng c t lôi cu n nư c + Phương pháp chi t: phương pháp ngâm chi t, chi t l ng -l ng, chi t b ng dung môi h u có đ phân c c khác + Phương pháp xác đ nh thành ph n hóa h c: s c ký - kh i ph liên h p (GC-MS, LC-MS, EI-MS, ESI-MS) + Phương pháp tách ch t: s c ký b n m ng, s c ký c t, tinh ch , làm giàu + Phương pháp ph xác ñ nh c u trúc ch t: ph UV, 1HNMR, 13C-NMR, DEPT Ý nghĩa khoa h c th c ti n c a ñ tài T th c nghi m nghiên c u trên, lu n văn ñã thu ñư c m t s k t qu v i nh ng ý nghĩa thi t th c sau: - Vi c nh n bi t ñúng xác ñ nh tên khoa h c cho có ý nghĩa r t quan tr ng cơng tác u tra, sàng l c, ki m nghi m dư c li u, s d ng thu c an tồn, h p lí phát tri n tài nguyên thu c - Vi c xác ñ nh hàm lư ng nh m ñ nh hư ng cho vi c quy ho ch khai thác sau - Xác ñ nh thành ph n hóa h c c a tinh d u thân r r Ri ng r ng Ngh An , giúp góp ph n vào vi c phân lo i thu c chi Ri ng (Alpinia) Vi t Nam th gi i - Th ho t tính sinh h c c a d ch chi t thân r ñ ñ nh hư ng cho vi c ng d ng th c t - Phân l p xác ñ nh c u trúc c a c u t tách t d ch chi t thân r loài Ri ng r ng Ngh An nh m bư c đ u tìm hi u c u trúc c a c u t kh ng d ng c a h p ch t tách ñư c B c c lu n văn Ngồi ph n m đ u, k t lu n, tài li u tham kh o ph l c lu n văn g m có chương sau: Chương T ng quan Chương Nh ng nghiên c u th c nghi m Chương K t qu nghiên c u th o lu n CHƯƠNG 1- T NG QUAN 1.1 Khái quát v h G ng (Zingiberaceae) 1.2 Khái quát v chi Ri ng( Alpinia) Ri ng (Alpinia) m t chi l n thu c h G ng (Zingiberacea), hi n có kho ng 230 lồi phân b kh p vùng Đơng Á, Đơng Nam Á, T n Đ đ n Nh t B n [29] 1.2.1 Đ c ñi m hình thái th c v t c a m t s thu c chi Ri ng ( Alpinia) 1.2.2 Công d ng c a Ri ng 1.2.3 Thành ph n hóa h c c a m t s lồi Alpinia nghiên c u 1.2.3.1 Alpinia conchigera Griff.- Ri ng r ng 1.2.3.2 Alpinia zerumbet (Pers.) - Ri ng gió (S nư c, Ri ng d p, Ri ng d i) 1.2.3.3 Alpinia galanga Willd.- Ri ng n p (h ng ñ u kh u) 1.2.3.4 Alpinia chinensis Rosc - Ri ng tàu 1.2.3.5 Alpinia katsumadai Hayt - Th o ñ u 1.2.3.6 Alpinia officinarum Hance - Ri ng (ri ng thu c) 1.2.3.7 Alpinia oxyphylla Miq - Ích trí nhân 1.2.3.8 Alpinia speciosa Schumann - Ri ng m (mè tré bà) 1.2.3.9 Alpinia tonkinenesis Gagnep 1.2.3.10 Catimbium latilabre (Rild.) Holtt - Ri ng gió (mè tré phát) 1.2.3.11 Alpinia breviligulata Gagnep-Ri ng mép ng n 1.2.4 Ho t tính sinh h c c a lồi alpinia nghiên c u 1.2.5 Ngu n gen tri n v ng CHƯƠNG - TH C NGHI M 2.1 Xác ñ nh tên khoa h c cho 2.2 Tìm hi u v Ri ng r ng t nh Ngh An 2.2.1 Hình thái th c v t Ri ng r ng Ngh An Cây th o s ng nhi u năm nh thân r m c bị ngang, hình tr , chia thành nhi u đ t khơng đ u nhau, to 2-4 cm, ñư c bao ph b i v y màu đ nh t, dài 1,8-2,5 cm, hình lịng thuy n, m ng; ru t màu vàng nh t, có mùi thơm, v cay Trên v y có đư ng gân n m song song màu đ đ m Đo n thân r n i gi a v i dài 10-15cm Thân khí sinh m c th ng, cao 1-2 m, có cao hơn, to 5-12 mm Lá hình giáo nh n, thót l i g