Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= Lê Thị Hạnh ======================================================= 1 Trờng đại học vinh Khoa sinh học ---------------------- nghiên cứu khả năng cố định nitơ của vi khuẩn azotobacter trong đất trồng rau ở phờng đông vĩnh-TP vinh-nghệ an Giáo viên hớng dẫn: GVC. Nguyễn Dơng Tuệ Sinh viên thực hiện: Lê Thị Hạnh Lớp: 44B- sinh học Vinh, tháng 5-2007 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= Lời cảm ơn Trong quá trình thực hiện đề tài tôi đã nhận đợc sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, cán bộ phòng thí nghiệm khoa Sinh học. Với sự giúp đỡ tận tình quý báu của thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ cán bộ phòng thí nghiệm di truyền vi sinh phơng pháp, các thầy cô trong tổ di truyền - vi sinh - phơng pháp, các thầy cô giáo trong khoa sinh và các bạn bè đồng nghiệp. Do bớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu nên không tránh khỏi những khiếu khuyết rất mong đợc sự góp ý của các thầy cô và bạn bè đồng nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của thầy Nguyễn Dơng Tuệ, cảm ơn cán bộ phòng thí nghiệm di truyền vi sinh, các thầy cô giáo trong khoa đã hết sức tận tình giúp đỡ. Tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài này, Cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ, động viên của các bạn vè đồng nghiệp trong suốt thời gian qua. Vinh, ngày 20 tháng 4 năm 2007 Sinh viên thực hiện Lê Thị Hạnh Lê Thị Hạnh ======================================================= 2 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= Phần I. Đặt vấn đề Một số sinh vật có khả năng trao đổi chất đặc biệt, thể hiện ở sự chuyển hoá, tổng hợp, phân huỷ các chất, đợc con ngời sử dụng để sản xuất thực phẩm, đồ uống và một số sản phẩm khác, dần dần hình thành công nghệ vi sinh học, trong đó vi sinh vật đợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của kỹ thuật : công nghiệp, nông nghiệp, y học ở đây vi sinh vật đợc xem là tác nhân cơ bản, trực tiếp của sự chuyển hoá hoá học ở cơ chất này đến cơ chất khác để thu nhận những sản phẩm quan trọng có giá trị thực tế. Trong lĩnh vực nông nghiệp, đối với cây trồng thì đạm có vai trò quan trọng bậc nhất cung cấp dinh dỡng cho cây trồng và đất. Tuy nhiên trong thực tế thực vật thờng xuyên phải chịu sự thiếu thốn về muối nitơ. Và con ngời phải th- ờng cung cấp lợng nitơ của phân hoá học, lợi dụng các vi sinh vật sống tự do trong đất và nớc, chúng có khả năng đồng hoá dễ dàng, thực hiện việc biến nitơ không khí thành hợp chất nitơ (NO 3 , NH + 4 ) để cung cấp cho cây trồng . Hàng năm, số lợng nitơ mà cây thu đợc bằng con đờng cố định đạm nhiều gấp 3 lần tổng số phân nitơ hoá học đợc sản xuất trên thế giới. Trong số những sinh vật sống tự do trong đất thì những sinh vật thuộc chi Azotobacter và vi khuẩn Clostridium. Có khả năng cố định nitơ phân tử cao nhất. Vì vậy công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp, ngời ta đã chú ý đến việc sản xuất phân bón vi sinh nhờ các vi sinh vật cố định nitơ này. Nhằm cung cấp dinh dỡng cho đất, cây trồng, bảo vệ môi trờng. Những chủng vi khuẩn Azotobacter có ý nghĩa lớn trong việc cải tạo đất trồng. Vì