Chương Công nghệ DNA tái tổ hợp I Mở đầu Cơng nghệ DNA tái tổ hợp hình thành từ năm 1970 nhờ phát triển phương pháp kỹ thuật dùng nghiên cứu trình sinh học mức độ phân tử Từ đó, cho phép phân lập, phân tích thao tác nucleic acid theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu biết sâu sắc lĩnh vực sinh học công nghệ sinh học, bào chế loại thuốc mới, y học phân tử liệu pháp gen Sự khám phá enzyme hạn chế (restriction endonuclease) năm đầu 1970 phát triển then chốt (key development) không cho khả phân tích DNA hiệu hơn, mà cịn cung cấp khả cắt phân tử DNA để tạo đoạn DNA tái tổ hợp mới, trình mà ngày gọi tạo dòng gen (gene cloning) Phương thức tạo dòng báo hiệu kỷ nguyên thao tác, phân tích khai thác phân tử nucleic acid Tạo dòng gen cho nhiều phát minh quan trọng cung cấp hiểu biết giá trị cấu trúc, chức điều hòa hoạt động gen Từ ứng dụng chúng, phương pháp xây dựng thư viện gen (gene library) hình thành phát triển, xem tảng sở cho nhiều thí nghiệm hóa sinh sinh học phân tử Mặc dù phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) để khuếch đại gen cho phép phân tích gen nhanh nhiều trường hợp kỹ thuật tạo dịng gen cịn hữu ích yêu cầu tuyệt đối Những phần cung cấp tranh tổng quát trình công nghệ DNA tái tổ hợp II Phân lập đoạn DNA/gen Một số phương pháp phân lập gen để thực kỹ thuật tái tổ hợp DNA sử dụng là: Nhập môn Công nghệ sinh học 31 Tách đoạn DNA từ genome Phương pháp thực sau: DNA hệ gen (genomic DNA) sinh vật cắt thành đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb (kích thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng) enzyme hạn chế gắn vào vector để xây dựng thư viện genome (genomic library) Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Thông thư bp, ví dụ Mbo - - (clone) Nhập môn Công nghệ sinh học 32 (physical mapping) Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA Đoạn DNA tổng hợp dựa khuôn mẫu mRNA gọi cDNA (complementary DNA) ba sau: - (Mg2+ - mRNA-cDNA (khi tổng hợp sợi th coli E (đ E coli - Sợi đ bacteriophage (cDNA library) Phân lập đoạn DNA phương pháp PCR Ngoài hai phương pháp trên, người ta sử dụng phổ biến phương pháp PCR để phân lập trình tự nucleotide (gen) từ genome Nhập môn Công nghệ sinh học 33 sinh vật dựa primer đặc hiệu cho trình tự Phương pháp PCR đơn giản tốn thời gian hai phương pháp trên, mà hiệu cao Mơ (ví dụ: não) Sinh tan tế bào tinh mRNA 5’ AAAAAA 3’ mRNA Gắn oligo(dT) primer 5’ Reverse transcriptase 5’ 3’ Tổng hợp sợi cDNA thứ khuôn mẫu mRNA AAAAAA 3’ mRNA TTTTTT AAAAAA 3’ mRNA TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ Biến tính nhiệt xử lý RNase H để phá hủy sợi mRNA Đầu 3’ cDNA tạo thành vịng cặp tóc DNA polymerase I TTTTTT 5’ Tổng hợp sợi cDNA thứ hai AAAAAA 3’ TTTTTT 5’ Nuclease S1 5’ 3’ AAAAAA 3’ TTTTTT 5’ cDNA sợi đôi 2.1 PCR kỹ thuật sử dụng phổ biến công nghệ sinh học đại đóng góp lớn cho tiến sinh học phân tử, đánh dấu bư enzyme hạn chế kỹ thuật Southern blot (phân tích DNA) Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 34 in vitro đ đ 20 nucleotide ▪ Nguyên tắc PCR Taq polymerase loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus tide (dATP, dCTP, dGTP dTTP) hai primer, sở khuôn mẫu đoạn DNA , nhờ đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự tạo dịng P DNA 3’ 5’ ) - Nguyên tắc PCR trình đầu tạo đoạn DNA có chiều dài xác định Nếu biết trình tự đoạn gen cần khuếch đại tổng hợp nhân tạo primer tương ứng để thực PCR tách chúng kỹ thu , qua từ 10-6 g DNA ban đầu khuếch đại lên tới PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau: - Gây biến tính (denaturation) 90-95oC Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khn mẫu dạng xoắn kép tách thành hai sợi đơn (single strands) Tất phản ứng enzyme giai đoạn bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó) - Gắn primer (annealing) 40-65oC Trong giai đoạn primer gắn vào vị trí có trình tự tương đồng DNA khuôn mẫu Các primer bị lắc nhẹ chung quanh chuyển động Brown liên kết ion tạo thành bị đứt gãy liên tục primer sợi đơn DNA khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn định hơ đoạn nhỏ (các primer đ Nhập môn Công nghệ sinh học 35 ) đ đơi (khn mẫu primer) enzyme Taq polymerase bắt đầu q trình chép khn mẫu Khuếch đại theo hàm mũ Gen đích Chu kỳ 35 DNA khuôn mẫu 22 = 23 = 24 = 16 236 = 68 tỷ Hình 2.2 Sơ đ phản ứng chuỗi polymerase (PCR) - Kéo dài phân tử (extension) 70-72oC Đây khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA vị trí có primer theo chiều 5’ 3’ Các primer có mối liên kết ion mạnh lực phá v Các primer vị trí khơng bắt cặp xác lại bị rời (do nhiệt đ Enzyme Taq polymerase bổ sung dNTP từ 5’ 3’ III Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào vector Enzyme hạn chế Việc phát enzyme hạn chế (restriction enzyme) vi khuẩn cắt DNA trình tự đặc trưng, giúp cho việc thao tác gen dễ dàng hơn, giảm chiều dài phân tử DNA thành tập hợp bao gồm đoạn ngắn Các enzyme hạn chế diện hầu hết tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai (của bacteriophage) tiếp quản máy tổng hợp Nhập môn Công nghệ sinh học 36 protein tế bào DNA chúng bảo vệ khỏi tác dụng enzyme hạn chế, nhờ có mặt enzyme nội bào methyl hóa (methylation) nucleotide đặc biệt, nucleotide khơng thể bị nhận biết enzyme hạn chế Mỗi enzyme hạn chế nhận biết cắt trình tự DNA đặc trưng chứa cặp nucleotide Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E coli cắt trình tự GAATTC, enzyme TaqI Thermus aquaticus cắt trình tự TCGA (Hình 2.3) Hiện nay, có 900 enzyme hạn chế khác tinh từ 230 chủng vi khuẩn Các enzyme hạn chế cắt gãy phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác trình bày hình 2.3: PvuII (Proteus vulgaris) EcoRI (Escherichia coli) (A1) (A2) RsAI (Rhodopseudomonas sphaeroides) TaqI (Thermus aquaticus) (B1) (B2) Hình 2.3 Các kiểu cắt nhận biết trình tự nucleotide enzyme hạn chế (A1): tạo đầu (A2): tạo đầu so le với trình tự nucleotide (B1): tạo đầu (B2): tạo đầu so le với trình tự nucleotide - Cắt đường thẳng đối xứng để tạo phân tử đầu (Hình 2.3, A1 B1) Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 37 - Cắt vị trí nằm đối xứng quanh đường thẳng đối xứng để tạo phân tử đầu so le (đầu dính) (Hình 2.3, A2 B2) Vì enzyme hạn chế nhận biết trình tự nhất, số vị trí cắt phân tử DNA đặc biệt thường nhỏ Các đoạn DNA cắt enzyme hạn chế phân tách theo kích thước điện di agarose gel để nghiên cứu Do tương tự tổ chức phân tử tất thể, DNA vi khuẩn, DNA thực vật DNA động vật có vú tương hợp cấu trúc Vì thế, đoạn DNA từ dạng sống dễ dàng pha trộn với DNA dạng sống khác Sự tương tự phù hợp plasmid, nhân tố di truyền ngồi nhân tìm thấy nhiều lồi vi khuẩn khác Chúng phân tử DNA mạch vịng đóng-sợi đơi dùng làm vector mang đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) dùng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Các vector dùng để tạo dòng đoạn DNA in vitro 5’-PO4 Trong thực tế, đoạn DNA gắn với để tạo phân tử DNA tái tổ hợp thường đoạn