c, dài 30-40 cm, r ng 7-10 cm, m t khơng lơng, m t dư i có lơng tơ ng n, m n; m t dư i c a gân có lơng thưa Cu ng m nh, dài 6-10 cm, có lơng; mép hình lư i nh , cao 4-10 mm, có v ch ch ngăn gi a; b ti p n i ph n cu ng lá, m nh, có lơng, d c mép b d i h p, m ng, d ng màng C m hoa d ng chùy m c t ng n thân khí sinh (xuyên qua tr c thân gi ), dài 15-30 cm, r ng kho ng 8-10cm, nhi u nhánh sít nhau, tr i ra; mang r t nhi u hoa, có lơng nhung; cu ng hoa có lơng nhung m c đ ng Hoa tr ng, có v ch h ng dài 20-25 mm; tràng có ng ng n khơng vư t qua đài, cánh hoa hình giáo tù, dài 10-15 mm; cánh mơi hình d i xoan ngư c, có móng, phi n b u d c chia thùy chóp Qu hình c u, dài r ng x mm, m i màu xanh, chín chuy n sang đ nâu Ra hoa tháng 6-8, có qu tháng 9-10 2.2.2 Ngu n g c s phân b Cây m c nh ng nơi m, d c su i dư i tán r ng Ngồi ngư i dân cịn tr ng chúng vư n nhà ñ làm gia v , thu c ch a ñ y b ng, kích thích tiêu hóa, ch a đau d dày, ch a s t rét, ch ng nôn m a, say tàu xe Có th thu hái thân r quanh năm 2.2.3 Tính v , tác d ng V cay, tính nóng, có mùi thơm; có tác d ng ki n tỳ giúp tiêu hóa gi m đau; cịn có tác d ng ph n khích, tr ho 2.2.4 Cơng d ng Theo kinh nghi m dân gian đ a phương, b ph n ñư c s d ng thư ng thân r Thân r thư ng ñư c dùng làm gia v , thu c ch a đ y b ng, kích thích tiêu hóa, ch a ñau d dày, ch a s t rét, ch ng nôn m a, say tàu xe 2.3 Thu x lí m u M u đư c l y vào tháng 10, t i xóm Tân Hồnh, xã Nghĩa Phúc, huy n Tân Kỳ, t nh Ngh An M u thân r , r lo i Ri ng r ng Ngh An sau thu hái v ñư c r a s ch, ñ nư c, ti n hành làm theo hư ng sau: - B t tươi thơ thân r đư c ngâm chi t b ng dung mơi MeOH đ thu đư c d ch chi t t ng Ti n hành cô đu i, thu h i dung mơi s có đư c cao chi t t ng T cao chi t t ng ti n hành phân b l n lư t b ng dung mơi có đ phân c c tăng d n t hexan, clorofom, BuOH, EtOH, MeOH Lo i dung môi h u dư i áp su t gi m, thu ñư c c n d ch chi t tương ng - Ti n hành chưng c t tinh d u thân r , r b ng phương pháp c t lôi cu n nư c 2.4 Tách ñ nh lư ng tinh d u 2.4.1 Tách tinh d u Tinh d u ñư c thu b ng phương pháp chưng c t lôi cu n nư c 2.4.2 Đ nh lư ng tinh d u % tinh d u = a.100 % b Trong đó: a: s mL tinh d u thu ñư c chưng c t b: s gam nguyên li u tươi ñã dùng 2.5 Xác đ nh thành ph n hóa h c c a tinh d u Thành ph n hóa h c c a TD thân r , r ñư c xác ñ nh b ng phương pháp s c ký khí - kh i ph liên h p GC/MS Phân tích m u đư c th c hi n t i trung tâm d ch v phân tích thí nghi m (S Khoa h c Công ngh Thành ph H Chí Minh) 2.6 Chi t xu t xác đ nh thành ph n hóa h c c a d ch chi t 2.6.1 Chi t xu t b ng dung môi h u * Chi t ngâm d m Thân r Ri ng r ng Ngh An ñư c ngâm chi t b ng dung mơi MeOH thu đư c cao t ng metanol có d ng s t d o, màu nâu ñ * Chi t l ng - l ng Ti n hành chi t l ng-l ng cao t ng MeOH dung môi khác theo nguyên lý phân b v i dung mơi có đ phân c c tăng d n t hexan (15x100ml), cloroform (15x100ml), BuOH (10x100ml), EtOH MeOH Dung d ch