1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH TRẦN BÍCH NGỌC TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT DAIDZIN TỪ THÂN VÀ LÁ CÂY SẮN DÂY ( PUERARIA LOBATA WILLD) Ở VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Vinh - 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT DAIDZIN TỪ THÂN VÀ LÁ CÂY SẮN DÂY (PUERARIA LOBATA WILLD) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: HÓA DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS TRẦN ĐÌNH THẮNG Sinh viên thực hiện: TRẦN BÍCH NGỌC Vinh - 2011 Lêi cảm ơn Luận văn đợc thực phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu khoa Hoá, Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm Môi trờng, Trờng Đại học Vinh, Viện Hoá học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Trần Đình Thắng - Khoa Hoá, Trờng Đại học Vinh đà giao đề tài, hớng dẫn, tạo điều kiện suốt trình thực luận văn PGS TS Hong Văn Lựu, TS Lê Đức Giang khoa Hóa đà có nhiều góp ý cho đề tài ThS Đỗ Ngọc Đài, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật đà giúp định danh mẫu thực vật Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, cán bộ môn hoá hữu cơ, khoa Hoá, bạn sinh viên, gia đình ngời thân đà động viên giúp đỡ hoàn thành luận văn Vinh, ngày 10 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Trần Bích Ngọc danh mục kí hiệu, chữ viết tắt CC: Column Chromatography (Sắc kí cột) FC: Flash Chromatography (S¾c ký cét nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy (Phỉ khèi lỵng) EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phỉ khèi va ch¹m electron) ESI-MS: Electron Spray Impact-Mass Spectroscopy (Phỉ khèi lỵng phun mï electron) H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phỉ céng hëng tõ h¹t nh©n cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: singlet br s: singlet tï t: triplet d: dublet dd: dublet cña dublet dt: dublet cña triplet m: multiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide MỤC LỤC Nội dung Mở đầu Lí chọn đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Chi Pueraria 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Các ứng dụng 1.2 Cây sắn dây 1.2.1 Đặc điểm thực vật 1.2.2 Thành phần hóa học 1.2.3 Sử dụng hoạt tính sinh học Chương 2: Phương pháp nguyên cứu 2.1 Phương pháp lấy mẫu 2.2 Thiết bị phương pháp 2.2.1 Hóa chất 2.2.2 Các phương pháp sắc ký 2.2.2.1 Sắc ký mỏng 2.2.2.2 Sắc ký cột 2.2.3 Dụng cụ thiết bị 2.2.4 Phân lập hợp chất Chương 3: Kết thảo luận 3.1 Phân lập 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất 53 Kết luận Tài liệu tham khảo Trang 1 3 10 10 13 20 26 26 26 26 26 26 26 26 27 29 29 29 49 50 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam nằm vùng trung tâm Đông Nam Á hàng năm có lượng mưa nhiệt độ trung bình tương đối cao Với khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng, ẩm cho rừng Việt Nam hệ thực vật đa dạng phong phú Theo số liệu thống kê gần hệ thực vật Việt Nam có 10.000 lồi [5], có khoảng 3.200 lồi sử dụng y học dân tộc 600 loài cho tinh dầu [7] Đây nguồn tài nguyên thiên nhiên quý báu đất nước có tác dụng lớn đời sống sức khỏe người Từ trước đến giới hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ln đóng vai trị quan trọng đời sống người Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đựơc dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp dược phẩm làm thuốc chữa bệnh, công nghiệp thực phẩm, hương liệu mỹ phẩm, thuốc… Thảo dược nguồn nguyên liệu trực tiếp chất dẫn đường để tìm kiếm loại biệt dược Theo số liệu thống kê cho thấy có khoảng 60% loại thuốc lưu hành giai đoạn thử nghiệm có nguồn gốc từ hợp chất thiên nhiên [5] Chính chúng tơi chọn đề tài: “Tách xác định cấu trúc hợp chất daidzin từ thân sắn dây (Pueraria lobata Willd) Việt Nam” từ góp phần xác định thành phần hố học hợp chất tìm nguồn nguyên liệu cho ngành hóa dược Nhiệm vụ nghiên cứu Trong luận văn này, chúng tơi có nhiệm vụ: - Chiết chọn lọc với dung mơi thích hợp để thu hỗn hợp hợp chất từ sắn dây (Pueraria lobata Willd.) - Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ thân sắn dây Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu dịch chiết từ thân sắn dây (Pueraria lobata Willd.) thuộc họ Đậu (Fabaceae) Việt Nam Chương TỔNG QUAN 1.1 Chi Pueraria [18] 1.1.1 Đặc điểm thực vật Cây sắn dây (P montana var lobata), sắn dây nhiệt đới (P phaseoloides) dạng tương quan phân loại chi Pueraria thuộc họ Đậu (Leguminosae) Hiện có khoảng 15 lồi phân loại trực giác mục: mục Nonnudiflorae Maesen, Pulcherrima Maesen, Schizophyllon Baker Ngồi ra, cịn có số loại khác Mỗi loại có lồi phụ như: P.candollei có loại, P.montana P.phaseoloides loại có lồi phụ….Chi Pueraria lồi phân tán qua Trung Quốc, Nhật Bản, phía Nam, phía Đơng châu Á, số Oceania Bảng 1.1: Bảng phân bố địa lý loài chi Pueraria Các loài Pueraria P aplopecuroides P bella P calycina P.candollei var.candollei var mirifica P.edulis P.imbricata P.lacei P.montan Khu vực phân bố Trung Quốc, Vân Nam, Myanma, Thái Lan Ấn Độ, Myanma Trung Quốc, Vân Nam Banglades, Ấn Độ ,Myanmar, Thái Lan Myanma, Thái Lan Butan , Trung Quốc, Vân Nam, Ấn Độ Lào, Thái Lan Myanma var.chinensis Butan, Trung Quốc, Đông Bắc Ấn Độ, Lào var.lobata Butan, Trung Quốc, Đông Bắc Ấn Độ, Lào, Philippin, var.montana Việt Nam, Australia, Châu Đại Dương, số khu vực P peduncularis nhiệt đới… Butan, Trung Quốc, Vân Nam, Tứ Xuyên, Ấn Độ, phía đông Himalaya, đồi Khasi, Myanmar, Pakistan P phaseoloides var javanica Brunây, Indonesia, Malaysia, Philippin, quần đảo Solomon, số nước vùng nhiệt đới var phaseoloides var subspicata P pulcherrima P sikkimensis P stricta P tuberosa P wallichii Đông Nam Á, New Guinea, Châu Phi Nam Mỹ Banglades, Butan, Đông Bắc Ấn Độ, Thái Lan Đông Indonesia, Philippin, đảo Kei, đảo Solomon Butan, Ấn Độ… Trung Quốc, Vân Nam, Myanma, Thái Lan Trung Quốc, Nepal, Pakistan Banglades, Trung Quốc, Vân Nam, Ấn Độ, phía đơng Hymalia… 10 Hầu tất loài chi Pueraria mệnh danh “những người leo trồng tài giỏi”, vài loại có rễ củ Thân thon dài, lên tới 20m, mọc đối, hoa mọc thành chùm từ nách thường dài 3040cm, hoa có màu thay đổi từ trắng đến xanh màu đỏ tía Những lồi chi Pueraria lâu năm P montana var lobata sinh sản từ hạt giống, cắt đoạn thân già Những hạt giống thông thường gieo trồng mùa xuân phát triển từ 4-6 tháng Cây sắn dây tăng trưởng 30cm/1 ngày đạt tới 1830m/1 mùa Một số loại sắn dây hay sắn dây nhiệt đới…thì có củ Rễ sắn dây lan truyền theo chiều ngang chiều sâu tới 1m Những chổ lồi lên từ gốc có hình dạng béo, lớn bên chứa nhiều tinh bột dự trữ qua mùa đông góp phần hỗ trợ tăng trưởng mùa xn Đa số lồi chi Pueraria thích nghi với vùng gió mùa, nơi có trận mưa, ưa ánh sáng Chúng tìm thấy mép rừng, rừng nhiệt đới bụi rậm Chúng thường quấn quanh bụi rậm P.phaseoloides thích hợp với khí hậu ẩm ướt trận mưa Một hệ rễ rộng lớn cho phép chúng chống cự với thời tiết khô hạn thời gian ngắn thời kì nạn lụt Nói chung, tùy lồi chi Pueraria khác mà có yêu cầu khí hậu dẫn đến nơi sồng phân bố có khác 1.1.2 Thành phần hóa học Các lồi chi Pueraria biết đến loại thuốc tiếng Phương Đông Bằng phương pháp phân tích cực phổ, sắc kí… người ta tìm thấy có chứa chất : Polyphenol glycosit polyphenolic, isoflavon…trong isoflavon glycosit phần thử thiết yếu mang hoạt tính sinh học cao Hoạt tính sinh học Pueraria qui định có mặt isoflavon glycosit chúng Khi phân thích isoflavonoit sắc kí cột silisdioxit cho daidzein, 42 Hình 3.7.Phổ 13C-NMR hợp chất 53 43 Hình 3.9 Phổ DEPT hợp chất 53 44 Hình 3.10 Phổ DEPT hợp chất 53 45 Hình 3.11 Phổ HMBC hợp chất 53 46 Hình 3.12 Phổ HMBC hợp chất 53 47 Hình 3.13 Phổ HMBC hợp chất 53 48 Hình 3.14 Phổ HMBC hợp chất 53 49 Hình 3.15 Phổ HSQC hợp chất 53 50 Hình 3.16 Phổ HSQC hợp chất 53 51 Hình 3.17 Phổ HSQC hợp chất 53 52 Hình 3.18 Phổ COSY hợp chất 53 Hình 3.19 Phổ COSY hợp chất 53 53 Hình 3.20 Phổ COSY hợp chất 53 54 KẾT LUẬN Nghiên cứu thành phần hóa học thân sắn dây (Pueraria lobata Willd.) thành phố Vinh, Nghệ An thu số kết sau: Bằng phương pháp ngâm chiết với dung môi chọn lọc cất thu hồi dung môi thu cao tương ứng cao etylaxetat (267g), cao butanol (192 g), cao hexan (38 g), pha nước Phân lập hợp chất từ cao butanol phương pháp sắc ký kết tinh phân đoạn thu hợp chất 53 Đã tiến hành sử dụng phương pháp phổ khối lượng (EI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR DEPT để xác định cấu trúc hợp chất tách Từ liệu phổ cho phép khẳng định chất A daidzin Hợp chất tách từ sắn dây (Pueraria lobata Willd.) 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) (2003) Danh mục loài thực vật Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Tiến Bân (2000), Họ Na (Annonaceae), Thực vật chí Việt Nam, Flora of Vietnam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Vũ Văn Chuyên, Lê Trần Chấn, Trần Hợp (1987), Địa lý họ Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thượng Dong cộng (2006) Nghiên cứu thuốc từ thảo dược Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Trần Đình Đại (1998) Khái quát hệ thực vật Việt Nam Hội thảo Việt-Đức hóa học hợp chất thiên nhiên Hà Nội, 16-18 April, tr17-27 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985) Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc Nhà xuất Y học, Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (1992) Cây cỏ Việt Nam Montreal Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mỹ Kinh, Phạm Hùng Việt (1985) Các phương pháp sắc kỹ Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (Tập 2) Nhà xuất 10 Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Hoàng Trọng Quang, Nguyễn Thị Kim Liên Dược điển Nhà xuất Khoa học- Hội đồng Dược diển Tiếng Anh 11 Arao T., Kinjo, J., Nohara T and Isobe R (1995), Oleanene-type triterpene glycosides from Puerariae radix II Isolation of saponins 56 and the application of tandem mass spectrometry to their structure determination Chem Pharm Bull., 43, 1176–1179 12 Dictionary of Natural product on CD-Rom, Chapman and Hall-CRC (2005) 13 Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P., Grishchenko O.V., Veselova M.V., Krivoschekova O E., Kulesh N I., Denisenko V.A., Tchernoded G.K., Zhuravlev Y.N (2008), Isoflavonoid composition of a callus culture of the relict tree Maackia amurensis Rupr et Maxim J Agric Food Chem 56(16) 7023-31 14 Kim JM, Lee YM, Lee GY, Jang DS, Bae KH, Kim JS (2006), Constituents of the roots of Pueraria lobata inhibit formation of advanced glycation end products (AGEs), Arch Pharm Res., 29 (10) 821-825 15 Kinjo, J., Furusawa J., Baba J., Takeshita T., Yamasaki, M and Nohara, T (1987), Studies on the constituents of Pueraria lobata III Isoflavonoids and related compounds in the roots and the voluble 16 stems Chem Pharm Bull., 35, 4846–4850 Prasain J.K., Reppert A., Jones K., Moore D.R., Barnes S., Lila M.A (2007), Identification of isoflavone glycosides in Pueraria lobata cultures by tandem mass spectrometry, Phytochem Anal 18(1) 50-9 17 WHO monographs on selected medicinal plants (Volume 1) World Health Organization Geneva 1999 18 Wing Ming Keugn (2002) The genus pueraria, Harvard Medical School, Boston, USA First published 2002 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT DAIDZIN TỪ THÂN VÀ LÁ CÂY SẮN DÂY (PUERARIA LOBATA WILLD) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: HÓA DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC... gốc từ hợp chất thiên nhiên [5] Chính chúng tơi chọn đề tài: ? ?Tách xác định cấu trúc hợp chất daidzin từ thân sắn dây (Pueraria lobata Willd) Việt Nam? ?? từ góp phần xác định thành phần hố học hợp. .. (Pueraria lobata Willd.) - Phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ thân sắn dây Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu dịch chiết từ thân sắn dây (Pueraria lobata Willd.) thuộc họ Đậu (Fabaceae) Việt