4/20/2010 1 PHẦN II: CƠ SỞ DI TRUYỀN HỌC CHƯƠNG VIII: SINH TỔNG HP PROTEIN TS. Nguyễn Hồi Hương Gene ENZYME Kiểu gene KIỂU HÌNH Mối quan hệ giữa kiểu gene và kiểu hình, giữa gene và enzyme được khám phá VIII. 1. Gene kiểm tra các phản ứng sinh hóa 1. Những sai hỏng trao đổi chất bẩm sinh ở người A. Garrod, 1923 xuất bản Inborn errors of metabolism, đầu tiên phát hiện bệnh Alkaptouria (nước tiểu đen) liên quan đến gene lặn.  Gene có liên quan đến phản ứng sinh hóa. Phát hiện tiếp theo: Bệnh Alkaptouria do thiếu enzyme oxidase của Homogentisic acid. Cho đến nay hàng nghìn bệnh di truyền trao đổi chất bẩm sinh được phát hiện. Ví dụ trong chu trình phenylalanine. Bệnh Phenylketon niệu do phenylalanine tồn đọng trong mô thần kinh gây kìm hãm phát triển trí tuệ Bệnh bạch tạng do thiếu sắc tố melanin Thiểu năng tuyến giáp bẩm sinh Bệnh gây thiểu năng trí tuệ Bệnh nước tiểu đen do tồn đọng homogentisic acid trong xương và sụn. Gene kiểm soát phản ứng sinh hóa Các bệnh di truyền do sai hỏng một gene 4/20/2010 2 2. Giả thuyết một gene – một enzyme G. W. Beadle và E. L. Tatum – gene kiểm tra phản ứng sinh hóa - giả thuyết 1 gene - 1 enzyme, 1941, giải Nobel 1958 Neurospora crassa Nấm sợi sống trên bánh mì Beadle và Tatum làm thí nghiệm trên nấm Neurospora crassa chứng tỏ thay đổi gene làm thay đổi tính trạng (thay đổi kiểu gene làm thay đổi kiểu hình), từ đó đề nghị giả thuyết một gene – một enzyme Bào tử túi Giả thuyết 1 gene – 1 polypeptide Thí nghiệm Beadle và Tatum Neurospora crassa (prototroph) nuôi trên môi trường tối thiểu Chíêu tia X lên bào tử Nuôi, lai với nấm không bò đột bến, lấy bào tử Nấm đột biến (auxotroph) không mọc trên môi trường tối thiểu Mọc trên môi trường bổ sung Môi trường tối thiểu bổ sung bằng amino acid Glutamic semialdehyte    Ornithine    Citrulline    Arginine G1- E1 G2-E2 G3-E3 (Prototroph – nguyên dưỡng Auxotroph – khuyết dưỡng) Kết luận từ thí nghiêm: chủng đột biến chỉ mọc trên mơi trường bổ sung Arg, suy ra chủng bị khuyết dưỡng đối với Arg hay một enzyme tổng hợp Arg bị hư hỏng do đột biến. Trong con đường tổng hợp Arg, bất kỳ gene mã hóa enzyme nào E1, E2 hay E3 bị đột biến đều tạo chủng khuyết dưỡng arg Một số định nghĩa trong thí nghiệm Beadle và Tatum Mơi trường tối thiểu (minimal medium): mơi trường cho chủng ngun dưỡng mọc gồm đường, khống và một vitamin. Mơi trường bổ sung (supplemented medium): mơi trường tối thiểu bổ sung thêm một chất dinh dưỡng Chủng ngun dưỡng (prototroph): chủng chưa đột biến có khả năng trao đổi chất tạo ra các chất cần thiết cho tế bào từ mơi trường tối thiểu Chủng khuyết dưỡng (auxotroph): chủng đột biến thay đổi trao đổi chất nên cần bổ sung thêm chất dinh dưỡng từ bên ngồi vào mơi trường ni cấy. 3. Khám phá ra RNA liên quan đến sinh tổng hợp protein RNA được