BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH    Trần Thị Mơ NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG CỦA VI KHUẨN TRONG MÔI TRƯỜNG AO NUÔI VÀ MỨC ĐỘ NHIỄM VI KHUẨN VIBRIO TRONG MẪU TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) TẠI MỘT SỐ TỈNH KHU VỰC PHÍA BẮC KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN VINH – 2009 1 MỞ ĐẦU Nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) đang là nghề được chính quyền các tỉnh ven biển miền Bắc Trung Bộ (Nghệ An, Hà Tĩnh, Thanh Hoá, Quảng Bình…) đưa vào là ngành kinh tế mũi nhọn trong thời kỳ từ nay đến 2010. Trong đó tôm sú là đối tượng được nuôi quan trọng nhất, đồng thời được đánh giá cao về cả tiềm năng và diện tích. Tính đến 2002, sản lượng nuôi tôm sú của 8 tỉnh miền Bắc đã đạt được 12.805 tấn, năng suất bình quân đạt 500kg/ha, cao gấp 3 lần sản lượng tôm nuôi năm 2000. Nuôi tôm sú đã thực sự làm tăng thu nhập, nâng cao đời sống và làm giàu cho người dân vùng ven biển. Chính vì thế, trong chương trình phát triển nuôi trồng thuỷ sản đến năm 2010, Bộ Thuỷ sản định hướng phát triển nuôi tôm Sú đạt sản lượng 360.000 tấn, giá trị xuất khẩu 1.400 triệu USD [12] Như một qui luật của tự nhiên, khi sự phát triển đạt được thể hiện qua cả diện tích, năng suất nuôi tôm kéo theo một số vấn đề xảy ra như ô nhiễm môi trường nuôi, dịch bệnh xảy ra thường xuyên hơn, . Một thực tế cho thấy trong những năm gần đây bệnh đã xuất hiện với tần suất dày hơn và diễn biến phức tạp. Bệnh là nguyên nhân chính quan trọng ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng tôm giống cũng như năng suất đạt được của tôm thịt. Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản 2003 của ngành đã đưa ra cả nước có 546757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm bị bệnh và chết là 30083 ha. Các tỉnh từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29200 ha nuôi tôm bị chết chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước chủ yếu do bệnh đốm trắng, đầu vàng, MBV, bệnh do vi khuẩn vibrio, bệnh do ký sinh trùng( Tạp chí thủy sản)[12]. 2 Ở tôm vi khuẩn gây rất nhiều bệnh nguy hiểm khác nhau và là mối đe dọa rất lớn trong ngành nuôi tôm công nghiệp. Có nhiều loài gây bệnh cho tôm, tuy nhiên mức độ ảnh hưởng cũng như khả năng chống chịu của tôm rất khác nhau tùy vào loại vi khuẩn, cường độ cảm nhiễm và giai đoạn cảm nhiễm.Trong đó Vibrio là nhóm sống tự do trong nước và cũng là tác nhân gây bệnh nguy hiểm. Bệnh Vibrio phân bố rộng khắp thế giới, có thể xảy ra ở hầu hết các giai đoạn của tôm [7]. Hiện nay nó đang trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi tôm nước ta nói chung và các tỉnh phía Bắc nói riêng. Vì vậy để góp phần hiểu rõ hơn về nguyên nhân gây bệnh trên tôm Sú từ đó có biện pháp phòng trị kịp thời nhằm hạn chế rủi ro cho nghề nuôi tôm tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu sự có mặt của vi khuẩn Vibrio trong mẫu tôm Sú(Penaeus monodon) và sự biến động vi khuẩn trong môi trường ao nuôi tôm Sú tại một số tỉnh phía Bắc”. Mục đích của đề tài: - Bước đầu làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học. - Xác định sự biến động của vi khuẩn hiếu khí và tổng vi khuẩn vibrio spp trong môi trường ao nuôi tôm Sú tại Hưng Hòa – Nghệ An, Quảng Chính – Thanh Hóa, và Thạch Trị - Hà Tĩnh . - Xác định sự có mặt của vi khuẩn Vibrio trong mẫu tôm Sú nuôi tại Hưng Hòa – Nghệ An, Quảng Chính – Thanh Hóa, và Thạch Trị - Hà Tĩnh . CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1. Một số đặc điểm