1 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Ung thư bệnh nan y, gánh nặng bệnh tật toàn cầu gây tỉ lệ tử vong cao Theo báo cáo Hiệp hội Quốc tế chống ung thư (UICC) cho thấy bệnh ung thư nguyên nhân gây tử vong cho gần triệu người năm 2004 chiếm 12,5% tổng số người chết bệnh tật Con số người mắc bệnh ung thư tăng nhanh đạt tới số 16 triệu người vào năm 2020 dự đoán Tổ chức Y tế giới WHO [1] Do vậy, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa chữa trị bệnh nan y đặc biệt bệnh ung thư tất yếu cần thiết, qua góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng quốc gia giới Hiện nay, hướng tìm kiếm thuốc phịng chữa trị ung thư có hiệu lực nhà khoa học quan tâm hướng tập trung vào hợp chất thiên nhiên có nguồn ngốc từ thực vật Theo đánh giá Tổ chức Y tế giới, 80% dân số giới tin dùng loại thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu khoảng 60% tác nhân hoá trị liệu khác dùng điều trị ung thư có nguồn gốc từ hợp chất tự nhiên [54], [55], [56] Việt Nam nước nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa với khoảng 3/4 diên tích nước rừng núi trùng điệp thảm thực vật phong phú đa dạng Đây điều kiên thuận lợi để hướng nghiên cứu phát triển thuốc phòng chữa trị ung thư từ thực vật hồn tồn Theo hướng nghiên cứu này, Viên nghiên cứu ung thư quốc gia Hoa kỳ (National cancer Institute - NCI) hợp tác với nhiều quốc gia Bangladesh, Viêt Nam, Brazil, Costa Rica, Lào, Mêxicô, v.v… để nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất từ thực vật có khả phòng chống chữa trị ung thư [33], [58], [59] Đến nay, số hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên chích thức sử dụng cho bệnh nhân ung thư Camptothecine chiết xuất từ Hạnh phúc (Camptotheca acuminata) [60], hai hoạt chất Vinblastine Vincristine chiết xuất từ Dừa cạn (Catharan thus roseus L G.Don) [61], Taxol chiết xuất từ Thông đỏ ( Taxus brevifolia) [62], v.v… Nổi bật năm 2006, Đỗ thị Thảo - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam phát hiên hoạt chất Scuterbarbalactone VN (SBVN) hoạt chất lần phân lập, tách chiết từ Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don) chứng minh cấu trúc hố học có khả diệt ức chế nhiều loại tế bào ung thư phát triển điều kiện in-vitro, hoạt chất có hoạt tính mạnh diệt ức chế tế bào ung thư phát triển gây độc với tế bào thường Dù hoạt chất để phát triển thành thuốc chữa bệnh, sau chứng minh điều kiện in-vitro phải thử nghiêm mức độ in-vivo để tạo sở cho nghiên cứu tiền lâm sàng (Preclincal) thử nghiệm lâm sàng (Clinical trial) Vì thế, muốn tiếp tục nghiên cứu sâu khả phòng chữa ung thư hoạt chất SBVN mức in-vivo Qua đó, tạo sở cho nghiên cứu khoa học thử nghiêm tiền lâm sàng lâm sàng sau này, nhằm đến đích cuối làm thuốc phòng ngừa chữa trị ung thư có hiệu kinh tế an tồn cho nhân dân góp phần vào việc chăm sóc bảo vệ sức khoẻ cho cộng đồng, tiến hành nghiên cứu