ngẫu nhiên DNA hệ gen, mà thay vào đoạn DNA mang gen từ sinh vật eukaryote vi khuẩn đoạn DNA khác thường phân tử vector (vector molecule) hoạt động vật truyền để chuyển gen quan tâm vào vi khuẩn tế bào eukaryote Hai loại vector sử dụng phổ biến loại có nguồn gốc từ plasmid vi Nhập môn Công nghệ sinh học 38 khuẩn loại khác có nguồn gốc virus xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn (bacteriophage, viết tắt phage) 2.1 Plasmid vector đặc đ đư i) hay multiple cloning sites (vùng 3: Amp gen lacZ’ 2.600 bp, mang gen r lacZ’ có ưu điểm k N lacZ’ Amp , gen lacZ 3.000 bp, mang gen r - 2.6) Nhập môn Công nghệ sinh học 39 400 420 440 460 AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCATAATCATGGTCAT EcoRI SacI KpnI SmaI XmaI BamHI XbaI HincII AccI SalI PstI SphI HindIII lacZ’ ThrIleMetThr(Met) 2.4 Plasmid vector pUC19 Vùng tạo dòng (từ 396-447) gắn vào gen lacZ’, không can thiệp vào chức gen 2.5 Plasmid vector pGEM -T Easy Loại vector mở sẵn vùng tạo dòng gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho việc gắn sản phẩm PCR chúng có mang hai đầu A Nhập môn Công nghệ sinh học 40 (homopolymetric tailing) (linkers adapter) vector Sợi đ (ví dụ: đoạn Klenow DNA polymerase I E coli ase 3’ (polymerase 5’ 3’ 3.1.2 Các adapter vector DNA Nhập môn Công nghệ sinh học 44 cDNA sợi đôi Sửa chữa cách xử lý với đoạn Klenow Bổ sung linker thứ Cắt nuclease S1 Sửa chữa cách xử lý với đoạn Klenow DNA polymerase bacteriophage T4 Bổ sung linker thứ hai Cắt enzyme hạn chế Gắn với plasmid vector Biến nạp vào tế bào khả biến E coli 2.9 Đoạn Klenow tạo đầu cho cDNA sợi đôi enzyme nuclease S1 cắt vịng cặp tóc Các linker thứ thứ hai gắn vào hai đầu cDNA, sau đoạn cDNA cắt enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết hai linker nhân tạo Cuối đoạn cDNA có hai đầu tương đồng gắn với vector biến nạp vào E coli Nhập môn Công nghệ sinh học 45 3.2 Gắn sản phẩm PCR Trong số trường hợp định thay phương pháp tạo dòng truyền thống phương pháp PCR, PCR cho phép sản xuất lượng lớn đoạn DNA mong muốn sau tạo dịng đoạn DNA vector plasmid phage thích hợp Phương thức tạo dịng cho sản phẩm PCR hồn tồn giống tạo dịng đoạn DNA thu từ thao tác DNA truyền thống, tạo dịng với đầu đầu kết dính (so le) DNA polymerase ổn nhiệt Taq polymerase khuếch đại sản phẩm PCR có gốc A lồi đầu 3’ Như vậy, tạo dịng sản phẩm PCR vào dT vector (được gọi tạo dòng dA:dT) Điều cho thấy việc bổ sung gốc A vào đầu cuối giúp gắn thành cơng sản phẩm PCR với vector chuẩn bị gốc T lồi (Hình 2.10) Phản ứng xúc tác DNA ligase, phản ứng gắn truyền thống A A Sản phẩm PCR khuếch đại Taq polymerase T T Vector (dT) Phản ứng gắn T4 DNA ligase Vector (dT) + đoạn chèn PCR Hình 2.10 Tạo dịng sản phẩm PCR phương thức tạo dòng dA:dT Người ta tạo dịng đầu dính với sản phẩm PCR Trong trường hợp oligonucleotide primer thiết kế với vị trí cắt hạn chế kết hợp chặt chẽ chúng Do bổ trợ primer cần thiết tuyệt đối đầu 3’, nên thông thường đầu 5’ primer vùng định Nhập môn Công nghệ sinh học 46 vị vị trí cắt hạn chế Điều cần phải thiết kế với ý thận trọng hiệu suất cắt DNA enzyme hạn chế định giảm nucleotide bổ sung thêm cho nhận biết enzyme lại thiếu đầu 5’ Trong trường hợp phản ứng cắt gắn giống phản ứng truyền thống Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn/tế bào vật chủ Sau tạo vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc biến nạp vào tế bào vật chủ Trong trường hợp tế bào vật chủ thường sử dụng vi khuẩn E coli để