phát hiện sau DNA RNA ở trong cả nhân lẫn trong tế bào chất: ribosome =2/3 RNA + 1/3 protein Nhiều virus chỉ có RNA Tách RNA từ virus đem tiêm vào têù bào chủ, tế bào sinh ra virus mới. RNA liên quan đến sinh tổng hợp protein 4/20/2010 3 VIII. 2. Học thuyết trung tâm (central dogma) của sinh học phân tử do Crick nêu ra năm 1956 Thông tin mã hóa trong đoạn DNA được truyền qua phân tử RNA Thông tin từ RNA được truyền cho protein. Không bao giờ xảy ra trường hợp truyền thông tin từ protein sang nucleic acid DNA có khả năng tự sao chép Dòng thơng tin di truyền đi từ DNA đến RNA rồi đến protein Các câu hỏi nảy sinh từ học thuyết trung tâm Thơng tin di truyền đi từ nhân ra tế bào chất như thế nào ? Tương quan nào tồn tại giữa trình tự nucleotide trong DNA và trình tự amino acid trong một sợi polypeptide/ protein ? Các giả thuyết của Crick về phiên mã dịch mã Sao chép DNA Sa lỗi DNA, tái tổ hợp di truyền Tổng hợp RNA - NHÂN Tổng hợp protein – TẾ BÀO CHẤT Phân tích học thuyết trung tâm Giả thuyết thơng tin (messenger hypothesis) và phiên mã (transcription) của Crick: mRNA tổng hợp từ khn DNA di chuyển từ nhân ra tế bào chất Giả thuyết phân tử adaptor (adaptor hypothesis) hay dịch mã (translation): tồn tại một phân tử adaptor tRNA một đầu nối với amino acid, đầu kia bắt cặp bổ sung với base trên mRNA Các RNA được tổng hợp trong q trình phiên mã (mRNA, rRNA và tRNA) để bảo đảm cho q trình dịch mã. Sự biểu hiện thơng tin di truyền 4/20/2010 4 Trường hợp đặc biệt: dòng thông tin di truyền ở RNA virus không tuân theo học thuyết trung tâm Retrovirus: RNA virus nhưng thông tin di truyền đi từ RNA – DNA – RNA - Protein RNA virus như virus khảm thuốc lá, virus cúm, virus bại liệt chứa thông tin di truyền trong RNA mạch đơn Thông tin di truyền đi từ RNA – RNA – RNA - Protein VIII.3. Phieân maõ (transcription) = Tổng hợp RNA dựa vào khuôn DNA mạch đơn Maïch khuoân RNA Nguyên liệu tổng hợp: NTP (ATP, UTP, CTP, GTP) a) Khởi sự phiên mã Enzyme RNA polymerase gắn vào promotor trên DNA tháo xoắn DNA mạch kép Promotor: trình tự nucleotide trên DNA mạch khuôn của mỗi gene (hay nhóm gene), nơi RNA polymerase gắn đặc hiệu để khởi sự phiên mã. Promotor quyết định 3 vấn đề: Nơi khởi sự phiên mã Mạch DNA nào là khuôn Hướng phiên mã. 1. Quá trình phiên mã b) Nối dài: RNA polymerase nối hai NTP đầu tiên bặt cặp bổ sung với DNA khuôn tại điểm khởi sự phiên mã (inition site) nối dài sợi RNA theo chiều 5’-3’ bắt cặp bổ sung với mạch DNA khuôn 4/20/2010 5 c) Kết thúc phiên mã Khi RNA polymerase gặp điểm kết thúc (termination site), tách rời khỏi DNA và RNA RNA mới tổng hợp rời khỏi DNA DNA tạo xoắn kép trở lại. 2. S khác nhau giữa phiên mã ở Prokaryote và Eukaryote Gắn chóp ở đầu 5’ Gắn đuôi ở đầu 3’ Splicing mRNA trưởng thành theo lỗ nhân ra ngoài tế