đề tài ''Thăm dò khả phòng chữa ung thư hoạt chất Scuterbarbalactone VN từ bán chi liên chuột gây ung thư thực nghiệm'' Mục tiêu nghiên cứu đề tài • Gây u thực nghiệm chuột BALB/c tế bào LLC (Lewis Lung Carcinoma) để tạo mơ hình cho nghiên cứu khả phòng chữa ung thư hoạt chất SBVN • Tìm hiểu chứng minh khả phòng chữa ung thư hoạt chất SBVN mức in-vivo • Thiết lập tiền đề cho thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng hoạt chất tiềm SBVN Nội dung nghiên cứu đề tài • Gây ung thư thực nghiệm chuột nhắt trắng dịng BALB/c hố chất 7,12- dimethyl[a]anthracene (DMBA) dịng tế bào ung thư ni cấy in-vitro LLC • Kiểm tra xác định liều độc cấp tính gây chết 50% động vật thí nghiệm LC50 (lethal dose) hoạt chất SBVN • Dựa vào kết nghiên cứu độc tính in-vitro có liều độc cấp LC50, tiến hành xác định nồng độ SBVN sử dụng cho bước thử nghiệm in-vivo chuột • Thực việc sử dụng hoạt chất SBVN làm chất bảo vệ để ngăn chặn phát triển diệt khối u ung thư thực nghiệm • Thu nhận kết quả, tiến hành xử lí số liệu thống kê hệ thống để phân tích liệu, thiết lập hình bảng minh hoạ, từ rút kết luận nghiên cứu Chương TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TÌNH HÌNH UNG THƯ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Ung thư bệnh nan y, gây tỉ lệ tử vong cao Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới (WHO) bệnh ung thư dần vượt qua bệnh tim mạch để trở thành bệnh gây tử vong cao giới Trong năm từ 1998-2002, có 24,6 triệu người chết ung thư, riêng năm 2004 có triệu bệnh nhân ung thư tử vong thêm 11 triệu người mắc bệnh [52], [53] Trong tổng số 58 triệu người chết toàn giới năm 2005, bệnh ung thư nguyên nhân gây tử vong cho 7,6 triệu (hay 13% tổng số) người Các ca tử vong ung thư khơng ngừng tăng, với mức ước tính khoảng triệu người chết ung thư vào năm 2015 11,4 triệu người chết vào năm 2030 (http://www.benhungthu.net.vn) Các loại bệnh ung thư dẫn đến tỷ lên tử vong chung như: Bệnh ung thư Phổi khiến 1,3 triệu người chết năm Bệnh ung thư Dạ Dày khiến triệu người chết năm Bệnh ung thư Gan khiến 662.000 người chết năm Bệmh ung thư Đại Tràng khiến 655.000 người chết năm Bệnh ung thư Vú khiến 502.000 người chết năm Số người chết bệnh ung thư thường rơi vào quốc gia có thu nhập bình qn trung bình thấp (http://www.benhungthu.net.vn) Ung thư gánh nặng bệnh tật toàn cầu Ở Việt Nam, chưa có thống kê đầy đủ theo thơng tin từ bệnh viện K Trung ương, năm nước có thêm khoảng 150.000 ca mắc ung thư 75.000 ca tử vong bệnh ung thư (theo báo www.ungthu.net.vn) Theo dự báo Bộ Y tế Hội nghị sơ kết phòng chống ung thư tháng 7/2009, năm 2010 Việt Nam có khoảng 200.000 trường hợp mắc ung thư 100.000 người tử vong Tuy nhiên, điều đáng lo ngại số bệnh nhân mắc bệnh ngày trẻ hoá, tế bào ung thư có xu hướng ác tính thường cao thời gian để khối u có kích thước nhân ngắn (http://www.ungthu.net.vn) Như vậy, ung thư nguyên nhân