về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Một số đặc điểm về vi khuẩn 1.1.1.1 Hệ thống phân loại Ngành Proteobacteria Lớp Schizomycetes Bộ Vibrionales Họ Vibrionaceae Giống Vibrio Loài Vibrio spp Vibrio có dạng hình que, kích thước tế bào 0,3-0,5x1,4-2,6µm. Vibrio không hình thành bào tử và có khả năng chuyển động nhờ một tiêm mao hoặc nhiều tiêm mao. Là các vi khuẩn bắt màu gram âm, có khả năng oxy hoá và lên men trong môi trường O/F Glucose, không có khả năng sinh H 2 S và mẫn cảm với Vibriostar (0/129). Hầu hết các loài của giống vibrrio đều phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp ở 20 – 40% o , có loài có thể phát triển ở 70% o nên vibrio luôn là mối đe doạ cho nghề nuôi động vật thuỷ sản biển, đặc biệt là giáp xác nuôi thâm canh trên biển và ven biển. Môi trường thiosulphate citrate bile salt Sucrose agar (TCBS) là môi trường chọn lọc của vibrio spp… Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, vibrio spp được chia thành 2 nhóm: Nhóm có khả năng lên men đường Sucrose và có khuẩn lạc màu vàng; nhóm không có khả năng lên men đường Sucrose và có khuẩn lạc màu xanh trên môi trường TCBS [7]. 4 Vi khuẩn Vibrio có thể gây ra các bệnh mãn tính, thứ cấp tính và cấp tính. Khi bệnh cấp tính xảy ra tỷ lệ chết có thể lên tới 100% nếu không có biện pháp trị bệnh kịp thời. Khi bệnh Vibriosis bùng nổ ở mức độ cấp tính, luôn luôn liên quan đến vấn đề stress và chất lượng môi trường nước xấu. Vibrio là vi khuẩn đặc trưng cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhịt độ 25 – 30 0 C [7]. Theo Bower (1996), một số loài vi khuẩn có khả năng tiết ra các men phân huỷ vỏ kitin ở các loài giáp xác như Chitinase, Protease, lipase. Các vi khuẩn này có thể thuộc giống Vibrio spp, Pseudomonas spp, Aeromonas spp. (Bower S. M (1996), Rickettsia and Chlamydia of Crabs, Synopsis of infection Diseases and parasites of Commercially Exploited Shellfish) Gây bệnh Vibriosis ở ĐVTS gặp một số loài như sau: V. parahaemolyticus, V. haveyi, V. cholera, V. vulnificus, V. anginolyticus, V. anguilarum… 1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh trên tôm sú 1.2.1. Trên thế giới Ngành nuôi trồng thủy sản đã đem lại lợi nhuận rất cao cho các quốc gia có tiềm năng về phát triển NTTS, đặc biệt là nuôi tôm sú. Các quốc gia đã bằng mọi cách mở rộng diện tích vùng nuôi, đẩy mạnh các hình thức nuôi công nghiệp dẫn đến sự mất cân bằng sinh thái trong các vùng nuôi tôm. Hiện tượng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh đã xảy ra liên tục ở nhiều nơi trên thế giới. Bệnh đã làm giảm sản lượng tôm nuôi đáng kể. Năm 1987 – 1989 dịch bệnh tôm xảy ra ở Đài Loan đã làm cho sản lượng tôm nuôi ở quốc gia này giảm xuống đáng kể từ 100.000 tấn giảm còn 20.000 tấn [13]. 5 Không chỉ tính riêng châu Á, châu Phi, châu Mỹ mà cả trên toàn thế giới đều chịu thiệt hại lớn về sản lượng, năng suất do dịch bệnh gây ra, đặc biệt thiệt hại lớn nhất phải kể đến Thái Lan, Philippine, Indonesia, Trung Quốc, Bangladesh [13]. Trước tình hình dịch bệnh hoành hành, hàng loạt các công trình nghiên cứu về bệnh trên các đối tượng thủy sản đã được tiến hành nghiên cứu. Vào những năm 70 bệnh virus trên tôm lần đầu tiên được phát hiện bởi Couch (1974) và gọi là Baculovirus penaeid, và hiện nay con người đã tìm ra khoảng 20 bệnh do virus trên tôm và hàng trăm loài vi khuẩn khác nhau cũng như nhiều loài nấm, ký sinh trùng gây ra trên tôm (Brock and Lightner 1990) [25]. 