c a l n chi t ñư c gom chung l i, làm khan nư c v i ch t làm khan Na2SO4 C t lo i dung môi b ng máy c t quay thu ñư c cao d ch chi t tương ng 2.6.2 Xác ñ nh thành ph n hóa h c c a d ch chi t Đ i v i d ch chi t hexan, ñư c ti n hành chưng c t lôi cu n nư c thu ñư c ph n bay lôi cu n theo nư c m u kí hi u DTTT1 M u d ch chi t DTTT1 đư c xác đ nh thành ph n hóa h c b ng phương pháp s c ký khí - kh i ph liên h p GC/MS t i Vi n Hóa h c h p ch t thiên nhiên- Vi n Khoa h c Công ngh Vi t Nam Đ i v i ph n cịn l i khơng bay c a d ch chi t hexan đem hịa tan dung mơi hexan ñư c d ch chi t hexan, m u ký hi u DTTT1 m u d ch chi t dung môi BuOH, EtOH, MeOH v i kí hi u m u l n lư t DTTT2, DTTT3, DTTT4 ñư c xác ñ nh thành ph n hoá h c d a LC/MS ESI - MS ñư c ño máy Agilent 6310 Ion Trap, tác nhân b n phá mu i natri t i Vi n Hóa h c h p ch t thiên nhiên - Vi n Khoa h c Cơng ngh Vi t Nam 2.7 Th ho t tính sinh h c c a d ch chi t * Chu n b m u ñ th ho t tính sinh h c: Cao d ch chi t hexan (DTTT1), ñư c ti n hành th ho t tính sinh h c : - Ho t tính ch ng oxi hóa ch ng oxi hóa DPPH - Ho t tính kháng sinh v i ch ng vi sinh : Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa n m Candida albican - Ho t tính gây đ c đ i v i dòng t bào ung thư ngư i: KB (ung thư mơ bi u bì) 2.8 Phân l p xác ñ nh c u trúc m t s c u t d ch chi t 2.8.1 S c ký b n m ng Qua kh o sát nh n th y h Hexan/Etyl axetat v i t l thích h p 100/0 đ n 80/20 có th ñư c áp d ng ñ phân l p m t s c u t t cao hexan 2.8.2 S c ký c t 10 CHƯƠNG - K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 3.1 K t qu xác ñ nh tên khoa h c cho Tên khoa h c: Alpinia conchigera Griff 3.2 Tính ch t c m quan hàm lư ng tinh d u - Tinh ñâu thân r ch t l ng, không màu, mùi thơm n ng, hàm lư ng 0,15% - Tinh ñâu thân r ch t l ng, không màu, mùi thơm nh , hàm lư ng 0,08% K t lu n: V y hàm lư ng TD thân r nhi u r Đi u hoàn toàn phù h p v i k t qu nghiên c u TD Ri ng cơng b trư c 3.3 K t qu thành ph n hóa h c c a tinh d u t thân r , r Thành ph n hoá h c c a TD ñư c xác ñ nh b ng phương pháp GC/MS 3.3.1 Thành ph n hóa h c c a tinh d u thân r K t qu phân tích ñã nh n bi t ñư c 28 h p ch t đ t 98,31% K t qu phân tích ñư c trình bày t i b ng 3.3 B ng 3.3 Thành ph n hóa h c c a TD thân r Alpinia conchigera Griff STT H p ch t Ngh An Th i gian Hàm lư ng lưu (phút) (%) á-cis-Ocimene 4,393 2.53 Beta- pinene 5,210 1.61 Cineole 6,294 32,81 p-Menth-1-en-4-ol 9.211 1,16 p-Menth-1-en-8-ol 9,528 0,95 Phenol,o-allyl-,acetate 12,178 0,39 Acetic acid, geraniol ester 12,645 0,47 11 Cyclohexane,2,4- 12,912 0,34 13,245 2,34 diisipropenyl-1-methyl-1vinyl9 Benzene,4-allyl-1,2dimethoxy- 10 Isocaryophyllene 13,528 11,05 11 2-norpinene,2,6-dimethyl-6- 13,628 2,66 (4-methyl-3-pentenyl)12 (Z)-á-Farnesene 13,895 2,94 13 Alpha-caryophyllene 14,162 1,35 14 1H- 14,595 6,27 Cyclopropa[a]napthalene, 1a,2,3,5,6,7,7a,7boctahydro-1,1,7,7atetramethyl-, (1aR,7R,7aR,7bS)-(+)15 