bào chất Phiên mã Dòch mã Phiên mã Dòch mã Prokaryote: phiên mã, dịch mã đều xảy ra trong tế bào chất Eukaryote: phiên mã trong nhân, dịch mã trong tế bào chất Phiên mã ở Eukaryote Gene Eukaryote có tính gián đoạn: đoạn mã hóa exon + đoạn không mã hóa intron Phiên mã tạo tiền mRNA (pre-mRNA) chứa exon + intron Quá trình ghép nối (splicing) tạo mRNA trưởng thành: loại bỏ intron + ghép nối các exon Gắn chóp đầu 5’ và gắn đi đầu 3’ để mRNA trưởng thành có thể di chuyển từ nhân ra tế bào chất. Đuôi polyalanine Đầu 5’ gắn chóp (cap) là 7-methyl guanine Prokaryote: phiên mã một số gene cấu trúc liên tiếp, mRNA chứa thơng tin một số gene nối tiếp nhau (polycistronic mRNA) Eukaryote: phiên mã một gene, mRNA chứa thơng tin một gene (monocistronic mRNA) 4/20/2010 6 1. Mã di truyền (genetic code) “Ngơn ngữ” nucleic acid: A U C G “Ngơn ngữ” amino acid DỊCH MÃ Mã di truyền = mối tương quan giữa hai “ngơn ngữ” Mã di truyền (codon) = một số nucleotide trên mRNA tương ứng với một amino acid VIII.4. Dịch mã (translation): tổng hợp protein m Bảng mã di truyền Trình tự amino acid trên protein được mã hóa bằng nhóm các nucleotide trên mRNA 20 amino acid 4 base (A, U, C. G) 4 2 = 16 không đủ 20 aa 4 3 = 64 hợp lý 1 codon = 3 nucleotide Start codon: AUG = mã của Met = tín hiệu khởi sự dịch mã Stop codon: UAA, UAG, UGA = tín hiệu kết thúc dịch mã Mã di truyền dư nhưng khơng gây nhầm lẫn Một amino acid có nhiều mã di truyền (codon), trừ Met và Trp chỉ có một codon, tuy nhiên mỗi codon chỉ mã hóa cho một amino acid. Mã di truyền có tính thống nhất đối với mọi lồi (ngoại trừ rất ít) Nguồn gốc chung của sinh vật Có thể sử dụng bộ máy dịch mã của vi khuẩn để tổng hợp protein từ gene người. 2. tRNA (transport RNA) tRNA đóng vai trò chất nối (chất trung gian) giữa amino acid và mRNA Mỗi amino acid có tối thiểu một tRNA đặc hiệu. Cấu tạo: chiều dài 73-93 nucleotide Đầu 3’ có trình tự base CCA là nơi gắn amino acid tRNA gắn vào mRNA tại đối mã bằng cách bắt cặp bổ sung Đối mã Nơi gắn aa 3 chức năng của tRNA: -Chở một amino acid -Nối với mRNA -Nối với ribosome 4/20/2010 7 3. Ribosome = rRNA và protein 50S subunit 23S rRNA 5S rRNA 35 proteins Ribosome cuûa Prokaryote 60S subunit 28S rRNA 5S rRNA 5.8S rRNA 49 proteins 30S subunit 16S rRNA 21 proteins 40S subunit 18S rRNA 33 proteins Ribosome cuûa Eukaryote 70S ribosome 80S ribosome Hai tiểu đơn vị của ribosome chỉ gắn vào nhau khi có tổng hợp protein Chức năng: ribosome trong tổng hợp protein: giữ mRNA và tRNA ở đúng vị trí, tạo điều kiện thuận lợi cho dịch mã T site (transfer site): nơi tRNA đáp xuống ribosome. A site (amino acid site) : nơi đối mã của tRNA gắn vào codon của mRNA, quyết định amino acid được đưa vào chuỗi polypeptide. P site (polypeptide site): nơi tRNA chuyển amino acid sang sợi polypeptide