1.2.1.1. Bệnh virus Theo lightner (1996), Brock và lightner (1990), Fulk và Main (1992), các bệnh thường gặp do virus gây bệnh trên tôm he nuôi tại khu vực châu Á như sau [29]: Hội chứng đốm trắng WSBV Bệnh do virus đầu vàng YHD Bệnh BMN và MBV Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu IHHNV Bệnh gan tụy do Parvovirus Bệnh đốm trắng WSBV Bệnh đốm trắng được thông báo lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 1989 trong các đầm nuôi tôm sú có tỷ lệ chết rất cao. Vài năm trở lại đây bệnh đã xuất hiện ở rất nhiều khu vực trên thế giới trong đó có Việt Nam và gây 6 thiệt hại đáng kể. Hiện tại bệnh đốm trắng đang được tổ chức dịch bệnh động vật quốc tế xếp vào danh mục cần được kiểm soát [31]. Dấu hiệu đặc trưng của bệnh là có những đốm trắng khoảng 0,5 – 2mm ở vỏ, chủ yếu tập trung ở giáp đầu ngực, những đốm trắng này không bị mất đi khi ta cạo dưới lớp vỏ. Những đốm trắng được tạo nên do sự lắng cặn không bình thường của muối canxi ở biểu bì [34]. Tôm bị bệnh thường khả năng tiêu thụ thức ăn giảm sút rõ ràng, cá biệt có trường hợp tăng cường độ bắt mồi sau vài ngày mới có hiện tượng bỏ ăn. Tôm bệnh có thể bị chuyển sang màu hồng đỏ. Hiện tượng chết có thể xảy ra vài ngày sau đó, tỷ lệ chết cao, có thể lên tới 90% - 100% trong 3 – 7 ngày nhưng cũng có trường hợp đốm trắng không phải do tôm bị nhiễm virus mà có thể do sự kéo dài độ pH cao quá lâu dẫn đến sự tích tụ canxi ở lớp vỏ làm xuất hiện đốm trắng, hiện tượng này không nguy hiển lắm. Chỉ cần môi trường nuôi tốt, giúp tôm ăn tốt và lột xác bình thường, sau khi lột xác đốm trắng đó sẽ mất đi [34]. Bệnh đốm trắng phát triển rất nhanh, gây chết hàng loạt và hay cảm nhiễm ở giai đoạn tôm con (sau khi thả giống từ 30 – 40 ngày) Virus gây bệnh này có thể phát triển trên nhiều đối tượng tôm nuôi khác nhau, con đường lây lan của bệnh rất rộng theo cả chiều ngang và chiều dọc [31]. Theo các nhà khoa học Úc thì virus có thể tồn tại trong môi trường nước trong vòng 4 – 7 ngày với khả năng lây nhiễm cao. Một số nhà khoa học Ấn Độ cho rằng bệnh WSBV thường trầm trọng hơn sau những trận mưa lớn. Còn Chalor Limsuwan khi nghiên cứu WSBV ở Thái Lan lại có nhận xét rằng ở vùng nuôi có độ muối cao, mức độ nhiễm WSBV nghiêm trọng hơn nhiều so với vùng nuôi có độ muối thấp [35]. 7 Bằng phương pháp mô bệnh học Lightner nhận thấy rằng: Các tế bào nhiễm virus bệnh đốm trắng có nhân bị kết dặc lại và xuất hiện thể vùi bắt màu hồng khi nhuộm Eosin và Hematocyline [5]. Ngoài ra để kiểm tra bệnh này người ta còn có nhiều phương pháp như nhuộm nhanh mang tôm bị bệnh, phương pháp PCR [5]. Bệnh MBV MBV có mặt trong phần lớn các trang trại nuôi tôm ở châu Á từ Trung Quốc đến Đài Loan, Philippine, Malayxia, Singapore, Thái Lan, Indonexia, Australia… và có thể lây nhiễm trên nhiều loại tôm he khác nhau: P.monodon, P. merguiensis, P. vannamei…Tuy nhiên chỉ có tôm sú P. monodon thường bị nhiễm nặng và phổ biến nhất [32]. Hiện nay bệnh MBV đã xuất hiện khá phổ biến trên toàn thế giới: Khu vực Tây bán cầu, vùng Trung Đông, châu Mỹ và cả ở các khu vực châu Á Thái Bình Dương. Theo Wang và ctv (1992), bệnh MBV thường gây tỷ lệ chết cao trong các trại ương nuôi và ít hơn trong các ao nuôi tôm thịt ở Malaysia. Ông đã phát hiện ra tôm bị nhiễm bệnh ở giai đoạn hậu ấu trùng và ấu niên là mạnh nhất [32]. Còn theo Lightner (1996) cho rằng, tôm có thể bị nhiễm MBV từ giai đoạn Zoea 2 nhưng bệnh lại trầm trọng nhất ở giai đoạn postlarvae, đặc biệt là PL25, tỷ lệ tử vong có thể lên đến 90% trong quần đàn bị nhiễm MBV nặng[34]. Theo một quan niệm khác của Chen (1992) và của Chanratchakool (1994) thì bệnh MBV