hàng đầu gây tử vong Việt Nam Ung thư xảy nam nữ, nam giới, bệnh ung thư thường gặp như: phổi, gan, vòm họng nữ ung thư vú, ung thư cổ tư cung Đặc biệt, ung thư nữ thường xuất độ tuổi 40-50, ngồi ung thư cịn mối đe dọa với người già Ung thư có khả điều trị khỏi phát giai đoạn sớm Để hạn chế gia tăng bệnh này, việc tìm phương cách phòng chữa trị ung thư mối quan tâm thực cấp thiết Phương hướng tìm kiếm thảo dược lấy từ tự nhiên, để phòng chữa trị ung thư ưu sách 1.2 UNG THƯ HỌC, ĐẶC TÍNH CƠ BẢN, NGUYÊN NHÂN VÀ CÁC PHƯƠNHG PHÁP PHÒNG TRÁNH, CHỮA TRỊ Ung thư tên chung dùng để gọi nhóm bệnh 200 loại khác nguồn gốc tế bào phát sinh, khả di căn, tiên lượng cách thức điều trị có chung đặc điểm bật tăng sinh vô hạn, vô tổ chức khơng tn theo chế kiểm sốt phát triển của thể, di căn, tồn tại, xâm lấn phát triển tế bào ưng thư [3], [4], [32] Ung thư bênh tế bào, ung thư thường xuất phát từ tế bào ban đầu tổ chức thể vượt qua chế kiểm soát thể, phát triển, sinh sơi khơng ngừng, hình thành đám tế bào có chung đặc điểm phát sinh, phát triển vô tổ chức xâm lấn chèn ép vào mô, quan tổ chức xung quanh Như ung thư bệnh lý ''ác tính'' tế bào đa dạng ngun, cách phịng bệnh, chẩn đốn điều trị Hippocrate, nhà y học Hy Lạp cổ đại xem người nhận dạng bệnh ung thư ông đặt tên cho bệnh ''karkino'' theo tiếng Hy lạp có nghĩa cua xâm lấn, phát triển khối u ác tính nhắc ơng nhớ tới hình ảnh ''con cua có tua tủa'' Ngày ung thư học giới biết đến với từ ''cancer'' theo tiếng anh có nghĩa cua tiếng la tinh [5], [17] 1.2.1 Các đặc tính bệnh ung thư • Ung thư bệnh tế bào Ung thư tế bào phải thời gian nhiều năm có khích thước đủ lớn xuất dấu hiệu nhận biết Thơng thường, tế bào có tuổi thọ định tuân thủ chặt chẽ theo qui luật chung ''phát triển - già - chết'' Các tế bào chết lại thay tế bào Cơ thể có chế kiểm soát qui luật nghiêm gặt trì số lượng tế bào quan, tổ chức mức ổn định Bệnh ung thư bắt đầu có tế bào vượt qua chế kiểm sốt thể, phát triển, sinh sơi khơng ngừng, hình thành đám tế bào (khối u) có chung đặc điểm phát triển vơ tổ chức, xâm lấn chèn ép vào quan, tổ chức xung quanh gây tử vong cho người bệnh [12], [21] • Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn Quá trình phát triển từ tế bào ung thư ban đầu thành khối u ung thư đe dọa tính mạng người bệnh trải qua nhiều giai đoạn [32] Giai đoạn đầu trình hình thành tế bào ung thư khởi phát ảnh hưởng tác nhân nội bào hay ngoại bào Tiếp theo q trình phân chia liên tục khơng ngừng tế bào ung thư để thành khối u gọi trình phát triển bệnh Các tế bào ung thư khối u tiếp tục tăng sinh, tự phụ cảm nhận biết giới hạn với tế bào lân cận sản xuất ạt cytokine (cell signals) enzym protease dẫn tới phá huỷ màng đệm lót mơi trường ngoại bào bao quanh, khiến chúng liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt khỏi khối u mẹ, theo mạch máu mạch bạch huyết di chuyển tới tổ chức quan mới, bám lại