đặt vấn đề Berberin alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có nhiều loại thuốc Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác Berberin chủ yếu thân rễ vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1] Berberin đợc biết đến với tác dụng bật kìm khuẩn tả E.coli, điều trị bệnh lỵ Thuốc đợc sử dụng phổ biến giá thành thấp an toàn, không ảnh hởng tới phát triển bình thờng vi khuẩn có ích ruột Hiện thị trờng có dạng bào chế Berberin nh: thuốc nhỏ mắt, viên nén, viên bao Vì vấn đề kiểm tra chất lợng nguyên liệu làm thuốc nh thành phẩm quan trọng Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên liệu chế phẩm viên nén Berberin phơng pháp đo quang phổ hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberin HPLC Để có sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, đà tiến hành thực đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III với mục tiêu sau: Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III So sánh hai phơng pháp định lợng để tìm phơng pháp thích hợp cho việc định lợng berberin sở kiểm tra chất lợng thuốc nớc PHầN I TổNG QUAn 1.1 vµi nÐt VỊ BERBERIN: 1.1.1 CÊu tróc: Beberin lµ mét alcaloid thùc vËt thuéc nhãm isoquinolin cã khung protoberberin[1] Isoquinolin đợc gọi benzo[c] pyridin hay 2- benzamin hợp chất hữu thơm heterocyclic[18] Cấu trúc isoquinolin Công thức cấu tạo: Công thức phân tử: C20H18NO4+ Tên khoa học : PTL: 336.36 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a – azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6] 1.1.2 Nguån gèc: Berberin thờng có rễ, thân rễ, thân, vỏ c©y thuéc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18] Berberin có nhiều thân rễ vàng đắng với tû lƯ 1,5-3%, berberin chiÕm Ýt nhÊt lµ 82% so với alcaloid toàn phần [9] Berberin thờng có lẫn tạp chất alcaloid khác nh: palmatin, jatrorrhizin Giới hạn tạp chất palmatin không 2%, jatrorrhizin không % [6],[13] 1.1.3 TÝnh chÊt - Bét kÕt tinh mµu vàng, không mùi, có vị đắng Tan nớc nóng, khó tan ethanol nớc lạnh, khó tan cloroform, không tan ether.[6] 1.5 Tác dụng dợc lý: - Berberin có tác dụng kháng vi trùng nh: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu liên cầu khuÈn), thÓ protozoal, vi nÊm, candida, virus, nÊm men, kÝ sinh trïng g©y bƯnh (kÝ sinh trïng sèt rÐt, kÝ sinh trùng đờng ruột) [12], [17] - Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả E.coli, đặc biệt dùng không ảnh hởng tới phát triển bình thờng cđa hƯ vi khn cã Ých ë rt, dïng phối hợp với số thuốc kháng sinh hạn chế tác dụng phụ gây thuốc kháng sinh ®èi víi hƯ sinh vËt ®êng rt [17] - Berberin có tác dụng ức chế tiết ion lòng ruột, ức chế co cơ, giảm cholesterol trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế nhịp nhanh thất, giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu bệnh nhân xuất huyết, giảm tiểu cầu tiên phát thứ phát, kích thích tiết mật thải trừ bilirubin[17] Chỉ định: [9],[12],[17] - Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật đặc biệt bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt - Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ kích thích bên ngoài( nắng, gió, lạnh, bụi, khói) điều trị bệnh đau mắt hột - Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas 1.1.6 Chống định: [17] - Phụ nữ có thai khả gây co bóp tử cung berberin - Ngời dị ứng với berberin ( gặp) 1.1.7 Dạng thuốc hàm lợng: [11] - Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lợng 10 mg, 50-100 mg/ viên - Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ kích thích bên (gió, nắng, lạnh, bụi, khói) 1.2 Một số phơng pháp định lợng Berberin: 1.2.1 Phơng pháp thể tích: [5], [13] Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào cốc với 150ml nớc sôi Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml Lấy xác 50ml dung dịch kali dicromat 0,1N thêm nớc tới vạch Lắc phút, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu Lấy xác 100ml dịch lọc cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau thêm 10 ml dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, ®Ĩ vµo bãng tèi 10 Chn ®é b»ng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm tơng đơng thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột tiếp tục chuẩn độ màu xanh biến dừng Song song tiến hành làm mẫu trắng điều kiện 1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tơng ứng với 12,39 mg C20 H18NO4Cl 1.2.2 Phơng pháp đo UV-vis Phơng pháp 1:[6] * Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm hòa tan 200ml nớc cách đun nóng Sau làm lạnh thêm nớc đến 1000ml Lấy 10ml dung dịch pha loÃng với nớc đến 100ml * Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử chuẩn đà sấy khô 1100C giờ, hòa tan nớc Thêm 10ml dung dịch acid sulfuric 1N thêm nớc vừa ®đ 1000ml * §o ®é hÊp thơ: §o At As dunh dịch thử dung dịch chuẩn bớc sóng 421 nm * Cách tính: Lợng ( mg) C20H18NO4Cl đợc tính công thức sau: P= At ì ìa As 1,006 a: khối lợng ( mg) kali dichromat Phơng pháp [6] Xác định hàm lợng berberin clorid viên nén * Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình nghiền thành bột mịn Cân xác lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mg berberin clorid, thêm 10ml nớc để thấm bột viên, sau thêm khoảng 200ml nớc sôi, khuấy kĩ phút, để nguội chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nớc tới vạch, lắc Để lắng tự nhiên đem ly tâm Lấy xác 5ml dung dịch ®em pha lo·ng víi níc cÊt võa ®đ 100ml * Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid * Mẫu trắng: nớc cất * Tiến hành đo độ hấp thụ dung dịch thử chuẩn điều kiện bớc sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy cm 1.2.3 Phơng pháp cân [5] áp dụng để định lợng viên nén berberin clorid, dựa khả tạo tủa berberin với acid picric Cân 20 viên nghiền thành bột mịn Cân xác lợng bột viên tơng ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, thêm methanol đến ngấn Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu Lấy 100ml dịch lọc Làm bay khô cách thủy, thêm 150ml dung dịch NaOH 0,1N 90ml nớc, đun nóng Lắc kỹ để hòa tan Để nguội lọc qua giấy lọc đà thấm ớt Rửa phễu giấy lọc lần, lần 10ml nớc Gộp dịch lọc nớc rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N tiếp tục cho từ từ 30ml dung dịch bÃo hòa acid picric ( TT) Lắc Để yên qua đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đờng kính lỗ xốp 10 16 àm ( đà cân bì) để lấy tủa Rửa tủa lần với nớc cất khoảng 150C, lần 15ml nớc, hút kiệt nớc sấy khô phễu tủa 1000C đến khối lợng không đổi Khối lợng tủa xác định P (g) g tđa t¬ng øng víi 0,6586 g C20H18NO4Cl 1.2.4 Phơng pháp HPLC Phơng pháp 1:[14], [15] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x mm) đợc nhồi hạt silicagel đà đợc octadecylsilan hóa có đờng kính àm - Nhiệt độ cột: 400C - Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat 1,7g natri laurylsulfat 1000 ml hỗn hợp dung môi nớc acetonitril (1:1) - Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng cho thêi gian lu cđa berberin kho¶ng 10 - Detector UV ë bíc sãng 345 nm - ThĨ tÝch tiêm: 10 àl - Nồng độ dung dịch thử chuẩn: 0,1mg/ml cách tiến hành pha dung dịch giống * Tiến hành: Lần lợt tiêm dung dịch thử chuẩn Dựa vào đáp ứng pic berberin dung dịch thử , chuẩn hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng berberin chế phẩm * Cách tính: Lợng Wt (mg) berberin clorid (C20H18ClNO4) Wt = Ws x (At / As) Ws = Lỵng (mg) cđa berberin chn, tÝnh theo lỵng khan Phơng pháp 2: [13] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột đợc nhồi hạt silicagel đà đợc octadecylsilan hóa - Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chøa 0,2% triethylamin, ®iỊu chØnh tíi pH 3,0 b»ng acid phosphoric] vµ acetonitril (60:40) - Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút - Detector UV ë bíc sãng 263 nm - ThĨ tÝch tiªm: 20 àl - Nồng độ dung dịch chuẩn thử: 32 àg/ml * Tiến hành: Lần lợt tiêm dung dịch thử chuẩn Dựa vào đáp ứng pic berberin dung dịch thử, chuẩn hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng berberin có chế phẩm Phơng pháp 3: [16] * Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( àm, 25 cm x 4,6 mm) - Pha ®éng: Acid phosphoric 0,04 mol/l acetonitril ( 58: 42) - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Detector UV ë bíc sãng 349 nm * TiÕn hành: Tơng tự nh phơng pháp HPLC đà trình bày 1.3 Tổng quan Phơng pháp hplc 1.3.1 Nguyên tắc Phơng pháp HPLC phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách định lợng thành phần hỗn hợp dựa lực khác chất với pha tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu cao) pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch hỗn hợp chất cần phân tích đa vào cột, chúng đợc hấp phụ phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào chất cột chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi pha động bơm với áp suất cao tùy thuộc vào lực chÊt víi hai pha, chóng sÏ di chun qua cét với vận tốc khác dẫn đến phân tách Các chất sau khỏi cột đợc phát phận phát gọi detector đợc chuyển qua xử lý kết Kết cuối đợc hiển thị hình đa máy in [8] 1.3.2 Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách kỹ thuật HPLC trình vận chuyển phân bố chất tan pha khác Khi pha động di chuyển với tốc độ định qua cột sắc ký đẩy chất tan bị pha tĩnh lu giữ khái cét Tïy theo b¶n chÊt pha tÜnh, chÊt tan dung môi mà trình rửa giải tách đợc chất khỏi cột sắc ký Nếu ghi trình tách sắc ký, có sắc đồ [8], [11] 1.3.3 Các thông số đặc trng trình sắc ký: Kết trình sắc kí đợc detector phát hiện, phóng đại ghi thành sắc ký đồ( hình 1): t R2 t R1 to W 0.5-1 t' R1 W 0.5-2 W b1 W b2 t' R2 Hình 1: sắc ký đồ chất thông số đặc trng Trong : to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách tR (thời gian lu): thời gian kể từ chất cần phân tích đợc bơm vào cột xuất đỉnh pic chất cần phân tích tR (thời gian lu thực ) = tR- to W0,5: §é réng pic ë nưa chiều cao Wb: Độ rộng đáy pic 1.3.2.1 Hệ số dung lỵng k’ k' = t' t R = tR − t0 t 0 = t t [8] R − NÕu k' nhá th× tR cịng nhá tách Trong thực tế k' nằm khoảng - tốt Hai chất đợc tách khỏi chúng có giá trị khác 1.3.2.2 Độ chọn lọc (selectivity - factor) k' = t − t α= k' t − t R2 R1 (k2' > k1' ) [4], [8] khác nhiều khả tách rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 1.3.2.3 Độ phân giải (resolution) Đặc trng cho mức độ tách hai chất khỏi điều kiện sắc ký Độ phân giải pic cạnh đợc tính theo công thức: R= ( t R ,B − t R ,A w +w B A ) = 1,18( t − t ) = R ,B w 1/ 2B R ,A + w1 / A N  α −   k'B       α   1+ k'B [4], [8] Độ phân giải đạt đợc R = 1,5 1.3.2.4 Hệ số bất ®èi AF Cho biÕt møc ®é c©n ®èi cđa pic sắc ký, đợc tính theo công thức: AF = w / 20 2a [4], [8] Trong ®ã: W1/20: chiều rộng pic đợc đo 1/20 chiều cao pic a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng cong phía trớc vị trí 1/20 chiều cao pic Khi AF nằm khoảng 0,5-2,5 phép định lợng đợc chấp nhận, AF tăng lên tợng kéo đuôi rõ Hiện tợng đỉnh kéo đuôi (tailing peak) tơng tác chất cần phân tích pha tĩnh cột sắc ký bẩn Đỉnh kÐo tun tríc (fronting peak) cã thĨ lỵng mÉu đa vào lớn so với lực cột [7] 1.3.2.5 Số đĩa lý thuyết N Đặc trng cho hiệu lùc cét N = 16  tR     wB hay N=5,54  tR    w / 2B   [4], [8] NÕu gọi L chiều cao cột sắc ký, chiều cao đĩa lý thuyết H đợc tính công thøc: H= L N 10 ... Hàm lợng Beberin clorid bột nguyên liệu 86,24% 0,40% 2.2.2 Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin clorid nguyên liệu phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV- VIS theo DĐVN III 2.2.2.1./Tính xác : 21... bËc tù K = n1+n2-2 2.2 KÕt qu¶ thùc nghiƯm : 19 2.2.1 Định lợng Berberin clorid nguyên liệu phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV- VIS theo DĐVN III * Cách tiến hành : + Dung dịch thử : Cân 0,200 g... Phơng pháp sử dụng thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ hấp thụ UV- VIS 2.1.2.3.Phơng pháp xử lý số liệu thống kê: Dữ liệu thu đợc đợc xử lý phơng pháp thống kê - sử dụng công cụ hỗ trợ phần mềm Microsoft