có gây tác hại hay không còn phụ thuộc vào sự “sốc” do môi trường và sự tham gia của các tac nhân khác như vi khuẩn, động vật đơn bào và các virus khác. Nghĩa là tôm bị nhiễm MBV nếu được sống trong 8 môi trường thuận lợ và ổn định thì hầu như tác hại của bệnh tôm không đáng kể nhưng khi gặp điều kiện môi trường xấu, không ổn định làm tôm yếu, dễ mẫn cảm với MBV và dẫn đến tôm bị chết [36]. Phần lớn các quần đàn tôm nhiễm MBV khi chết thấy không chỉ có một tác nhân là MBV mà còn thấy tác nhân thứ cấp là vi khuẩn vibrio spp. Theo Felix và Devaraj (1993) có đến 70% PL tôm sú bị nhiễm MBV khi chết có kèm theo dấu hiệu của bệnh phát sáng. Ngoài ra còn có vi khuẩn dạng sợi và động vật đơn bào. Theo Lightner (1996) MBV có tác dụng mở đường, điều này thể hiện trong lát cắt mô gan tuỵ của tôm. Khi nhiễm bệnh MBV nặng thì tế bào gan tuỵ của tôm thường bị nhiễm vi khuẩn thứ cấp [36]. Ngày nay bệnh MBV đã và đang được nghiên cứu ở nhiều quốc gia trên thế giới. Theo Chen và ctv (1989), với MBV thì phương pháp nhuộm màu gan tôm ép tươi bằng xanh malachite 0,5% và phương pháp mô bệnh học cho phép chẩn đoán chính xác sự cảm nhiễm của MBV trong các tế bào gan tuỵ của tôm thông qua việc phát hiện sự tồn tại của thể ẩn trong mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên theo Lightner (1996) thì hai phương pháp nhuộm tươi và mô bệnh học dù sao cũng còn một hạn chế đó là không phát hiện chính xác tôm bị nhiễm virus ở giai đoạn đầu tiên, chưa hình thành thể ẩn. tuy nhiên phương pháp này phù hợp cho việc nghiên cứu bệnh MBV ở các phòng thí nghiệm thô sơ [28]. Bệnh đầu vàng YHVD có sự phân bố rộng, liên quan tới các quốc gia có nuôi tôm sú nhưng cho đến nay bệnh này chỉ mới được nghiên cứu ở Thái Lan (P.J Walker, 2000). Theo Lightner (1996) bệnh này xuất hiện ở Thái Lan năm 1990 trong các ao nuôi thâm canh. Tuy vậy người ta còn cho rằng rất có thể 9 bệnh này đã xảy ra sớm hơn và gây dịch chết tôm nghiêm trọng ở Đài Loan năm 1987 – 1989. Trước đây một số nhà nghiên cứu ở Thái Lan cho rằng đây là bệnh do Baculovirus gây ra. Tuy nhiên hiện nay người ta đã xác định nó không thuộc họ Baculovirus. Virus YHV chỉ là một sợi đơn hình que được bao bọc bởi bào chất virus gần giống các virus thuộc họ Coronaviridae [31]. YHV có thể lây nhiễm ở tất cả các giai đoạn khác nhau của tôm sú nhưng bệnh thường xảy ra và gây thiệt hại đối với tôm khoảng 2 tháng tuổi, trong những ao đầm có điều kiện môi trường xấu và ở những vùng có mật độ số ao và trại ao cao. Thực tế cho thấy rằng bệnh này thường xuất hiện trong hệ thống nuôi thâm canh [6]. 1.2.1.2. Bệnh do vi khuẩn Vi khuẩn là một trong những tác nhân chiếm phần lớn trong các tác nhân gây bệnh cho tôm nuôi. Trong điều kiện ao nuôi có mật độ cao, đầu tư thức ăn lớn, hiện tượng ô nhiễm thường xuyên xảy ra đó là điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển và gây tác hại. Theo thống kê của Sindermann và lighter (1988) cho biết: Các bệnh tôm do vi khuẩn gây ra chiếm 45,5% tổng các loại bệnh tôm, trong khi vius chỉ chiếm 25,3%, Nấm chiếm 2,7%, Ký sinh trùng chiếm 26,5%[38]. Trong các loài vi khuẩn gây bệnh cho tôm thì vibrio là loài phân bố rộng khắp thế giới và luôn được xem là mối đe doạ lớn cho nghề nuôi động vật thuỷ sản biển nói riêng và nghề nuôi tôm sú nói chung Trong bệnh vibrrio, vi khuẩn vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp, tác nhân cơ hội. Ký sinh trùng hay các tác động môi trường như cơ học, hoá học có thể đóng vai trò quan trọng trong các dịch bệnh vibrio ở động vật thuỷ sản. 10