1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG THÁI THỊ ÁNH NGỌC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CỦA CHẤT MÀU ANTHOCYANIN CHIẾT TỪ KHOAI LANG TÍM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60.44.27 T T Ó Ó M M T T Ắ Ắ T T L L U U Ậ Ậ N N V V Ă Ă N N T T H H Ạ Ạ C C S S Ĩ Ĩ K K H H O O A A H H Ọ Ọ C C Đà Nẵng - Năm 2011 2 Công trình ñược hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG Người hướng dẫn khoa học: TS. HUỲNH THỊ KIM CÚC Phản biện 1: PGS.TS. LÊ TỰ HẢI Phản biện 2: TS. TRỊNH ĐÌNH CHÍNH Luận văn ñược bảo vệ tại Hội ñồng bảo vệ chấm Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 20 tháng 09 năm 2011 Có th ể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thông tin - Học liệu - Đại học Đà Nẵng - Thư viện trường Đại học Sư Phạm,Đại học Đà Nẵng. 3 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Anthocyanin là hợp chất màu thiên nhiên, thuộc nhóm flavonoid, có màu từ ñỏ ñến tím có nhiều trong rau quả như bắp cải tím, trà ñỏ, quả dâu tằm, vỏ nho, khoai lang tím, ñậu ñen, dâu tây ñỏ . Anthocyanin là thành phần chính trong việc tạo ra màu sắc ñẹp cho các loại hoa quả trong thiên nhiên mà các loại hợp chất màu tổng hợp không thể thay thế. Anthocyanin không những có tác dụng giảm nguy cơ ung thư, kìm hãm sự phát triển của các tế bào gây ung thư mà còn có khả năng chống oxi hóa cao, chống viêm, chống lão hóa và tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể [37]. Anthocyanin cũng ñược các nhà nghiên cứu bước ñầu xác ñịnh có chứa một lượng trong khoai lang tím [1]. Các thành phần có trong khoai lang rất tốt ñối với sức khỏe của con người [46]. Đây cũng là một thành phần quan trọng cần ñược nghiên cứu chọn ñiều kiện nhằm ứng dụng chất màu tự nhiên vào một số sản phẩm thực phẩm. Bên cạnh ñó, hiện nay việc sử dụng tràn lan, không kiểm soát các loại phẩm màu tổng hợp không an toàn trong thực phẩm ở nước ta ñang gây tâm lý hoang man, không tin tưởng ở người tiêu dùng và gây ảnh hưởng xấu, lâu dài ñối với sức khỏe con người, ñang là vấn ñề ñược quan tâm hàng ñầu trong vệ sinh an toàn thực phẩm. Do ñó, việc xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin có nguồn gốc tự nhiên, một số ñặc tính của chúng và các ứng dụng chất màu trong thực phẩm là một vấn ñề cần ñược quan tâm và cấp thiết. Vì lý do trên tác giả luận văn chọn ñề tài “Nghiên cứu thành ph ần của chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím”. 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 4 Nghiên cứu chiết tách, xác ñịnh thành phần hóa học các chất có trong hợp chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xác ñịnh một số chỉ số vật lý có trong nguyên liệu như: ñộ ẩm, hàm lượng kim loại. - Nghiên cứu xác ñịnh hàm lượng anthocyanin có trong khoai lang tím. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hàm lượng anthocyanin chiết từ khoai lang tím như xử lý nguyên liệu, tỉ lệ hệ dung môi, nhiệt ñộ và thời gian chiết tách. - Nghiên cứu quy trình chiết tách quy mô phòng thí nghiệm ñể thu nhận hợp chất màu anthocyanin từ khoai lang tím. - Nghiên cứu xác ñịnh thành phần, cấu tạo các chất có trong hợp chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím. - Khảo sát một số ñặc tính của chất màu anthocyanin: ñộ bền màu, hoạt tính kháng oxi hóa, kháng vi sinh vật. - Thử nghiệm ứng dụng chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím trong pha chế nước giải khát. 4. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Khoai lang tím ñược mua tại chợ Hàn, Thành Phố Đà Nẵng. 5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5.1. Nghiên cứu lí thuyết 5.2. Phương pháp thực nghiệm - Xác ñịnh ñộ ẩm bằng phương pháp trọng lượng - Xác ñịnh hàm lượng kim loại bằng phương pháp quang phổ h ấp thụ nguyên tử. 5 - Phân tích, xác ñịnh thành phần chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím bằng phương pháp sắc ký lỏng – phổ khối liên hợp (LC-MS). - Xác ñịnh hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai. - Xác ñịnh ñộ bền màu của anthocyanin: là phần trăm màu còn lại, là tỷ số giữa ñộ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực ñại ( λ max ) so với ban ñầu. - Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K. và cs (2003). - Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ñược thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện ñại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và Mc Kane, L., &Kandel (1996). 6. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN 6.1. Ý nghĩa khoa học Xác ñịnh ñược thành phần của hợp chất màu anthocyanin chiết từ khoai lang tím. 6.2. Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng ñược quy trình chiết tách anthocyanin từ khoai lang tím với qui mô phòng thí nghiệm. Đồng thời xác ñịnh ñược một số ñặc tính của chất màu anthocyanin có trong khoai lang tím từ ñó mở ra hướng ứng dụng chất màu tự nhiên trong thực tiễn 7. CẤU TRÚC LUẬN VĂN Ngoài phần mở ñầu, kết luận, tài liệu tham khảo và phụ lục trong luận văn bao gồm các chương như sau: - Ch ương 1: Tổng quan lý thuyết - Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận 6 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ KHOAI LANG 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2. Thực trạng phân bố, thu hoạch 1.1.3. Công dụng của khoai lang 1.2. TỔNG QUAN VỀ ANTHOCYANIN 1.2.1. Chiết tách anthocyanin 1.2.1.1. Cơ sở lý thuyết về chiết tách hợp chất màu từ thực vật 1.2.1.2. Chiết tách hợp chất màu anthocyanin Để chiết tách hợp chất anthocyanin dựa trên nguyên tắc chung của quá trình chiết tách các hợp chất flavonoid có chứa chất màu anthocyanin. Flavonoid là những chất màu thực vật, có chứa nhiều nhóm hydroxy tự do hoặc ñã thay thế một phần. Độ hòa tan của flavonoid tùy thuộc vào số nhóm hydroxyl và các nhóm thế khác của chúng. Vì vậy không có một phương pháp chiết xuất chúng, nhưng có một số nguyên tắc chung như sau: - Flavonoid ở hầu hết các bộ phận của cây: rễ, lá, hoa, quả, hạt…Tiến hành sấy khô, tán bột. Cần chú ý các enzyme có thể thủy phân glucoside vì vậy nếu muốn chiết dạng glucoside thì ổn ñịnh nguyên liệu tươi trước khi sấy bằng cách nhúng vào cồn hoặc nước ñun sôi. - Đối với isoflavon, flavanon, ñihydroflavonol, flavol và flavonol có nhiều nhóm metoxy, ít nhóm hydroxy ñều là những chất phân cực yếu, ñể chiết chúng dùng các dung môi phân cực yếu như: benzene, clorofoc, etylacetat. - Các flavon và flavonol có nhiều nhóm hydroxyl, có thể chiết chúng bằng cồn, nước hoặc hỗn hợp. Chiết bằng nước nóng áp dụng 7 tốt ñối với cả polyglucoside và các anthocyanin. Đối với anthocyanin thì cho thêm một lượng nhỏ dung dịch HCl vào nước chiết nóng dưới dạng clorua vì chúng khá bền với nhiệt ñộ. Sau khi dùng dung môi ñể tách, ta thu ñược dịch chiết mà thành phần chính là flavonoid và các thành phần khác. Để loại bỏ các tạp chất và làm giàu hợp chất màu