tiếp tục tăng sinh vơ tổ chức Q trình gọi di (metastatic process) Các tế bào ung thư chèn ép hay di vào quan giữ chức sống thể não, tim, phổi, gan, thận v.v khiến bệnh nhân tử vong [1], [21], [57] Như vậy, trình hình thành phát triển bệmh ung thư tóm tắt hình Tế bào bình thường Tác nhân nội bào ngoại bào Tế bào ung thư Quá trình tăng sinh phát triển U ác tính Di xâm lấn Tử vong Chữa trị Sống sót Hình Sơ đồ hình thành phát triển ung thư 1.2.2 Khái quát tế bào ung thư • Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào Theo nguồn gốc phát sinh, ung thư nhà khoa học phân chia gồm [27], [32], [57] - Carcinoma (nguồn gốc biểu bì): dạng ung thư phổ biến nhất, phát sinh từ tế bào có nguồn gốc từ phơi phơi ngồi Như ung thư phổi, ung thư vú, ung thư trực tràng, v.v… - Sarcoma (ung thư liên kết): dạng ung thư gặp, phát sinh từ tế bào có nguồn gốc phơi tế bào thuộc vào hệ thống chống đỡ cho thể xương, sụn, mỡ, mô liên kết - Lymphoma (ung thư hạch): dạng ung thư gặp phát sinh từ hạch bạch huyết mô thuộc hệ thống miễn dịch thể ung thư Lymphoma Burkitt - Leukemia (ung thư máu - bệnh bạch cầu): dạng ung thư nguy hiểm biểu bệnh sớm, trẻ em người trẻ tuổi, phát sinh từ mô tạo máu, tế bào máu non thuộc tuỷ xương có xu hướng tích tụ thành số lượng lớn hệ máu trường hợp ung thư bạch cầu cấp tính (Human Acute Leukemia) • Các đặc tính tế bào ung thư Nhìn chung, tế bào ung thư biệt hố so với tế bào bình thường phân chia nhanh chóng diễn liên tục [21] Trong trình phân chia, đặc tính tiềm ẩn chúng thay đổi bất thường nhanh theo thời gian Ví dụ, tế bào ung thư gan khả sản xuất vài loại enzym đặc trưng so với tế bào gan bình thường khác qua nhiều lần phân chia bất thường, chúng chí hẳn chức đặc trưng tế bào gan Kiểu bất thường biến đổi nhanh chóng hệ gien tế bào ung thư Các tế bào ung thư thường có nhiều nhiễm sắc thể bất thường khơng ổn định Hình thái, tế bào ung thư có tỉ lệ nhân/tế bào chất cao, nhân to, bờ nét không rõ, xuất nhiều sợi phân bào so với tế bào bình thường khác [17], [21], [32] Do đó, tế bào ung thư có đặc tính riêng như: - Khả xâm lấn di tế bào ung thư Đây tính đặc trưng nguy hiểm tế bào ung thư riêng tế bào ung thư có Các tế bào ung thư không khu trú chỗ mà chúng tăng cường xâm lấn vào quan, tổ chức sống lân cận, xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn bạch huyết để di chuyển tới vị trí cách xa nơi tế bào ung thư phát sinh Tại vị trí mới, tế bào ung thư lại tiếp tục tăng sinh tạo khối u mới, chèn ép vào tổ chức mang chức sống thể gây tử vong cho bệnh nhân Hiện nay, đặc thù tế bào ung thư chưa hoàn toàn sáng tỏ sở khoa học [17], [21], [57] Khả di tế bào ung thư phụ thuộc vào tiềm phát triển chúng vị trí bị bao quanh tế bào hoàn toàn khác biệt mặt chức hình thái Tiềm có nhờ xuất số protein tế bào ung thư Ví dụ, số enzym tế bào ung thư tiết làm thoái hoá phân tử collagen hay số protêin màng đệm lót khác