khuếch đại lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho phân tích sau Hai phương pháp dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli điện biến nạp (electroporation transformation) hóa biến nạp (chemical transformation) 4.1 Điện biến nạp Đây kỹ thuật hiệu để biến nạp vi khuẩn Hai thông số quan trọng phương thức loại tế bào vi khuẩn tần số xung điện cần thiết Thể tích dung dịch tế bào thường dùng 30 µL (tương ứng với nồng độ 1010 tế bào E coli/mL) có bổ sung ng plasmid cuvette có khoảng trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm Hiệu suất biến nạp phương thức lớn 109 thể biến nạp/µg plasmid siêu xoắn khoảng 108 thể biến nạp/µg plasmid dùng phản ứng gắn Tần số biến nạp khoảng 0,02 cho hai loại plasmid Tần số biến nạp thấp ngăn cản đồng biến nạp (co-transformation) vào vi khuẩn hai nhiều phân tử plasmid Phương pháp điện biến nạp có số ưu điểm sau: - Hiệu suất biến nạp cao - Có thể dùng thể tích dịch tế bào nhỏ Thể tích dịch tế bào khoảng 20 µL cho hiệu suất khoảng 109 thể biến nạp - Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp đơn giản, không sử dụng kỹ thuật phức tạp tốn thời gian Hơn nữa, tế bào dùng để biến nạp chuẩn bị trước bảo quản vơ hạn định mà khơng tính khả biến Nhập môn Công nghệ sinh học 47 - Tần số điện biến nạp với DNA siêu xoắn DNA mạch vịng giống Do đó, khơng cần thiết phải dùng vector tinh cao phản ứng gắn - Hiệu suất biến nạp phân tử cho DNA mạch vịng cao plasmid có kích thước lên đến 50 kb Nhược điểm phương pháp đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền 4.2 Hóa biến nạp Đây phương thức kinh điển để biến nạp plasmid vào tế bào E coli Các tế bào ủ dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận plasmid Plasmid đưa vào cách shock nhiệt nhanh (40-50 giây), tế bào biến nạp sau chọn lọc phương pháp chọn lọc dương tính đĩa agar chứa mơi trường LB với kháng sinh thích hợp Mỗi khuẩn lạc đĩa kháng sinh đại diện cho thể biến nạp đơn Các tế bào chứa plasmid mang DNA ngoại lai xác định mắt đĩa mơi trường có bổ sung thêm chất nhiễm sắc thể cho β-galactosidase (X-gal) chúng khuẩn lạc không màu khử hoạt tính enzyme cách chèn đoạn DNA ngoại lai Phương pháp chuẩn bị bảo quản tế bào khả biến hóa biến nạp đơn giản Hiệu suất biến nạp phương pháp khoảng 104-106 thể biến nạp/µg plasmid, tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA chèn (DNA ngoại lai) chủng vi khuẩn sử dụng Hiệu suất thích hợp cho phương thức tạo dòng truyền thống Đối với phương thức cần hiệu suất biến nạp cao (ví dụ: xây dựng thư viện cDNA, xây dựng thư viện phân tích trình tự DNA ) tốt hết dùng phương pháp điện biến nạp Tuy nhiên, khơng có sẵn thiết bị biến nạp điện thu hiệu suất biến nạp cao cách dùng chủng vi khuẩn thích hợp cho mục đích thu hiệu suất 109 thể biến nạp/µg plasmid IV Chọn dịng mang DNA tái tổ hợp Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, hỗn hợp vector lượng lớn phân tử DNA cắt enzyme hạn chế gắn lại với enzyme DNA ligase Kết quả, hỗn hợp có plasmid tái tổ hợp lẫn Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 48 plasmid khơng có gen ngoại lai chèn vào chúng trộn lẫn với tế bào vi khuẩn để thực biến nạp Sau đó, người ta chuyển tất lên mơi trường dinh dưỡng chọn lọc để chúng phát triển thành dòng tức khuẩn lạc vi khuẩn Do cách tiến hành thí nghiệm hỗn hợp khơng đồng nên dịng vi khuẩn mọc lên có ba loại sau: - Tế bào vi khuẩn không nhận plasmid - Tế bào vi khuẩn nhận plasmid gen ngoại lai chèn vào - Tế bào vi