TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC ===  === TÌM HIỂU HOẠT TÍNH CỦA ENZIM PTOTEZA Ở VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Dương Tuệ Sinh viên thực hiện : Phan Thị Huyền VINH - 2011 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu, sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn Dương Tuệ, người thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn di truyền – vi sinh – phương pháp giảng dạy, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như sự hướng dẫn giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn hỗ trỡ, giúp đỡ cho tôi cả về tinh thần, vật chất lẫn công sức để cho tôi hoàn thành tốt để tài. Trong quá trình thực hiện đề tài, do thời gian và kinh nghiệm còn hạn chế nên đề tài không tránh khỏi những thiếu sót về nội dung và hình thức, rất mong nhận được sự góp ý của các thầy, cô giáo, bạn bè để đề tài được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Vinh, tháng 5 năm 2011. sinh viên Phan Thị Huyền 2 Mục lục Mở đầu 1. I. Đặt vấn đề . 1. II. Mục tiêu . 2 III. Nhiệm vụ . 3. Chương I: Tổng quan tài liệu. 1.1. Cở sở khoa học . 4. 1.1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis: 4. 1.1.2. Tổng quan về enzim . 5. 1.1.3. Các chế phẩm enzim .7. 1.1.4. Các enzim vi sinh vật, sinh tổng hợp và phương pháp 9. 1.1.5. Enzim proteaza của vi sinh vật 11 1.1.6. Sự phân giải protein . 12. 1.1.7. Đặc tính và ứng dụng của proteaza 13. 1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15. 1.2.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn và enzim proteaza trong nước 15. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới . 16. Chương II: Đối tượng thời gian và phương pháp nghiên cứu. 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu . 20. 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 20. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 20. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu . 20. 2.2 Phương pháp nghiên cứu . 20. 2.2.1. Phương pháp thu xử lý và bảo quản mẫu . 20. 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn . 21. 2.2.3. Phương pháp phân loại vi khuẩn 22. 2.2.4. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường tăng sinh . 22. 4 2.2.5. Phương pháp xá định số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis . 24. 2.2.6. Phương pháp xác đinh tốc độ tăng trưởng theo Black man . 26. 2.2.7. Phương pháp quan sát tế bào . 26. 2.2.8. Phương pháp nghiên cứu các yêu tố 26. 2.2.9. Phương pháp xác đinh các yếu tố 27. 2.2.10. Phương pháp xác đinh hoạt tính 28. 2.2.11. Phương pháp phân lập 29. Chương III: Kết quả nghiên cứu. 3.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn . 30. 3.1.1. Phân loại . 30. 3.1.2 Hình thái 30. 3.2. Số lượng, vi khuẩn Bacillus subtilis . 31. 3.3 Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng . 32. 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ . 32. 3.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm 35. 3.3.3. Ảnh hưởng của PH . 37. 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính enzim . 40. 3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ . 40. 3.4.2. Ảnh hưởng của độ ẩm 43. 3.4.3. Ảnh gưởng của PH . 45. 3.5. Ảnh hưởng của mật độ đến hoạt tính của enzim . 48. 3.6 Xây dựng quy trình thu nhận và làm sạch enzim . 50. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: Kết luận 53. Kiến nghị 53. Tài liệu tham khảo . 54. MỞ ĐẦU 6 I: ĐẶT VẤN ĐỀ. Enzim là những chất xúc tác sinh học được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp và nền kinh tế quốc dân như: Công nghiệp thực phẩm, y học, hóa phân tích… Người ta có thể thu nhận enzim từ nhiều nguồn khác nhau như từ động vật, thực vật, vi sinh vật. Tuy nhiên enzim lấy từ động vật, thực vật không ưu thế bằng enzim vi sinh vật do hoạt tính thấp, xúc tác không đa dạng, không chủ động điều khiển để thu nhận enzim. Vì thế không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzim thõa mãn nhu cầu của đời sống . Như vậy, trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì vi sinh vật là nguồn nguyên liệu dồi dào và hứa hẹn sẽ khắc phục được các hạn chế trên, vì thực tế đã chứng tỏ được ưu việt của nguồn nguyên liệu vi sinh vật (hóa sinh công nghiệp - Lê Ngọc Tú, 2005) - Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzim . - Hệ enzim vi sinh vật thì vô cùng phong phú và đa dạng . - Hệ enzim vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh . - Thu enzim từ vi sinh vật có khả năng tăng cường sinh tổng hợp các enzim nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao . - Việc nuôi vi sinh vật khá dễ dàng . Từ đó ta thấy rằng việc tách chiết enzim từ vi sinh vật thuận lợi và có ý nghĩa rất lớn . Mà một trong những vi sinh vật có khả năng cho khối lượng enzim lớn là chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, trong đó có enzim proteaza . Proteaza là enzim có rất nhiều ứng dụng ở các lĩnh vực khác nhau, trong công nghiệp chế biến thịt, công nghiệp sữa, sản xuất tơ tằm, trong y học… nó đã có những đóng góp to lớn trong đời sống con người. Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu, thu nhận enzim proteaza từ vi sinh vật còn đang phát triển, đang tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzim protein. 7 Còn ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về việc sử dụng enzim proteaza nhưng chủ yếu tập trung vào enzim proteaza của động vật, thực vật còn enzim proteaza từ vi sinh vật thì chỉ mới được nghiên cứu. Công nghệ enzim ở nước ta hiện còn đang mới mẻ, đang trong giai đoạn hưởng ứng và ngày càng hoàn thiện, việc đi sâu vào tìm hiểu enzim proteaza từ vi sinh vật cũng như những ứng dụng của nó là một vấn đề mang tính thời đại và cấp thiết. Xuất phát từ những ưu việt cũng như sự cấp thiết đó của enzim proteaza được chiết xuất từ vi sinh vật nói chung và từ vi khuẩn Bacillus subtilis nói riêng nên chúng tôi chọn đề tài: “Tìm hiểu hoạt tính của enzim proteza ở vi khuẩn Bacillus subtilis”. Nhằm mong muốn góp phần đưa ra những điều kiện tối thích cho việc sử dụng nó trong thực tiễn phục vụ đời sống con người. II: MỤC TIÊU Do thấy được vai trò của proteaza từ vi khuẩn Bacillu subtilis nên chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm mục tiêu: - Nuôi cấy từ đó phân lập chủng vi khuẩn Bacillus subtilis để có thể thu nhận được enzim. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis hướng tới việc điều khiển sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn theo mục đích sử dụng. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzim proteaza để tìm ra các điều kiện tối thích nhằm sử dụng enzim trong thực tiễn. - Xây dựng được quy trình sản xuất sinh khối Bacillus subtilis để thu nhận enzim. - Rèn luyện cho bản thân một số kỹ năng làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học. III: NHIỆM VỤ 8 Để đạt được mục tiêu trên thì nhiệm vụ của đề tài gồm: - Thu thập, xử lý, bảo quản mẫu. - Pha chế môi trường nuôi cấy, nuôi và phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis. - Nghiên cứu các đặc điểm sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis - Thực hiện các thí nghiệm về ảnh hưởng của một số điều kiện lên hoạt tính của enzim, từ đó tìm ra điều kiện tối thích cho hoạt tính của enzim proteaza gồm: Nhiệt độ, pH, độ ẩm (RH) . - Nghiên cứu tác dụng xúc tác của enzim proteaza. - Xây dựng được quy trình sản xuất sinh khối vi sinh vật để thu nhận enzim. 9 Chơng 1: Tổng quan tài liệu 1.1 Cơ sở khoa học: 1.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis: Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc loại trực khuẩn (Bacillus) là vi khuẩn có dạng hình que, nhuộm Gram dơng, có kích thớc (0,5-1)*(1-4) àm, có nội bào tử, sống hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc. Chúng sinh bào tử gần nh hình cầu để tồn tại trong trạng thái ngủ đông. Bacillus subtilis là loại vi khuẩn nổi tiếng làm hỏng thức ăn, bào t của nó có thể sống sót trong độ nóng cùng cực thờng thấy khi nấu thức ăn và đây chính là tác nhân làm h hỏng bánh mì [2]. Hệ enzim của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm: Proteaza, Amylaza, Glucoamylaza, Glucanaza, Celluloza, Dextranaza, Pectinaza [21]. Quan sát dới hính hiển vi Bacillus subtilis đơn lẻ có dạng hình que, phần lớn những chiếc que này có bào tử hình oval có khuynh hớng phình ra một đầu. Thờng khi quan sát thấy tập đoàn của vi khuẩn này rất rộng lớn, có hình dạng bất định. Bacillus subtilis không phải là tác nhân gây bệnh cho con ngời, nó có thế gây ô nhiễm thực phẩm nhng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm, có thể sinh ra enzim phân giải protein subtilisin. Là loài sống phổ biến nhất đợc thấy nhiều trong môi trờng đất và trên bụi cây rậm. Chúng có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ thải ra từ thức ăn d thừa và phế thải nhờ có khả năng tổng hợp các enzim phân huỷ các hợp chất hữu cơ nh : Poteaza, Amylaza Chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn làm giảm số lợng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá mức nh: Vibrio, Aeromonas. Vi khuẩn Bacillus subtilis đã đợc ứng dụng khá nhiều trong các nghành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzim nh Proteaza, Amylaza, [2]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc [3]. 1.1.2 Tổng quan về enzim: 10 . TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC ===  === TÌM HIỂU HOẠT TÍNH CỦA ENZIM PTOTEZA Ở VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Giáo vi n hướng. chọn đề tài: Tìm hiểu hoạt tính của enzim proteza ở vi khuẩn Bacillus subtilis . Nhằm mong muốn góp phần đưa ra những điều kiện tối thích cho vi c sử dụng