thế chúng tôi muốn nghiên cứu sự hiện diện của Lê Thị Hạnh ======================================================= 3 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= chúng trong đất trồng rau xanh nhằm mục đích cải tạo đất trồng rau và tìm ra h- ớng đi cho việc sản suất đại trà vi khuẩn này. Với những lý do trên và trong khuôn khổ của một đề tài luận văn tốt nghiệp chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu khả năng cố định Nitơ của vi khuẩn Azotobacter trên đất trồng rau tại phờng Đông Vĩnh-Thành phố Vinh- Nghệ An Nhằm mục tiêu: 1. Tìm hiều và phân lập vi khuẩn Azotobacter, từ đó tìm ra chủng vi khuẩn Azotobacter có hoạt tính mạnh nhất. 2. Nghiên cứu một số chỉ tiêu liên quan đến khả năng cố định nitơ của vi khuẩn Azotobacter.Để tìm ra những điều kiện tối thích cho quá trình đồng hoá nitơ của Azotobacter. 3. Làm quen và hoàn thiện dần phơng pháp nghiên cứu khoa học và khả năng thực hành thí nghiệm. Nhiệm vụ: 1. Thu mẫu tại vùng trồng rau phờng Đông Vĩnh, xử lí mẫu 2. Phân lập và xác định hoạt tính cố định nitơ của vi khuẩn 3. Làm các thí nghiệm về các yếu tố đến khả năng cố định nitơ. Đề tài này đợc tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa sinh học Đại học Vinh từ tháng 9 năm 2006 đến tháng 5 năm 2007. Lê Thị Hạnh ======================================================= 4 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= Phần II: Tổng quan tài liệu I. Sơ lợc về vi sinh vật cố định Nitơ Ngời ta nhận thấy muốn thu hoạch 12 tạ/ha. Cây trồng cần lấy đi khỏi đất khoảng 30kg nitơ - Số lợng nitơ này nằm trong hạt, trong rơm rạ hoặc thân lá. Hiệu suất sử dụng phân hoá hoá học 75%. Nh vậy có nghĩa nếu chỉ dựa vào nguồn nitơ hoá học, muốn có 5 tấn hạt phải bón cho mỗi hecta khoảng 166,6 kg nitơ (tơng đơng 833 kg amonsunfat). Trong không khí nitơ chiếu 78,16% theo thể tích ngời ta tính rằng bầu không khí bao quanh trái đất có chứa tới 4.10 15 tấn nitơ. Những nghiên cứu cho thấy rằng trong không khí trên mỗi hecta có tới 80 000 tấn nitơ số lợng nitơ này đủ thoả mãn cho nhu cầu về nitơ của cây trồng sống trên mảnh đất đó khoảng 80 triệu năm. Tuy nhiên con ngời gia súc và cây trồng đều không có khả năng sử dụng đợc loại nitơ phân tử này vì trong không khí phân tử nitơ tồn tại ở trạng thái liên kết hai nguyên tử nitơ lại với nhau nhờ ba dây nối rất bền vững (N N) [4] Vì vậy để phá vỡ để tạo đợc các loại phân hoá học cần phải sử dụng những điều kiện khoa học kỹ thuật phức tạp (nhiệt độ, áp suất cao, chất xúc tác đắt tiền) Vì thế giá thành cao, không phù hợp với điều kiện sản xuất. Theo thống kê, trên trái đất hàng năm cây trồng sử dụng 100 110 triệu tấn nitơ trong khi đó phân đạm hoá học chỉ bổ sung đợc khoảng 30% lợng nitơ bị lấy đi. Thực vật thờng xuyên phải chịu sự thiếu thốn về muối nitơ. Tuy nhiên sự tổn thất này lại thờng xuyên bù đắp nhờ quá trình sinh học đặc biệt, gọi là Lê Thị Hạnh ======================================================= 5 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= quá trình cố định nitơ bằng những vi sinh vật. Chúng có khả năng chuyển hoá nitơ phân tử thành những hợp chất chứa nitơ và làm giàu thêm nguồn dự trữ thức ăn nitơ trong đất vì vậy vai trò của các vi sinh vât cố định nitơ có ý nghĩa hết sức lớn lao đối với nông nghiệp nhất là đối với các nớc có nền công nghiệp phân hoá học cha phát triển lắm. Những nghiên cứu gần đây cho biết tổng số nitơ cố định đợc bởi vi sinh vật trên toàn thế giới khoảng 175 triệu tấn. Nh vi khuẩn nồt sần cộng sinh với cây thuộc bộ đậu: Ngời ta đã điều tra khả năng tạo thành nốt sần ở 1 200 loài trong số 11 000 loài thuộc bộ đậu đã đ- ợc miêu tả. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn nốt sần trên các môi trờng dinh dỡng nhân tạo ngời ta đã chia chúng làm 2 nhóm là nhóm nọc nhanh (vi khuẩn nốt sần ở cỏ ba lá, đậu Hà Lan, đậu coke, mục túc), nhóm này thuộc chi Rhizobium và nhóm mọc chậm (vi khuẩn nốt sần đậu tơng lạc đậu đũa) nhóm này thuộc chi Bradyrhizobium. Vi khuẩn nốt sần thuộc loại hiếu khí tuy nhiên chúng vẫn có thể phát triển đợc ngay trong trờng hợp có 1 áp lực oxi rất thấp (khoảng 0,01 atm). Mỗi loại vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiệm đợc trên một nhóm cây nhất định trong bộ đậu. Ví dụ các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết vi khuẩn nốt sần điền thanh hoa vàng (S.canabana) có thể tạo nốt sần trên cây Điền Thanh hạt tròn (S.paludosa) và ngợc lại trong khi đó không có khả năng tạo thành nốt sần trên rất nhiều loại đậu khác (đậu tơng, đậu đen, đậu xanh ) cũng có trờng hợp vi khuẩn nốt sần nhập đợc vào những loại đậu không đặc biệt đối với chúng, khi đó chúng chỉ có thể tạo ít nốt sần và cố định nitơ rất yếu. Ngời ta nhận thấy hàng năm vi khẩn nốt sần cộng sinh trong rễ các cây thuộc bộ đậu có thể làm giàu thêm 50 600kg nitơ/ha. Để nâng cao hiệu suất cố định nitơ của cây bộ đậu từ lâu ngời ta đã nghĩ đến biện pháp chủ động nhiễm cho hạt giống các cây bộ đẫu những nòi vi khuẩn nốt sần hữu hiệu đã đợc Lê Thị Hạnh ======================================================= 6 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= lựa chọn, chế phẩm vi khẩn nốt sần (nitragin) đã đợc sản xuất và sử dụng rộng rãi ở Liên Xô cũ, Trung Quốc, Ba Lan, BunGari có hiệu quả khá rõ rệt và phổ biến.ở những vùng đất cha trồng quen loại đậu đỗ nào sử dụng nitragin tơng ứng có thể làm tăng sản lợng đến 50 100% ở những đất trồng quen 1 loại đậu nào đó rồi ngời ta nhận thấy việc sử dụng nitragin tơng ứng có thể làm tăng sản lợng khoảng 15 25%. Sử dụng nitragin không những làm nâng cao rõ rệt sản lợng cây trồng thuộc bộ đậu mà còn có thể làm tăng phẩm chất của các sản phẩm của chúng rất nhiều nghiên cứu cho biết khi sử dụng nitragin làm lợng prôtêin trong cây và trong hạt đậu đỗ sẽ tăng lên khá rõ. Một số tác giả biết cây đợc nhiễm bvi khuẩn nốt sần sữ có hàm lợng nhiều loại vitamin cao hơn so với cây không đợc nhiễm. [4] Ngoài vi khuẩn nốt sần, nhiều loại nấm rễ (Ophana can hay Mycorhira) cũng có khả năng cố định nitơ phân tử: Nh loài nấm rễ phân lập từ các cây thuộc họ Thạch Nam (Ericareae) có hoạt tính cố định ni tơ là 10,92 22,14mg Nitơ/1 gam đờng. Có nghiên cứu cho biết nhờ tác dụng của nấm rễ mà đất trồng loài thông pinus radiala ở Mỹ hàng năm có thể đợc làm giàu thêm 50kg nitơ/ha. [4] Vi khuẩn hiếu khí thuộc chi Azotobacter: Đợc phân lập đầu tiên vào năm 1901. Phần lớn chủng Azotobacter đợc phân lập từ thiên nhiên có khả năng cố định đợc trên 10mgN 2 khi tiêu thụ hết 1g hợp chất cácbon. Một số chủng Azotobacter điều kiện thích hợp có thể đồng hoá đến 30mg N 2 /1g hợp chất các bon. Khả năng cố định N 2 của Azotobacter không những phụ thuộc từng chủng vi khuẩn mà còn phụ thuộc vào thành phần môi trờng nớc cấy pH và nhiệt độ nuôi cấy mà sự tồn tại của các hợp chất nitơ tính chất của nguồn thức ăn cacbon, sự có mặt của nguyên tố vi lợng và các hoạt động sinh học (cụ thể sẽ đợc nói rõ hơn của mục sau) [2] Lê Thị Hạnh ======================================================= 7 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= Vi khuẩn hiếu khí thuộc chi Beijerinckia: Đây là một vi khuẩn hiếu khí cố định nitơ giống với Azotobacter có khả năng chịu chua cao hơn Azotobacter có thể cố định đợc 16 20mg nitơ phân tử khi đồng hoá hết 1g các chất sinh năng lợng, phân bố rộng rãi trong các đất vùng nhiệt đới hoặc á nhiệt đới Việt Nam phát hiện thấy sự tồn tại của Beijerinckia trong một mẫu đất của vùng Lào Cai. Ngoài ý nghĩa kinh tế do có khả năng cố định nitơ phân tử, Beijerinckia còn đáng chú ý ở chỗ chúng có thể tổng hợp ra một số chất hoạt động sinh học có tác dụng kích thích sự sinh trởng của cây trồng làm tăng sản lợng mùa màng. Vi khuẩn khí tự do thuộc chi Clostridium đợc phát hiện vào năm 1893 có bào tử bào tử có kích thớc lớn hơn bề rộng của tế bào dinh dỡng khi đó khi mang bào tử tế bào thờng có hình thoi, kích thớc của bào tử khoản 1,3 x 1,6 àm. Có khả năng tích luỹ đợc 5 10 mg nitơ trong phạm vi khá rộng (pH 4,7 8,5) Các nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy ngay ở cả những vùng đất chua, khi không tìm thấy sự phát triển của Azotobacter thì Clostridium vẫn có mặt với l- ợng đáng kể. Nói chung trong mỗi gam đất trồng lúa trên miền Bắc Nếu ta số l- ợng vi khuẩn nhóm này thờng có từ hàng vạn đến hàng triệu tế bào. Số lợng của chúng trong vùng rễ cây trồng bao giờ cũng nhiều hơn ngoài vùng rễ, Clustridium thờng tập trung nhiều trong lớp đất cày nhng ngay ở độ sâu 75 cm vẫn có thể tìm thấy hàng nghìn tế bào trong mỗi gam đất. Đã nhiều thí nghiệm sử dụng chế phẩm Clostridium để bón cho cây trồng trong nhiều trờng hợp thu hiệu quả dơng tính nhng không ổn định và ngời ta vẫn cha giải thích đợc một cách dứt khoát là trong các trờng hợp có tác dụng dơng tính chủ yếu là do sự cố định nitơ hay do sự tích luỹ các hoạt tính sinh học.[4] Vi khuẩn lam sống tự do và vi khuẩn lam cộng sinh trong bèo hoa dâu. Lê Thị Hạnh ======================================================= 8 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= Là loại vi sinh vật hiếu khí. Đa số vi khuẩn lam có khả năng cố định nitơ sống tự do trong đất và trong nớc nhng một số ít có đời sống cộng sinh với thực vật chẳng hạn các dạng cộng sinh với nấm trong một số loài địa y một số tảo lam cố định nitơ có đời sống nội sinh trong các xoang của rêu tản, một số loài dơng xỉ. Đặc biệt chú ý là loài anabaenaazollae cộng sinh trong bèo hoa dâu một loại cây dùng làm phân xanh và làm thức ăn gia súc có ý nghĩa kinh tế của nớc ta. Nhờ sự phát triển của vi khuẩn lam trong ruộng lúa mà hàng năm mỗi hécta đất trồng lúa có thể lấy đ- ợc thêm từ không khí khoảng 15 50 kg nitơ đôi khi thu đợc đến 80kg hay hơn nữa. [4] Ngoài biện pháp bón phân (nhất là phân lân) và trung hoà đất. Từ lâu ng- ời ta đã chú ý đến biện pháp nuôi cấy một số vi khuẩn lam có hoạt tính cố định nitơ cao để bón thêm vào cho đất. Rõ ràng đây là một hớng nghiên cứu rất đáng chú ý đối với một nớc trồng lúa chủ yếu nh nớc ta. II. Vi khuẩn Azotobacter và tình hình nghiên cứu về Azotobacter trong lĩnh vực nông nghiệp. 