thì tiến hành tách sơ bộ và tách phân ñoạn như sau: - Dùng dung môi có ñộ phân cực khác nhau, không hòa lẫn ñể tách phân ñoạn - Dùng chì ñể kết tủa flavonoid bằng cách hòa tan hỗn hợp vào cồn loãng, cho dung dịch acetat chì vào ñể kết tủa hết flavonoid, lọc, cho kết tủa này vào cồn loãng khuấy ñều sau ñó cho vào trong dung dịch Natri photphat hoặc natri sunfat, natrisufit ñể kết tủa chì. - Dùng than hoạt tính cho vào dung dịch ñể hấp thụ flavonoid. Sau ñó rửa than bằng dung môi ñể thu lại flavonoid. Có thể dùng dung môi lần lượt có ñọ phân cực từ yếu ñến mạnh ñể tách phân ñoạn. - Tách bằng sắc ký cột: thường dùng các chất hấp phụ là silicagel G, bột polyamid thường hoạt hoá ở 1200 0 C trong một hoặc hai giờ. 1.2.2. Anthocyanin trong thiên nhiên 1.2.3. Cấu trúc và ñặc tính của anthocyanin 1.2.3.1. Cấu trúc của anthocyanin 1.2.3.2. Tính chất quang phổ của anthocyanin 1.2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng ñến ñộ bền màu anthocyanin 1.2.3.4. Hoạt tinh sinh học của anthocyanin 1.3. ỨNG DỤNG CỦA ANTHOCYANIN 8 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU Khoai lang tím ñược mua tại chợ Hàn –Thành Phố Đà Nẵng. Tên khoa học: Ipomoea batatas 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hóa chất 2.2.2. Thiết bị thí nghiệm 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Chọn mẫu và xử lý mẫu 2.3.2. Phương pháp xác ñịnh ñộ ẩm Sấy nguyên liệu ở 100 0 C ñến khối lượng không ñổi ñể xác ñịnh ñộ ẩm của nguyên liệu 2.3.3. Phương pháp xác ñịnh hàm lượng kim loại Dùng phương pháp quang phổ hấp phụ nguyên tử ñể xác ñịnh hàm lượng kim loại: Hg, Pb, As, Cd, Cu, Zn, Sb có trong khoai lang tím. 2.3.4. Phương pháp xác ñịnh hàm lượng anthocyanin Sử dụng phương pháp pH vi sai (the pH diffrential method). 2.3.5. Phương pháp xác ñịnh thành phần, cấu tạo một số chất chính trong hợp chất màu anthocyanin Để xác ñịnh thành phần, cấu tạo các chất có trong hợp chất màu anthocyanin ta sử dụng phương pháp phổ khối lượng viết tắt là MS (Mass Spectrometry). 2.3.6. Phương pháp xác ñịnh ñộ màu anthocyanin Độ màu anthocyanin ñược tính theo công thức. % màu còn lại = 0 D D .100% 9 Trong ñó: + D: ñộ hấp thụ của mẫu ở λ max tại thời ñiểm ño + D 0 : ñộ hấp thụ của mẫu ở λ max lúc ban ñầu . 2.3.7. Phương pháp xác ñịnh hoạt tính chống oxy hóa Phương pháp ñược tiến hành theo phương pháp dựa trên nguyên tắc: Sử dụng phương pháp thử nghiệm trên phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate), tại Phòng sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. 2.3.8. Phương pháp xác ñịnh hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật dựa trên nguyên tắc: hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ñể ñánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết ñược tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp hiện ñại của Vander Bergher và Vlietlinck. 10 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU CỦA KHOAI LANG TÍM 3.1.1. Xác ñịnh ñộ ẩm của khoai lang tím Độ ẩm trung b.ình của khoai lang tím tươi là 79,579%. 3.1.2. Xác ñịnh hàm lượng kim loại Khoai lang tím ñược ñem ñi xác ñịnh hàm lượng kim loại: Hg, Pb, As, Cd, Cu, Zn, Sb… bằng các phương pháp AOAC. Kết quả trình bày ở bảng 3.2. 3.1.3. Xác ñịnh hàm lượng anthocyanin 3.1.3.1. Xác ñịnh bước sóng cực ñại của anthocyanin Anthocyanin chiết từ khoai lang tím có bước sóng hấp thụ cực ñại là 529nm như hình 3.2 Hình 3.2. Phổ hấp thụ của dung dịch