Phần I : Cơ sở lý thuyết HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng . Phần I : Cơ sở lý thuyết 1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) . 2- Nguyên tắc của quá trình s ắc ký trong c ột : Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký . Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo . Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion . Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết . Phần I : Cơ sở lý thuyết Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử . Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha độüng . Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác . Cháút phán têch A +B+C Pha ténh Pha âäüng F2 F3 F1 Phần I : Cơ sở lý thuyết Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) .và ngược lại . Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định .còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn . Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột . Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột . ( như hình dưới đây ) Phần I : Cơ sở lý thuyết : Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký Thời gian A B Pha động Phần I : Cơ sở lý thuyết 3 - Phân loại s ắc ký : Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loaüi như sau : 3.1 Sắc ký hấp phụ : Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ : + Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực . + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực . Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi. Phần I : Cơ sở lý thuyết Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP ) Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị tương ứng như sau : L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 µm Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH 2 ,CN . . vv Phần I : Cơ sở lý thuyết 4 - Các đại lượ ng đặc trư ng c ủa s ắc ký đ ồ Kết quả của quá trinh tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký đồ như hình trên Phần I : Cơ sở lý thuyết to t’r 2 t’r 1 tr 1 tr 2 To : Thời gian lưu chết t’r 1 : Thời gian lưu thực chất A t’r 2 : Thời gian lưu thực chất B tr 1 : Thời gian lưu chất A tr 2 : Thời gian lưu chất B Phần I : Cơ sở lý thuyết Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra để dánh giá một quá trình sắc ký .Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lơiü cho quá trình phân tích sắc ký. 4.1 Thờ i g ian lưu thự c t’r : Rete ntio n time Thờ i gian lưu của một chất là thờ i gian tính từ khi bơ m mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thờ i gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thờ i gian lư u s ẽ khác nhau trên cùng một điều kiện s ắc ký đã chọn .Vì vậy thờ i gian lưu là đại lượ ng để phát hiện định tính các chất. Thờ i gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố : + Bản chất s ắc ký của pha tĩnh. + Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động + Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan + Trong một s ố trườ ng hợ p thờ i gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động . [...]... tiờm mu Phn I : C s lý thuyt 5 Phõn lo i s c ký v ng d ng : +Theo c ch chia tỏch ca sc ký ,ngi ta phõn ra cỏc loi sau õy : Sc ký hp ph ( NP - HPLC v RP - HPLC) ; sc ký phõn b - sc ký chit ( LLC); sc ký trao i ion ( IE - HPLC) ; sc ký rõy phõn t - sc ký gel ( IG - HPLC) Nhng thc t hiờn nay chỳng ta hin ch ang ng dng sc ký hp ph vo phõn tớch mu 5.1 S c ký hp p h : * Quỏ trỡnh sc ký da trờn s hp ph mnh... C s lý thuyt 4.3 - c h n l c : chn lc cho bit hiu qu tỏch ca h thng sc ký ,khi 02 cht A ,B cú KA v KB khỏc nhau thỡ mi cú kh nng tỏch ,mc tỏch biu th chn lc = KB / KA Vi iu kin KB >KA vi cng khỏc 1 thỡ kh nng tỏch cng rừ rng =1.02 =1.16 =1.20 Phn I : C s lý thuyt 4.2 S a lý thuy t N: S a lý thuyt l i lng biu th hiu nng ca ct trong mt iu kin sc ký nht nh Mi a lý thuyt trong ct sc ký ging... mỏy sc ký s ngng hot ng Trong bt c trng hp no nờu trờn cng cho kt qu phõn tớch sai Phn II: H thng HPLC II.3- Pump Cao ỏp : - Mc ớch bm pha ng vo ct thc hin quỏ trỡnh chia tỏch sc ký Pump phi to c ỏp sut cao khong 3000-6000 PSI hoc 250 at n - 500 at ( 1at = 0.98 Bar) v pump phi to dũng liờn tc Lu lng bm t 0.1 n 9.999 ml/phỳt (hin nay ó cú nhiu loi Pump cú ỏp sut rt cao lờn n 1200 bar) - Mỏy sc ký lng... H thng HPLC I- Mỏy HP:C gm cỏc b phn c bn c túm tt trờn s sau : Column Degasse Pump Tiớm mu Detector Phn II: H thng HPLC Trong ú : 1- Bỡnh cha dung mụi pha ỹng 2- B phn kh khớ 3- Bm cao ỏp 4-B phn tiờm mu ( bng tay hay Autosample) 5-Ct sc ký ( Pha tnh ) ( ngũai mụi trng hay trong b iu nhit ) 6- Detector ( nhn tớn hiu ) 7-H thng mỏy tớnh gn phn mm nhn,tớn hiu v s lý d liu v iu khin h thng HPLC 8-... cht tan ra khi ct S tỏch mt hn hp ph thuc vo tớnh cht ng hc ca cht hp ph Trong loi ny cú 02 kiu hp ph: Phn I : C s lý thuyt + S c ký hp ph pha thun (NP -HPLC) : Pha tnh phõn c c ,pha ng khụ ng phõn c c + S c ký hp ph pha o ( RP - HPLC) : Pha tnh khụ ng phõn c c pha ng phõn c c Lo i s c ký ny c ỏp dng rt r ng rói ,thnh c ụ ng tỏc h c ỏc h n h p c ỏc c ht c ú tớnh c ht g n t ng t nhau v thu c lo... tiờu chun Phn II: H thng HPLC Lu ý : - Tt c cỏc dung m ụi dựng cho HPLC u phi l dung m ụi tinh khi t v cú ghi rừ trờ n nhón l dựng cho HPLC Hay dung m ụi tinh khi t phõn tớch - Tt c cỏc húa cht dựng pha m u v pha h m phi c s dng l húa cht tinh khi t p hõn tớc h Nhm mc ớch trỏnh hng ct sc ký hay nhiu ng nn,to ra cỏc Peak tp trong quỏ trỡnh phõn tớch Phn II: H thng HPLC II.2 B kh khớ Degasse... cng c xỏc nh Phn I : C s lý thuyt 4.2 S a lý thuy t N: S a lý thuyt N c tớnh theo cụng thc sau : N =5,54 ( tR / W0,5)2 Trong ú : tR : Thi gian lu ca cht phõn tớch W0,5 : rng ti im 1/2 ca Peak Trong thc t N nm trong khong 2500 n 5500 l va Phn I : C s lý thuyt 4.3 p hõn g ii R : ( Re s o lutio n ) phõn gii l i lng biu th tỏch ca cỏc cht ra khi nhau trờn mt iu kin sc ký ó cho phõn gii ca 02... Peak trờn sc ký thu c T c tớnh bng t s rng ca 02 na Peak ti im 1/10 chiu cao Peak : T = a/b a b Peak dng ụùi xng hỡnh Gauss trờn thc t khú t c vỡ vy phi quan tõm n h s khụng i xng T, Phn I : C s lý thuyt 4.4H s khụ ng i x ng T : ( Tailing fac to r) * Khi T 2.5 thỡ phộp nh lng c chp nhn * Khi T > 2.5 thỡ im cui ca Peak rt khú xỏc nh ,vỡ vy phộp nh lng cn phi thay i cỏc iu kin sc ký lm cho Peack... cú chiu cao l H ,Tt nhiờn lp ny cú tớnh cht ng tc l mt khu vc ca h phõn tỏch m trong ú mt cõn bng nhit ng hc c thit lp gia nỡng trung bỡnh ca cht tan trong pha tnh v pha ng B dy H ph thuc vo nhiu yu t : +ng kớnh v hp ph ca ht pha tnh +Tc v nht ( phõn cc )ca pha ng +H s khuych tỏn ca cỏc cht trong ct Vỡ vy vi mt iu kiờn sc ký xỏc nh thỡ chiu cao H cng hng nh i vi mt cht phõn tớch v s a lý thuyt... khụng chớnh xỏc ,lỳc ny phi tỡm cỏch tng R theo 03 cỏch sau: * Lm thay i K bng cỏch thay i lc ra gii ca pha ng ( Thay i phõn cc nu l RP - HPLC ,thay ụới cng ion nu l IE - HPLC ) * Lm tng s a lý thuyt ca ct bng cỏch dựng ct di hn hoc ct cú kớch thc nh hn Phn I : C s lý thuyt 4.3 p hõn g ii R : ( Re s o lutio n ) * Lm tng chn lc bng cỏch dựng ct khỏc phự hp hn vi quỏ trỡnh tỏch hoc thay i thnh phn . NP - HPLC và RP - HPLC) ; sắc ký phân bố - sắc ký chiết ( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc ký rây phân tử - sắc ký gel ( IG - HPLC) .Nhưng thực. sở lý thuyết 4.2 Số đ ĩa lý thuy ế t N: Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết