Trờng đại học vinh Khoa sinh học ====***==== Lại thị minh Nghiên cứu và sử dụng nấm bạch cơng (Beauveria bassiana) phòng trừ sâu hại lạc tại Nghi Đức - Thành phố Vinh - Nghệ An Khóa luận tốt nghiệp đại học Ngành s phạm sinh học Vinh - 2010 1 MỞ ĐẦU 1. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu đề tài Cây lạc (Arachis hypogela L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, cây thực phẩm có giá trị kinh tế cao và ngày càng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển Kinh tế Nông nghiệp. Tất cả các bộ phận của cây lạc đều có giá trị sử dụng mà chủ yếu là hạt lạc với 44 - 56% lipit, 25 - 34% protein, 6 - 22% gluxit, các loại vitamin và chất khoáng. Bởi vậy lạc là nguồn bổ sung quan trọng các chất đạm, chất béo cho con người (Lê Song Dự, Nguyễn Thế Côn, 1979) [6]. Mặt khác, lạc là cây họ đậu (Fabaceae) có tác dụng cải tạo đất do cây lạc có khả năng cố định Nitơ tự do trong khí trời, nhờ sự cộng sinh của vi khuẩn Rhizobium vigna trong các nốt sần. Từ các nốt sần cung cấp một lượng đạm đáng kể cho cây và những cây trồng vụ sau, nhờ vậy cây lạc góp phần cải tạo và nâng cao độ phì của đất. Lạc là cây trồng nhiệt đới có khả năng thích ứng rộng và không yêu cầu quá khắt khe về kĩ thuật nên được trồng rộng rãi rất nhiều nơi trên thế giới. Trong số 25 nước trồng lạc ở Châu Á, Việt Nam đứng thứ 5 về sản lượng nhưng năng suất còn thấp. Tuy vậy tiềm năng phát triển của cây lạc ở nước ta còn rất lớn, diện tích của cả nước có thể lên đến 40 – 50 vạn/ha với hai vùng trồng lạc hàng hóa lớn là Nghệ Tĩnh và Đông Nam Bộ [22]. Tại Nghệ An lạc là 1 trong 3 cây công nghiệp ngắn ngày chủ lực, sản lượng hàng năm mang đến cho người sản suất tương đương với 9 tấn thóc (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2000). Từ năm 1996 đến nay, diện tích và năng suất lạc của tỉnh không ngừng tăng lên và có khả năng mở rộng diện tích tới 35000 ha (Cục thống kê Nghệ An, 1999) [1]. 2 Cũng như các cây trồng khác, cây lạc bị nhiều loại sâu phá hại, đặc biệt là sâu khoang, sâu xanh, sâu cuốn lá lạc, châu chấu…. Theo wynnigor (1962), đối với cây lạc sản lượng giảm do sâu hại là 17,1%, do bệnh 11,5%, do cỏ dại 11,8%. Bởi vậy làm giảm những thiệt hại do sâu bệnh gây ra là góp phần tăng năng suất lạc. Để bảo vệ cây lạc và tăng năng suất, hiện nay ở Nghệ An biện pháp được sử dụng phổ biến nhất để trừ các loài sâu hại là sử dụng thuốc hóa học. Thực hiện biện pháp hóa học cho hiệu quả cao, nhanh, đơn giản và dễ sử dụng. Nhưng bên cạnh những lợi ích trước mắt đó thì ngày càng bộc lộ mặt trái của nó như: Ô nhiễm môi trường, tính kháng thuốc của sâu hại, bùng phát dịch hại mới, dư lượng thuốc hóa học trong các sản phẩm nông nghiệp làm mất cân bằng sinh thái, tác động xấu đến sức khỏe con người. Chính vì thế các nhà khoa học đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật từ nấm kí sinh côn trùng. Hiện nay trên thế giới đã nghiên cứu và sử dụng thành công các loại nấm để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng như nấm Metarhizium ansopliae, Beauveria bassiana, Hirsutella thompsonii .[26]. Trong đó nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) có tầm quan trọng đặc biệt bởi theo Rehner SA, Buckley E (2005) [32], Donald G, McNeil (2005) [28] nấm diệt được loại côn trùng ở nhiều loại cây trồng khác nhau, mối, mọt, muỗi sốt rét và không lây nhiễm sang người và động vật. Và từ lâu trong y học Việt Nam cũng dùng tằm vôi (tằm nhiễm nấm trắng Beauveria) để chữa chứng bệnh tai biến mạch máu não (Đông y Việt Nam 9.9.2006). Trong những năm gần đây nước ta đã có một số công trình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) trong phòng trừ rầy nâu (N.lugens) hại lúa, sâu đo xanh (A. Flava) hại đay, sâu róm hại thông các tỉnh phía bắc (Phạm Thị Thùy và cs, 1997) [20] và phòng trừ cao đối với nhện hại thực vật (Nguyễn Văn Đĩnh, 3 2000) [31]. Tuy nhiên các công trình trước đây chỉ tập trung nghiên cứu và sử dụng nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) để phòng trừ sâu hại rau, sâu róm hại thông, mối, mọt .chưa có công trình nào nghiên cứu sử dụng nấm nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) để phòng trừ sâu hại lạc. Với ý nghĩa đó và mong muốn tìm hiểu thêm về nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) đối với khả năng diệt sâu hại lạc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu và sử dụng nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) phòng trừ sâu hại lạc tại Nghi Đức – Thành phố Vinh - Nghệ An’’. 2. Mục tiêu của đề tài Do thấy được vai trò của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) diệt sâu hại lạc, ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng cây trồng nên chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm: 1. Thu thập sâu hại lạc, từ đó phân lập chủng nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) thuần khiết. 2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana). 3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana). 4. Thử nghiệm khả năng diệt sâu hại lạc của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) . 5. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm, sản xuất sinh khối nấm để áp dụng vào thực tiễn sản xuất. 6. Rèn luyện cho bản thân một số kĩ năng thí nghiệm đồng thời làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học. 3. Nhiệm vụ của đề tài Để đạt được mục tiêu nói trên, nhiệm vụ của đề tài này gồm: 1. Điều tra thực địa, thu thập, xử lý và bảo quản mẫu. 4 2. Pha chế môi trường nuôi cấy và phân lập nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) thuần khiết. 3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana). 4. Làm các thí nghiệm về ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sinh trưởng, phát triển. Từ đó tìm ra những điều kiện tối ưu (opt) để điều khiển sự sinh trưởng, phát triển tốt, sao cho có lợi nhất. 5. Làm các thí nghiệm để thử nghiệm khả năng diệt sâu hại lạc của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana). 6. Từ những yếu tố thích hợp nhất, xây dựng quy trình sản xuất sinh khối để có thể sử dụng trong thực tiễn. 5 Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học 1.1.1. Nấm kí sinh côn trùng (IPF) Khái niệm ”Nấm kí sinh côn trùng - Insect pathogenic fungi (IPF)” hay nấm côn trùng – ”Insect pathogenic fungi” được các nhà khoa học sử dụng như các thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật (nấm) ký sinh gây bệnh cho côn trùng. Theo Evan (1988), nấm kí sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm: (1) Kí sinh trong, tức là nấm kí sinh trong các nội quan khoang cơ thể của côn trùng kí chủ. (2) Kí sinh ngoài, tức là nấm phát triển ở tầng chitin ngoài vỏ cơ thể của côn trùng và gây nên bệnh cho côn trùng. (3) Nấm mọc trên côn trùng, tức là những nấm đã được trực tiếp hoặc gián tiếp chứng minh chúng kí sinh trên côn trùng. (4) Cộng sinh, có nghĩa là cả nấm và côn trùng cùng mang lại lợi ích cho nhau trong mối quan hệ cùng chung sống. Nấm kí sinh côn trùng còn được chia thành kí sinh sơ cấp (primery pathogen) và kí sinh thứ cấp (secondery pathogen) (Pu và Li, 1996). Nấm kí sinh sơ cấp thường nhiễm vào kí chủ côn trùng khoẻ mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng. Trong khi đó, nấm kí sinh thứ cấp chỉ có thể kí sinh trên những côn trùng bị yếu hoặc côn trùng bị thương. Các mầm bệnh kí sinh trên côn trùng trưởng thành hoăc côn trùng bị bệnh được gọi là kí sinh cơ hội hoăc kí sinh không chuyên tính, loại kí sinh này có thể nhiễm vào kí chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp chitin vỏ cơ thể của côn trùng. Các kí 6 sinh trên côn trùng bị thương gọi là bệnh lây qua vết thương, chỉ có thể xâm nhập vào côn trùng qua vết thương. Như vậy, nấm kí sinh côn trùng (IPF) được dùng mô tả hiện tượng nấm kí sinh trên hoặc trong cơ thể kí chủ côn trùng. Khái niệm này cũng được dùng cho nấm kí sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là hai lớp trong một ngành (Phyllum) Động vật chân khớp (Arthropoda) và chúng có cùng một kiểu sinh thái là ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây (Tzean và cs, 1997) [30]. 1.1.2. Các nhóm nấm kí sinh trên sâu Nấm là một quần thể vi sinh vật không có chất diệp lục, có sự phân hoá tế bào hữu tính một số loài là đơn bào. Chúng bao gồm nấm hoại sinh và nấm kí sinh. Nấm gây bệnh cho côn trùng đã phát hiện được hơn 750 loài. Phần lớn nấm gây bệnh cho côn trùng thuộc các chi trong bộ nấm mốc sâu (Entermophthorales) trong ngành phụ nấm tiếp hợp (Zygomicotina) và các bộ trong lớp nấm sợi (Hyphomycetes) ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycotina). Trong đó có nhiều loài thuộc các chi Beauveria, Metarrhizium, Entomophthora, Coelomyces có thể gây dịch bệnh cho sâu hại và có tác dụng khống chế tự nhiên [18]. - Ngành phụ nấm tiếp hợp (Zygomicotina) thường gặp các loài nấm mốc ruồi (En. muscae), nấm mốc ngài đen (En. aulicae), nấm mốc dịch bọ hung (Erynia brahmina), nấm mốc rận (En. delphacis). - Ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycotina) thường gặp các chi: nấm bào tử hình thoi (Aschersonia Mont), nấm bạch cương (Beauveria Vuill), nấm lục cương (Metarhizium Sorohin), nấm mốc tựa xanh (Paracilomyces Bainier). Theo Zhang (1999) nấm bạch cương Beauveria bassiana bào tử cầu có phạm vi kí sinh rất rộng, có thể gây bệnh cho hơn 700 loài thuộc 149 họ trong 7 15 bộ côn trùng, hơn 10 loài nhện. Nấm mốc tựa xanh (Paracilomyces) được nhiều nhà khoa học coi trọng, chúng có thể làm sâu róm thông và sâu cuốn lá thông chết 90%-100%. 1.1.3. Những bệnh lý ở côn trùng bị nấm kí sinh tiêu diệt Khi các côn trùng bị các loại nấm kí sinh thường có những biểu hiện: - Phát dục không bình thường: Biểu hiện ở chỗ phát dục kéo dài, thân sâu gầy yếu, đầu to, thân nhỏ. - Hành vi không bình thường: Khi bị bệnh, sâu thường bị kích động. Sau khi bị bệnh, sâu thường bước vào ngủ nghỉ sớm, thiếu phản ứng với môi trường ngoài hoặc có thể sâu bị bệnh di chuyển từ nơi nghỉ đến một nơi khác, như bò lên cao để chết. - Tiêu hoá không bình thường: Sâu bị bệnh thường ăn ít, có khi tiết dịch thể từ hậu môn, cũng có khi phân khô, thành các viên nhỏ dính vào hậu môn, màu phân khác thường. - Màu sắc khác thường: Sự biến màu trên thân sâu thường do nhiều nguyên nhân: + Do tồn tại các vật gây bệnh trên trên thân sâu như nấm bạch cương (có màu trắng), nấm lục cương (có màu xanh), nấm hồng cương (có màu đỏ). Cũng có thể do vi khuẩn gây nên. + Do vi sinh vật tạo ra các sắc tố làm cho sâu biến màu như nấm Serratia marcescens sinh ra sắc tố đỏ làm cho thân sâu có màu đỏ. + Do phản ứng phòng vệ của sâu tạo ra sắc tố đen, thường trên thân sâu có những đốm đen. - Biến đổi trong mô và tế bào : Do vật gây bệnh khác nhau, các cơ quan và bộ phận biểu hiện không bình thường . 8 Ví dụ: Nấm mốc sâu (Entomophthora aulicea) khi xâm nhiễm ban đầu phá hoại thể lipit của sâu làm cho lipit trong tế bào bị khô và bị phân giải. Do đó ảnh hưởng đến đường tiêu hoá làm cho sâu ngừng ăn. - Những triệu trứng khác: Ngoài những triệu trứng trên, sâu còn có một số triệu trứng khác như hệ thống sinh dục bị ảnh hưởng làm cho số lượng trứng giảm, biến đổi màu sắc làm cứng thân (như nấm bạch cương) hoặc thân mềm nhũn (như virut hoặc vi khuẩn), cơ thể có mùi hôi thối. 1.1.4. Cơ chế tác dụng gây bệnh của nấm * Đường xâm nhập: Nấm kí sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua một số con đường sau: - Xâm nhập qua đường tiêu hoá Chủ yếu là qua ruột giữa vì đây là hệ thống yếu nhất của sâu. - Xâm nhập qua da Bào tử nấm sau khi nẩy mầm thành ống mầm, nhờ tác dụng của enzim và tác dụng cơ học xuyên qua da để vào cơ thể. - Thông qua trứng côn trùng Có thể hệ sợi nấm xâm nhập vào trong phôi và lây truyền cho thế hệ sau, hoặc hệ sợi nấm phát triển trên bề mặt trứng côn trùng khi trứng nở sâu non ăn vỏ trứng có nhiễm nấm rồi nhiễm bệnh [18]. *Tác dụng gây bệnh của nấm Tác dụng gây bệnh của nấm trên côn trùng bằng cách bào tử nảy mầm, xâm nhập vào cơ thể và sinh sản trong xoang làm yếu và phá hoại chức năng trao đổi chất ở côn trùng [18]. Diễn biến tác dụng của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) lên sâu hại như sau: 9 Sau khi tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng, conidi của nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Quá trình này bắt đầu từ sau khi côn trùng bị nhiễm conidi khoảng 10h và có thể kéo dài vài ngày. Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, nấm bắt đầu sinh trưởng và phát triển. Khi đó côn trùng phải huy động các tế bào bạch huyết để chống đỡ nhưng nấm Beauveria bassiana đã tiết ra độc tố Bovericin có chứa Protease và một số chất khác làm phá hủy ngay cả tế bào bạch huyết, gây cho sâu chết. Nấm tiếp tục sinh trưởng, phát triển. Lượng sợi nấm bên trong cơ thể vật chủ ngày càng tăng và xác côn trùng càng trở nên rắn lại. Khi gặp đủ độ ẩm các sợi nấm mọc ra bên ngoài bề mặt cơ thể vật chủ và tạo thành conidi mới phủ trên cơ thể sâu [15]. - Nhờ gió, mưa bào tử nấm lây lan đến sâu khỏe, gặp điều kiện độ ẩm và nhiệt độ thích hợp nó phình lên, nảy mầm thành ống mầm, ống mầm tiếp xúc với da sâu mà hình thành vòi bám, vòi bám hình thành sợi nhỏ chọc thủng da, từ đó xâm nhập vào cơ thể sâu. Sau khi xuyên qua da, sợi nấm phình to ra thành dạng bàn, mép bàn mọc sợi nấm rồi hình thành các sợi ngắn. Sợi ngắn nhờ lực đẩy vào lớp trong cuối cùng đạt đến da thật. Nếu côn trùng lột xác chúng lại hình thành vòi bám mới để tiến hành tái xâm nhiễm [18]. - Nấm thông qua áp lực cơ học để xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng và nhờ tác dụng của enzim phân giải mà chọc thủng biểu bì. Những enzim phân giải là proteaza, lipoaza va chitinaza [18]. - Nấm gây bệnh cứng sâu tổng hợp rất nhiều enzim. Mỗi loài nấm khác nhau sẽ hình thành các enzim khác nhau nhưng chúng đều có thể tự tạo ra enzim chitinaza [24]. - Sự sinh sản của nấm trong cơ thể côn trùng làm cho hoạt động trao đổi chất, các cơ quan mô của côn trùng bị phá hoại, mất chức năng sinh lý và phát sinh sự rối loạn. 10 . diệt sâu hại lạc, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghi n cứu và sử dụng nấm Bạch cương (Beauveria bassiana) phòng trừ sâu hại lạc tại Nghi Đức – Thành phố Vinh. học vinh Khoa sinh học ====***==== Lại thị minh Nghi n cứu và sử dụng nấm bạch cơng (Beauveria bassiana) phòng trừ sâu hại lạc tại Nghi Đức - Thành phố Vinh