Eremophila-1(10), 11-diene 14,779 1,65 16 1,5-Heptadiene, 6-methyl-2- 14,912 4,35 (4-methyl-3-cyclohexen-1yl)17 Cadina-1(10), 4-diene 15,162 1,83 18 Caryophyllene 15,229 6,75 19 Caryophyllene oxide 16,362 1,71 20 Guaiol 17,029 1,32 21 e-Cadinol 17,329 2,19 22 1á-Cadin-4-en-10-ol 17,512 3,43 23 Eudesm-7(11)-en-4-ol 17,729 1,36 12 24 alpha-Bisabolol 17,896 1,43 25 à-Sinensal 17,979 1,91 26 All- trans-Farnesyl acetate 19,763 1,03 27 Chưa ñ nh danh 19,913 1,69 28 Hexadecanoic acid 21,663 1,58 29 Squalene 31,347 1,58 TS 100 Các s li u thân r b ng 3.3 cho th y, thành ph n hoá h c c a TD Ri ng r ng Ngh secquiterpen v i An ch ch t y u monoterpen là: Cineole (32,81%), Isocaryophyllene(11,05%), caryophyllene (6,75%) Ngồi ra, cịn có h p ch t khác như: 1H-cyclopropa[a]napthalene, 1a,2,3,5,6,7,7a,7b-octahydro-1,1,7,7a-tetramethyl-, (1aR,7R,7aR,7bS)-(+)- (6,27%); 1,5-Heptadiene, 6-methyl-2-(4- methyl-3-cyclohexen-1-yl)- (4,35%); 1á-Cadin-4-en-10-ol (3,43%); (Z)-á-Farnesene (2,94%) v.v… 3.3.1 Thành ph n hóa h c c a tinh d u r K t qu phân tích nh n bi t ñư c 21 h p ch t ñ t 91,95% K t qu phân tích ñư c trình bày t i b ng 3.4 B ng 3.4 Thành ph n hóa h c c a TD r Alpinia conchigera Griff STT H p ch t Ngh An Th i gian Hàm lưu (phút) lư ng (%) á-cis-Ocimene 4,393 1,59 Beta- pinene 5,277 18,49 Cineole 7,261 3,46 Myrcenol 9,527 0,34 13 Cyclohexane,2,4-diisipropenyl-1- 12,894 0,59 methyl-1-vinyl6 Benzene, 4-allyl-1,2-dimethoxy- 13,227 0,58 Isocaryophyllene 13,544 7,27 alpha-Caryophyllene 14,161 0,59 3a,7Methano-3aH- 14,678 15,73 14,811 6,90 cyclopentacyclooctene,1,4,5,6,7, 8,9,9a10 2H-2,4a-Methanonapthalene, 1,3,4,5,6,7-hexahydro-1,1,5,5tetramethyl 11 Chưa ñ nh danh 14,911 0,54 12 Phenol,4-allyl-2-methoxy-, 15,178 0,62 acetate 13 1á,4áH, 10áH-Guaia-5,11-diene 15,328 10,33 14 p-Menth-8-en-2-ol, acetate 16,111 0,57 15 5-Pentadecen-7-yne 16,394 6,90 16 e-Cadinol 17,311 2,64 17 1á-Cadin-4-en-10-ol 17,561 2,04 18 alpha-Bisabolol 17,794 10,80 19 Chưa ñ nh danh 17,961 1,39 20 Chưa ñ nh danh 19,778 2,05 21 FW 306 22,128 1,42 22 Chưa ñ nh danh 23,461 0,53 23 Allopregnane 23,795 0,55 24 Chưa ñ nh danh 26,728 4,08 TS 100 14 Các s li u b ng 3.4 cho th y, thành ph n hoá h c c a TD r Ri ng r ng Ngh An v i ch t là: Beta-pinen (18,49%); 3a,7Methano-3aH-cyclopentacyclooctene,1,4,5,6,7,8,9,9a(15,73%); alpha-Bisabolol (10,80%); 1á,4áH, 10áH-Guaia-5,11diene (10,33%); Methanonapthalene, Isocaryophyllene (7,27%); 1,3,4,5,6,7-hexahydro-1,1,5,5- 2H-2,4atetramethyl (6,90%); 5-Pentadecen-7-yne (6,90%); cineole (3,46%) 3.3.3 So sánh thành ph n tinh d u thân r r B ng 3.5 So sánh thành ph n tinh d u thân r r STT H p ch t 12 Á-cis-Ocimene Beta- pinene Cineole p-Menth-1-en-4-ol p-Menth-1-en-8-ol Phenol,o-allyl-, acetate Acetic acid, geraniol ester Cyclohexane, 2,4-diisipropenyl-1-methyl1-vinylBenzene, 4-allyl-1,2-dimethoxyIsocaryophyllene 2-norpinene, 2,6-dimethyl-6-(4-methyl-3pentenyl)(Z)-á-Farnesene 13 