1. Vi khuẩn Azotobacter Đợc phân lập đầu tiên vào 1901 vi khuẩn Azotobacter là nh những song cầu cầu khuẩn, gram âm, không sinh bào tử, phát triển trong điều kiện hiếu khí, kích thớc tế bào dao động từ 1,5 5,5 àm. Khi còn non có tiêm mao di động nhờ trên mao khi già tế bào Azotobacter mất khả năng di động kích thớc thu nhỏ lại. Quan sát dới kính hiển vi ta còn thấy khi già tế bào Azotobacter đợc bao bọc bởi vỏ nhầy khá dầy tạo thành nang xác khi gặp điều kiện thuận loại nang này nứt ra tạo thành tế bào mới. Lê Thị Hạnh ======================================================= 9 Luận văn tốt nghiệp Chuyên ngành di truyền - vi sinh ======================================================= Vi khuẩn Azotobacter thích ứng ở pH = 7 8, ở nhiệt độ 28 30 0 C, độ ẩm 40 60% Azotobacter đồng hoá tốt đờng đơn và đờng kép cứ tiêu tốn 1g gluco có khả năng đồng hoá đợc 10mg nitơ ngoài ra Azotobacter còn có khả năng tiết ra một số vitamin nhóm B một số chất hữu có: axit pantotenic, biotin, auxin. Nhng đặc biệt có hoạt tính enzim nitrogennaza tham gia vào quá trình đồng hoá nitơ của không khí có thể biểu thị vắn tắt phản ứng nh sau: N 2 + 6e + 12 ATP + 12 H 2 O zanitrogenna 2NH + 4 + 12 ADP + 12Pi + 4 H + Vì vậy Azotobacter có khả năng cố định ni tơ khí trời [14] Azotobacter không có khả năng đồng hoá chất mùn, tuy nhiên sự tồn tại của một lợng nhỏ chất mùn trong môi trờng sẽ làm kích thích sự phát triển của Azotobacter. Sự phát triển của Azotobacter chịu ảnh hởng rõ rệt của lợng chứa photpho trong môi trờng. Những điều tra tại đất trồng lúa ở nớc ta cho thấy khi lợng chứa P 2 o 5 của đất 0,06% thì luôn thấy có mặt của Azotobacter trong đất ngợc lại khi đất chứa P 2 O 5 0,02% hầu nh không thấy sự có mặt của Azotobacter trong đất. Bổ sung phân lân vào đất có thể làm tăng cờng rõ rệt hoạt động cố định của Azotobacter và do đó làm nâng cao lợng chứa nitơ trong đất. [4] Azotobacter thuộc loại vi khuẩn hiếu khí nhng cũng có thể phát triển đ- ợc cả trong điều kiện vi hiếu khí. Màu sắc khuẩn lạc là một trong những tiêu chuẩn để phân loại các loại Azotobacter Azotobacter chroocum : Trong canh trờng mới cấy thì có hình que, chuyển động có kích thớc từ 3-7 à m, trong canh trờng cũ thì có hình cầu, kết thành từng đôi hay từng khối, khuẩn lạc khi già có màu nâu đến màu đen sắc tố không khuyếch tán vào môi trờng. [14] Lê Thị Hạnh ======================================================= 10 . khả năng cố định Nitơ của vi khuẩn Azotobacter trên đất trồng rau tại phờng Đông Vĩnh- Thành phố Vinh- Nghệ An Nhằm mục tiêu: 1. Tìm hiều và phân lập vi khuẩn. ---------------------- nghiên cứu khả năng cố định nitơ của vi khuẩn azotobacter trong đất trồng rau ở phờng đông vĩnh- TP vinh- nghệ an Giáo vi n hớng dẫn: GVC.