khuẩn nhận plasmid tái tổ hợp Vì vậy, việc xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp phải nhiều cơng sức Có ba phương thức để xác định dịng DNA tái tổ hợp lai khuẩn lạc vết tan, khử hoạt tính chèn đoạn, tạo dịng định hướng Lai khuẩn lạc vết tan DNA tạo dòng plasmid sản xuất khuẩn lạc nuôi cấy biến nạp dàn mỏng đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng nuôi cấy điều kiện thích hợp Các bacteriophage sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm sản xuất plaque (vết tan) có dạng hình trịn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng thảm vi khuẩn (bacterial lawn) lớp agar đỉnh [trong trường hợp người ta chuẩn bị đĩa agar có hai lớp: lớp agar đỉnh (top agar) có nồng độ agar thấp để bacteriophage dễ sinh tan tế bào vi khuẩn, lớp agar đáy (bottom agar) có nồng độ agar cao hơn] Các vector, mô tả trên, thường chứa gen thị cho phép chọn lọc tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp) Các thị thường gen kháng kháng sinh tế bào biến nạp sinh trưởng môi trường chứa kháng sinh tương ứng Ngồi ra, vector cịn chứa gen thị bổ sung để phân biệt tế bào biến nạp chứa đoạn chèn DNA ngoại lai với tế bào chứa vector tự tái tạo lại vịng Ví dụ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase Một dịng chứa chuỗi DNA quan tâm đặc biệt xác định lai khuẩn lạc vết tan Một lượng nhỏ khuẩn lạc biến nạp vết tan chuyển lên màng nitrocellulose nylon cách phủ (overlay) màng lên đĩa agar DNA biến tính cố định màng cách đun nóng (baking) chiếu tia tử ngoại (UVNhập môn Công nghệ sinh học 49 crosslinking), sau lai đệm chứa probe đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ trợ phần toàn chuỗi xác định Ví dụ: oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, có nguồn gốc từ DNA hệ gen phần, cDNA trình tự protein sản phẩm PCR Một đơi probe thiết kế dựa trình tự bắt nguồn từ gen tương đồng loài khác thường lai với cường lực thấp Các probe thừa rửa khỏi màng để ủ với phim X-quang Theo hướng phim (sau rửa) so sánh với đĩa agar gốc, đối chiếu khuẩn lạc/vết tan thực tế với khuẩn lạc/vết tan lai dương tính (positive clones) tương ứng phim X-quang (ví dụ: Ampr, lacZ cắt E coli -galactosidase gen lacZ -gal có màu trắng đoạn DNA ngoại lai chèn vào gen lacZ lacZ khơng bị hoạt tính (Hình 2.11) Hin Bam vector Bam Hin đ (protruding ends) Hin E coli Bam E coli Nhập môn Công nghệ sinh học 50 - Amp r BamHI BamHI BamHI BamHI lacZ Plasmid vector DNA ngoại lai Amp r Gen lacZ hoạt tính DNA ligase Amp r Amp r lacZ Đoạn DNA ngoại lai chèn gen lacZ làm gen lacZ hoạt tính Biến nạp vào E coli cho sinh trưởng 37oC mơi trường có Amp IPTG+X-gal Vi khuẩn E coli chứa vector tái tạo vịng phát triển thành khuẩn lạc có màu xanh Vi khuẩn E coli chứa vector tái tổ hợp phát triển thành khuẩn lạc có màu trắng Hình 2.11 Khử hoạt tính chèn đoạn Ampr: gen kháng ampicillin, lacZ: gen lacZ mã hóa enzyme β-galactosidase Về mặt lý thuyết, kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép đưa đoạn gen từ sinh vật vào sinh vật khác Vấn đề quan trọng để gen lạ có biểu Nhập môn Công nghệ sinh học 51 Amp r HindIII HindIII BamHI HindIII Tet r BamHI Plasmid vector DNA ngoại lai Amp r H Tet s H B B B H H B Điện di agarose gel Amp r H Tet s B T4 DNA ligase Amp r Amp r H Các thể biến nạp mỏng môi trường có Amp Tet s dàn B Hiệu suất biến nạp thấp H Tet s B Hiệu suất biến nạp cao Hình 2.12 Tạo dịng định hướng Tet r: gen kháng tetracycline, Tet s: gen kháng tetracycline bị khuyết đoạn