alpha-Caryophyllene 10 11 Hàm lư ng (%) Thân r R 2,53 1,59 1,61 18,49 32,81 3,46 1,16 0,95 0,39 0,47 0,34 0,59 2,34 11,05 2,66 0,58 7,27 - 2,94 - 1,35 0,59 15 14 32 33 34 35 1H-cyclopropa[a]napthalene, 1a,2,3,5,6,7,7a,7b-octahydroEremophila-1(10), 11-diene 1,5-Heptadiene, 6-methyl-2-(4-methyl-3cyclohexen-1-yl)Cadina-1(10), 4-diene Caryophyllene Caryophyllene oxide Guaiol e-Cadinol 1á-Cadin-4-en-10-ol Eudesm-7(11)-en-4-ol alpha-Bisabolol à-Sinensal All- trans-Farnesyl acetate Hexadecanoic acid Squalene Myrcenol 3a,7Methano-3aHcyclopentacyclooctene,1,4,5,6,7,8,9,9a2H-2,4a-Methanonapthalene,1,3,4,5,6,7hexahydro-1,1,5,5Phenol, 4-allyl-2-methoxy-, acetate 1á,4áH, 10áH-Guaia-5,11-diene p-Menth-8-en-2-ol, acetate 5-Pentadecen-7-yne 36 37 FW 306 Allopregnane 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 6,27 - 1,65 4,35 - 1,83 6,75 1,71 1,32 2,19 3,43 1,36 1,43 1,91 1,03 1,69 1,58 - 2,64 2,04 10,80 0,34 15,73 - 6,90 - 0,62 10,33 0,57 6,90 - 1,42 0,55 16 T b ng so sánh cho th y thành ph n hóa h c c a TD thân r r c a loài Riêng r ng Ngh An đ u có ch a m t s monoterpen secquiterpen Cineole, β- Pinen, Caryophyllene, α-Bisabolol K t qu hoàn toàn phù h p v i nghiên c u v thành ph n TD c a lồi Ri ng cơng b Tuy nhiên hàm lư ng thành ph n hóa h c c a TD thân r r có khác Đi u ch ng t hàm lư ng thành ph n hóa h c c a TD ph thu c vào t ng b ph n c a kh o sát 3.4 K t qu th ho t tính sinh h c c a d ch chi t - Đ i v i ho t tính kháng sinh: d ch chi t thân r hexan th hi n ho t tính kháng ch ng vi sinh: Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus v i giá tr IC50 kho ng 34.11-56.80 µg/ml khơng th hi n ho t tính kháng ch ng vi sinh: Salmonella enterica, Escherichia aeruginosa n m Candida albican coli, Pseudomonas IC50 = 256 (µg/ml) - Đ i v i ho t tính đ c t bào: D ch chi t thân thân r Ri ng r ng Ngh An (Alpinia conchigera Griff) hexan m u kí hi u DTTT1 cho ho t tính gây đ c t bào dịng t bào ung thư ngư i: KB (mơ bi u bì) * Đ i v i ho t tính ch ng oxi hóa DPPH : D ch chi t thân thân r Ri ng r ng Ngh An (Alpinia conchigera Griff) hexan m u kí hi u DTTT1 khơng th hi n ho t tính ch ng oxi hóa PDDH 3.5 K t qu xác đ nh thành ph n hóa h c c a d ch chi t thân r Alpinia conchigera Griff Ngh An dung môi h u * K t qu xác ñ nh thành ph n hóa h c c a d ch chi t thân r lồi Alpinia conchigera Griff Ngh An dung mơi hexan 17 D a vào s c kí khí ghép kh i ph GC-MS, TPHH c a d ch chi t thân r Alpinia conchigera Griff dung môi hexan cho th y thành ph n c a d ch chi t thân r Alpinia conchigera Griff dung mơi hexan ch t có th i gian lưu 27,88 phút chi m hàm lư ng r t l n (50,58%) chưa ñư c ñ nh danh Ngồi cịn có m t s c u t khác có hàm lư ng tương đ i cao như: Isoledene (4,60%), β-caryophyllene (2,49%), Cyclohexen, 1-methyl-4-(5methyl-1-methylene-4-(2,15%) 3.6 K t qu xác ñ nh hàm lư ng c u t có d ch chi t Hàm lư ng c u t có d ch chi t ñư c ñư c ti n hành ño s c ký l ng kh i ph liên h p (LC-MS) 3.6.1 