proteolycan, glycosaminoglycan để chúng xâm nhập, tồn phát triển tổ chức, quan mà chúng vừa di chuyển tới [21], [50], [57] - Khả sinh sản khơng thể kiểm sốt tế bào ung thư Trong thể người, phút có tới 10 triệu tế bào sinh sơi Q trình phân chia diễn theo trình tự khn mẫu kiểm soát chặt chẽ Khi tế bào bình thường trở thành tế bào ung thư, phân chia bất thường Quá trình phân chia bất thường diễn nhanh bình thường tế bào cháu sinh không trưởng thành chết tế bào bình thường khác Ngược lại, chúng tiếp tục trình phân chia vô tổ chức ngày trở nên khác biệt di truyền với tế bào mẹ ban đầu [11], [50], [57] -Khả vượt qua kiểm soát hệ miễn dịch tế bào ung thư Tế bào ung thư có khả vượt qua kiểm sốt hệ miễn dịch để tồn phát triển Trong hệ máu thể có tế bào “giết tự nhiên” (Natural Killer Cell) nhận dạng tiêu diệt tế bào lạ xâm nhập hay xuất thể Tuy nhiên, điều đáng ngạc nhiên 10 tế bào ung thư có thay đổi đáng kể khác lạ với tế bào bình thường lại khỏi phát tiêu diệt hệ miễn dịch [65] Có lẽ tế bào ung thư che dấu để vượt qua nhận biết tế bào Lympho Kết hệ miễn dịch thể phát tế bào ung thư tiêu diệt chúng Tế bào ung thư tế bào thể bệnh nhân bị biến chất, thối hố nguy làm hệ miễn dịch khơng nhận biết [21] 1.2.3 Nguyên nhân gây bệnh ung thư Đến nay, chưa thể xác định rõ loại nguyên nhân chung cho loại ung thư, loại ung thư có nguyên nhân riêng biệt, tác động theo nhiều chế khác chia làm nhóm tác nhân lớn: Tác nhân mơi trường tác nhân sinh học [3], [4] • Tác nhân mơi trường: gồm tác nhân hố học, vật lý Tác nhân hố học gây ung thư khói thuốc lá, thành phần hoá học thuốc trừ sâu, sản phẩm phụ gia dùng cho bảo quản thực phẩm, tạo mầu không đạt tiêu chuẩn, chất A-mi-ăng Trong khói thuốc xem mối nguy hại tiềm ẩn lớn cho sức khoẻ cộng đồng với 20 chất hố học có khả gây bệnh ung thư như: ung thư phổi, quản, thực quản, v.v… Ngồi khí đốt xăng dầu, động cơ, khí thải nhà máy cơng nghiệp, v.v… xem độc hại gây ôi nhiễm môi trường nguyên nhân gây bệnh ung thư cao cho người [4], [21], [36], [57] Tác nhân hoá học gây ung thư theo cách: * Tác động trực tiếp đến hệ gen gọi nhóm carcinogen dẫn xuất nitrosamin có nhiều thành phần thuốc lá, alcohol rượu, polycyclic hydrocarbon (PAH), polyvinyl chloride (PVC), thuốc trừ sâu chứa DDT, aflatoxin nấm mốc v.v… [4], [21] ... VN từ bán chi liên chuột gây ung thư thực nghiệm'' '' Mục tiêu nghiên cứu đề tài • Gây u thực nghiệm chuột BALB/c tế bào LLC (Lewis Lung Carcinoma) để tạo mơ hình cho nghiên cứu khả phịng chữa ung. .. thư? ??ng, không cần giữ 4oC nhiệt độ thấp 1.5 MƠ HÌNH GÂY UNG THƯ THỰC NGHIỆM TRÊN ĐỘNG VẬT Mơ hình nhằm kiểm tra, đánh giá tác dụng phòng chữa trị ung thư hoạt chất tiềm động vật gây ung thư thực. .. bào cho thí nghiệm kiểm chứng khả phịng chống ung thư hoạt chất SBVN Chuột thí nghiệm gây u dòng tế bào ung thư LLC Động vật thí nghiệm: 45 chuột BALB/c khoẻ mạnh chia làm lô (5 chuột/ lô), nuôi