đang được nối dài. E site (exit site): nơi khi tRNA còn ở lại sau khi đã cho amino acid. 4. Quá trình dịch mã a) Khởi sự: ii) tRNA chở Met gắn vào start codon AUG i) Tiểu đơn vị nhỏ của ribosome gắn vào trình tự base nhận biết trên mRNA iii) Tiểu đơn vị lớn gắn vào tiểu đơn vị nhỏ sao cho tRNA chở Met gắn vào P site b) Nối dài i) Nhận biết codon: đối mã của tRNA mới tới gắn vào codon ở A site ii) Hình thành liên kết peptide nhờ enzyme peptidyltransferase iii) Chuyển vị trí: tRNA tự do rời khỏi P site sang E site, ribosome dịch tới một codon, polypeptide dịch đến P site, tRNA tự do rời khỏi E site. 4/20/2010 8 c) Kết thúc ii) Yếu tố tách mạch tách tRNA khỏi P site và giải phóng sợi polypeptide iii) Các thành phần còn lại rời khỏi mRNA i) Khi A site ở ribosome là stop codon, yếu tố tách mạch (release factor) gắn vào stop codon Polyribosome tăng tốc tổng hợp protein Dòch mã diễn ra đồng thời với tạo cấu trúc protein Sợi polypeptide đang hinh thành Tạo cấu trúc đầu N Tạo cấu trúc đầu C Quá rình tạo cấu trúc kết thúc khi ra khỏi ribosome Sự vận chuyển (phân phối) protein sau khi tổng hợp 4/20/2010 9 VIII. 5. Đònh nghóa gene 1860, G. Mendel – nhân tố di truyền 1909, W. Johansen – dùng từ “gene” 1910, T. Morgan – gene nằm trên nhiễm sắc thể và chiếm một vò trí (locus) nhất đònh. Gene là đơn vò chức năng xác đònh một tính trạng. 1941 – G. Beadle & E. Tatum chứng minh đột biến gene gây biến đổi trao đổi chất, giả thuyết 1 gene – 1 enzyme; 1 gene – 1 polypeptide. 1953 – gene là chất di truyền (Watson & Crick); học thuyết trung tâm. Gene là đoạn DNA trên nhiễm sắc thể mã hóa một polypeptide hay RNA 1977 – R. Robert & P. Sarp phát hiện những đoạn DNA không mã hóa cho amino acid (intron) trên Eukaryote. Gene là đoạn DNA bảo đảm cho việc tạo ra một polypeptide gồm cả vùng trước và sau vùng mã hóa protein và cả những đoạn không mã hóa (intron) xen giữa những đoạn mã hóa (exon). Đònh nghóa tổng quát hiện đại: gene là đơn vò chức năng cơ sở của bộ máy di truyền chiếm một vò trí nhất đònh trên nhiễm sắc thể và xác đònh một tính trạng nhất đònh. Số lượng gene trong sinh vật Số lượng gene và kích thước gene của moat số sinh vật Sinh vật genes Số cặp base Thực vật <50,000 <10 11 Người, chuột 25,000 3×10 9 Cá nóc 40,000 4x10 8 Ruồi quả 13,767 1.3×10 8 Giun 19,000 9.7×10 7 Nấm 6,000 1.3×10 7 Vi khuẩn 500–6,000 5×10 5 –10 7 Mycoplasma genialium 500 580,000 DNA virus 10–900 5,000–800,000 RNA virus 1–25 1,000–23,000 Viroid 0–1 ~500 . polypeptide/ protein ? Các giả thuyết của Crick về phiên mã dịch mã Sao chép DNA Sa lỗi DNA, tái tổ hợp di truyền Tổng hợp RNA - NHÂN Tổng hợp protein – TẾ. bào chủ, tế bào sinh ra virus mới. RNA liên quan đến sinh tổng hợp protein 4/20/2010 3 VIII. 2. Học thuyết trung tâm (central dogma) của sinh học phân tử