K t qu xác ñ nh hàm lư ng c u t có d ch chi t hexan K t qu phân tích LC-MS gi n ñ TIC c a ph kh i cho th y thành ph n hóa h c c a d ch chi t thân r Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff ) Ngh An dung mơi hexan có kho ng c u t , c u t chi m t l cao nh t (57,24%) ng v i th i gian lưu 6,409 phút Ngồi có c u t khác chi m t l cao ng v i th i gian lưu là: 14,662 phút (36,97%), 4,148 phút (3,41%) 3.6.2 K t qu xác ñ nh hàm lư ng c u t có d ch chi t butanol K t qu phân tích LC-MS gi n ñ TIC c a ph kh i cho th y thành ph n hóa h c c a d ch chi t thân r Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff ) Ngh An dung mơi BuOH có kho ng 11 c u t , c u t chi m t l cao nh t (27,3208%) ng v i th i gian lưu 13,716 phút Ngồi có c u t khác chi m t l 18 cao ng v i th i gian lưu là: 10,525 phút (21,8414%), 3,211 phút (14,8048%), 17,720 phút (14,2472%) 3.6.3 K t qu xác ñ nh hàm lư ng c u t có d ch chi t etanol K t qu phân tích LC-MS gi n đ TIC c a ph kh i cho th y thành ph n hóa h c c a d ch chi t thân r Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff ) Ngh An dung mơi EtOH có kho ng c u t , c u t chi m t l cao nh t (25,7863%) ng v i th i gian lưu 3,206 phút Ngoài có c u t khác chi m t l cao ng v i th i gian lưu là: 14,425 phút (22,2830%), 7,394 phút (14,3514%), 10,575 phút (13,8186%), K t qu c th b ng 3.12 3.6.4 K t qu xác ñ nh hàm lư ng c u t có d ch chi t metanol K t qu phân tích LC-MS gi n ñ TIC c a ph kh i cho th y thành ph n hóa h c c a d ch chi t thân r Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff ) Ngh An dung mơi MeOH có kho ng 10 c u t , c u t chi m t l cao nh t (31,6193%) ng v i th i gian lưu 14,244 phút Ngồi có c u t khác chi m t l cao ng v i th i gian lưu là: 10,493 phút (23,4063%), 17,699 phút (15,6592%), 2,882 phút (9,3841%), 2,007phút (9,1005%), * K t lu n: t k t qu k t phân tích LC-MS cho th y thành ph n hóa h c d ch chi t thân r c a thân r Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff ) Ngh An dung mơi hexan, BuOH, EtOH, MeOH đ u có ch a m t s c u t có hàm lư ng cao, d ch dung mơi hexan cho c u t chi m t l r t cao (57,24%) có kh tách cao nh t 19 3.7 K t qu xác ñ nh c u trúc hóa h c c a ch t tách đư c t cao hexan Hình 3.21 Ph Hình 3.22 Ph 13 H-NMR c a ch t THUY-ACG C-NMR c a ch t THUY-ACG 20 Trên ph H-NMR c a ch t r n THUY-ACG có s hi n di n c a c a m t proton olefin cacbon 5,37 (1H, br.s) v i tín hi u 140,2 (s), 122,0 (d) ph C-NMR cho phép d đốn 13 s t n t i c a m t liên k t đơi C=CH- Tín hi u c a nhóm metyl kho ng 0,69-1,01 ppm g n v i cacbon 11,7; 11,9; 18,6; 18,8 (2 cacbon); 19,1 ppm tín hi u dày đ c c a nhi u proton c a cacbon no vùng 1,01-2,42 ppm Ngoài ra, ph doublet H-NMR cịn có vùng tín hi u 3-4 ppm m t 4,41 ppm Chúng d đốn nh ng tín hi u thu c v m t g c ñư ng glucopyranoside, tương ng v i tín hi u 101,0 (d) (cacbon anome), 73,4 (d), 76,3 (d), 70,1 (d), 75,6 (d), 61,8 (t) C u hình c a g c đư ng đư c xác ñ nh β-D-Glucopyranoside d a vào h ng s tương tác (J = 7,5 Hz) c a proton anome T t c ñi u cho phép chúng tơi d đốn ch t m t sterol glucoside So sánh v i s li u ph c a Daucosterol tài li u tham kh o [16], chúng tơi th y có s phù h p t t B ng 3.15 S li u ph 13 C-NMR, DEPT c a THUY-ACG Daucosterol δC (ppm) (125 MHz, Cacbon CDCl3 & CD3OD, TMS) δC (ppm) (125 MHz, Cacbon CDCl3 & CD3OD, TMS) THUY- Daucosterol THUY- Daucosterol ACG [1] ACG [16] 37,1 (t) 36,8 (t) 19 18,8 (q) 18,5 (q) 29,5 (t) 29,0 (t) 20 36,0 (d) 35,6 (d) 79,0 (d) 78,4 (d) 21 18,6 (q) 18,0 (q) 38,6 (t) 38,1 (t) 22 140,2 (s) 139,9 (s) 23 34,0 (t) (khu t) 25,2 (t) 33,4 (t) 25,4 (t) 21 122,0 (d) 121,4 (d) 24 45,7 (d) 45,4 (d) 31,8 (t) 31,4 (t) 25 29,0 (d) 28,6 (d) * 18,1 (q)* 31,8 (d) 31,4 (d) 26 18,8 (q) 50,1 (d) 49,7 (d) 27 19,1 (q)* 18,9 (q)* 10 36,6 (s) 36,2 (s) 28 22,9 (t) 22,5 (t) 11 20,9 (t) 20,5 (t) 12 39,6 (t) 39,3 (t) 13 42,1 (s) 41,8 (s) 1’ 101,0 (d) 100,6 (d) 14 56,7 (d) 56,3 (d) 2’ 73,4 (d) 73,1 (d) 15 24,2 (t) 23,7 (t) 3’ 76,3 (d) 76,1 (d) 16 28,8 (t) 27,7 (t) 4’ 70,1 (d) 69,7 (d) 17 55,9 (d) 55,5 (d) 5’ 75,6 (d) 75,6 (d) 11,1 (q) 6’ 61,8 (t) 61,1 (t) 18 * ** , 11,7 (q)** 29 11,9 (q) ** 11,1 (q) Tín hi u c a g c β-DGlucopyranoside giá tr có th thay ñ i cho c t B ng 3.16 S li u ph H-NMR c a THUY-ACG Daucosterol THUY-ACG δH (ppm) (500 MHz, δH (ppm) (400 MHz, CDCl3 CDCl3 & CD3OD, TMS) H Daucosterol [16] & CD3OD, TMS) 1’ 4,41 (1H, d, J = 7,5 Hz) 4,41 (1H, d, J = 7,8 Hz) 2’ 3,24 (1H, t, J = 6,25 Hz) 3,22 (1H, t, J = 8,3 Hz) 3,28 - 3,48 (3H, m) 3,27 - 3,44 (3H, m) 3’, 4’, 5’ 6’ 3,75 (dd, J = 4,5, 12,0) 3,73 (1H, dd, J = 5,1, 12,0 Hz) 22 3,86 (1H, dd, J = 2,6, 12,0 3,83 (dd, J = 2,5, 12,0) Hz) 3,58 (1H, m) 3,57-3,65 (1H, m) 5,37 (1H, br.s) 5,36-5,39 (1H, m) 18 0,69 (3H, s) 0,70 (3H, s) 19 1,01 (3H, s) 1,03 (3H, s) 21 0,93 (3H, d, J = 6,0 Hz) 0,94 (3H, d, J = 6,4 Hz) 26 0,80 (3H, d, J = 7,0 Hz) 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz)* 27 0,84 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,85 (3H, d, J = 6,5 Hz)* 29 0,85 (3H, m) 0,86 (3H, t, J = 8,3 Hz) * giá tr có th thay đ i cho c t Vì v y, chúng tơi kh ng ñ nh ch t r n phân l p đư c Daucosterol 29 28 21 22 18 20 12 19 H OH 4' 6' 5' HO H HO H H 10 26 27 16 14 1' 25 23 17 13 O 2' 3' 11 24 O OH 15 H Hình 3.25 C u trúc hóa h c c a h p ch t THUY-ACG Daucosterol ñư c xem m t sterol ph bi n, hi n h u nhi u h th c v t khác 23 K T LU N VÀ KI N NGH Trong trình th c hi n đ tài nghiên c u, chúng tơi đ t ñư c m t s k t qu sau: Xác ñ nh ñư c tên khoa h c c a Ri ng r ng t nh Ngh An Alpinia conchigera Griff B ng phương pháp chưng c t lôi cu n nư c ñã xác ñ nh ñư c hàm lư ng ph n trăm tinh d u thân r (0,15%), tinh d u r (0,08%) c a Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff.) t nh Ngh An B ng phương pháp GC/MS ñã xác ñ nh ñư c TPHH c a m u TD thu ñư c b ng cách c t lôi cu n nư c c a thân r tươi r tươi Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff.) t nh Ngh An ñư c thu vào tháng 10 năm 2009) K t qu cho th y thành ph n hóa h c c a TD thân r r c a loài Ri ng r ng t nh Ngh An có ch a m t s monoterpen secquiterpen Cineole, β- Pinen, Caryophyllene, α-Bisabolol K t qu hoàn toàn phù h p v i nghiên c u v thành ph n TD c a loài Ri ng ñã công b Bư c ñ u thăm dị ho t tính sinh h c c a d ch chi t hexan cho th y: d ch chi t thân r hexan th hi n ho t tính kháng ch ng vi sinh: Lactobacillus fermentum, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus v i giá tr IC50 kho ng 34.11-56.80 µg/ml khơng th hi n ho t tính kháng ch ng vi sinh: Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa n m Candida albican IC50 = 256 (µg/ml) D ch chi t thân thân r hexan cho ho t tính gây đ c t bào dịng t bào ung thư ngư i KB (mơ bi u bì), khơng th hi n ho t tính ch ng oxi hóa khơng th hi n ho t tính ch ng oxi hóa PDDH 24 B ng vi c phân tích k t h p LC/MS chúng tơi sơ b xác đ nh đư c TPHH c a d ch chi t thân r hexan, BuOH, EtOH, MeOH: * D ch chi t dung mơi hexan có kho ng c u t , c u t chi m t l cao nh t (57,24%) ng v i th i gian lưu 6,409 phút Ngoài ra, phương pháp GC/MS cho bi t d ch chi t có kho ng 12 ch t, cho th y thành ph n ch t có th i gian lưu 27,88 phút chi m hàm lư ng r t l n (50,58%) chưa ñư c ñ nh danh * D ch chi t thân r dung môi BuOH có kho ng 11 c u t , ñó c u t chi m t l cao nh t (27,3208%) ng v i th i gian lưu 13,716 phút * D ch chi t dung môi EtOH có kho ng c u t , ñó c u t chi m t l cao nh t (25,7863%) ng v i th i gian lưu 3,206 phút * D ch chi t rong dung môi MeOH có kho ng 10 c u t , ñó c u t chi m t l cao nh t (31,6193%) ng v i th i gian lưu 14,244 phút Đã phân l p ñư c ch t b t màu tr ng (kí hi u THUY-ACG) t d ch chi t hexan thân r Ri ng r ng phương pháp ph Ngh An K t h p H-NMR, C-NMR, DEPT, ñã xác ñ nh ñư c c u 13 trúc ch t r n THUY-ACG Daucosterol (C35H60O6) Qua trình nghiên c u đ tài, chúng tơi xin đ ngh : C n ti p t c nghiên c u tồn di n v lồi nghiên c u trư c ñây ch y u t p trung vào b ph n thân r Hơn n a d ch chi t thân r có ho t tính kháng khu n ho t tính gây ñ c t bào ung thư ngư i KB (mơ bi u bì) nên quan tâm nghiên c u Cây Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff.) m t nh ng thu c q có nhi u ng d ng đ i s ng y h c c n có bi n pháp khai thác, s d ng b o t n thích h p ... Dung mơi gi i li Hexan (0,5 lít) Hexan- Etyl axetat = 99 : 1( 0,3 lít) Hexan- Etyl axetat = 98: ( 0,3 lít) Hexan- Etyl axetat = 97 : ( 0,3 lít) Hexan- Etyl axetat = 95 : ( 0,5 lít) Hexan- Etyl axetat... Griff dung môi hexan cho th y thành ph n c a d ch chi t thân r Alpinia conchigera Griff dung mơi hexan ch t có th i gian lưu 27,88 phút chi m hàm lư ng r t l n (50,58%) chưa ñư c đ nh danh Ngồi... c d ch chi t thân r c a thân r Ri ng r ng (Alpinia conchigera Griff ) Ngh An dung môi hexan, BuOH, EtOH, MeOH ñ u có ch a m t s c u t có hàm lư ng cao, d ch dung môi hexan cho c u t chi m t l