hoạt tính V Biểu gen tạo dịng Muốn gen tạo dịng có biểu tổng hợp protein cần cấu tạo vector có đủ yếu tố phiên mã dịch mã Các vector gọi vector Nhập môn Công nghệ sinh học 52 biểu Nếu gen khơng nằm promoter terminator, không phiên mã Các gen tổng hợp hóa học hay từ cDNA khơng có promoter nên phải gắn chúng cạnh promoter biểu phiên mã Để dịch mã thực hiện, mRNA cần phải mang đầu 5’ trình tự RBS (ribosome binding sites-vùng liên kết ribosome) Đoạn gen ngoại lai thiếu điểm bám ribosome (RBS), muốn dịch mã phải gắn vào vị trí nằm sau promoter RBS Ở số gen sinh vật eukaryote, dịch mã địi hỏi q trình splicing tức cắt bỏ đoạn intron khỏi tiền thân mRNA thông tin (premature mRNA) nối exon lại với để tạo thành mRNA hoàn chỉnh (mature mRNA) Mục đích việc tạo dịng gen động vật có vú, người, nhằm tạo sản phẩm thể với số lượng lớn có giá trị thương mại Sự biểu gen eukaryote tế bào vi khuẩn nhiều gặp trở ngại, cần phải thiết kế vector biểu thích hợp cho phép gen ngoại lai biểu mức độ cao Vector biểu E coli E coli Để biểu tất gen ngoại lai E coli phải bắt đầu việc gắn đoạn gen ngoại lai vào vector biểu (thường plasmid) Vector phải có đủ cấu trúc cần thiết sau: - Các trình tự mã hóa gen thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo trì vector tế bào - Một promoter kiểm sốt phiên mã (ví dụ: lac, trp tac) cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gen tạo dịng - Các trình tự kiểm soát dịch mã vùng liên kết ribosome bố trí thích hợp codon khởi đầu ATG - Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào hướng xác với promoter Nhập mơn Cơng nghệ sinh học 53 Chỉ cấu trúc đầy đủ thế, vector biểu mang gen ngoại lai biến nạp vào chủng E coli thích hợp Tuy nhiên, cần lưu ý số lượng vector phải hợp lý tế bào vật chủ có ổn định lâu dài, đồng thời cần tránh thủy phân sản phẩm protein (proteolysis) enzyme tế bào Hình 2.13 mơ tả loại vector biểu prokaryote Hình 2.13 Vector biểu pRSET A prokaryote (E coli) thiết kế dựa hệ thống biểu promoter T7 Sự biểu gen đích tạo dịng vector cảm ứng cách sản xuất T7 RNA polymerase tế bào vật chủ E coli chủng BL21(DE) PT7-promoter mạnh bacteriophage T7 cho phép biểu gen mức độ cao, RBS-vùng liên kết ribosome, ATG-mã khởi đầu, N-terminal polyhistidine (6×His) tag-cho phép tinh nhanh protein nickel resin phát kháng thể Anti-HisG, N-terminal XpressTM epitope-cho phép phát protein kháng thể Anti-XpressTM, EK-enterokinase cắt điểm để loại bỏ đầu dung hợp, MCS-vùng tạo dòng, Stop-gen kết thúc phiên mã terminator, f1 ori phage dạng sợi (filamentous phage)-sản xuất DNA sợi đơn phép phân tích trình tự phát sinh đột biến dễ dàng, Ampicillin-gen chọn lọc kháng kháng sinh Nhóm pRSET bao gồm vector A, B C Mỗi loại vector có trình tự mã hóa N-terminal tag khung đọc khác liên quan với vùng MCS để đơn giản hóa tạo dịng khung gen quan tâm Nhập môn Công nghệ sinh học 54 Xác định mức độ biểu gen tạo dịng Nói chung có ba cách thường dùng để đánh giá mức độ biểu protein ngoại lai gen tạo dòng: - Điện di polyacrylamide gel để xác định protein có kích thước thích hợp sản xuất mức độ cao tế bào mang vector biểu Thông thường, protein quan tâm quan sát cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue thuốc nhuộm bạc Nếu khơng có băng protein thấy dùng thuốc nhuộm này, đánh dấu trao đổi chất với 100 µCi [35S]Met [35S]Cys mL dịch nuôi cấy phút Kỹ thuật SDS-PAGE1 phóng xạ tự ghi cho phép phát protein quan tâm - Phân tích Western blot cách dùng kháng thể đặc hiệu liên kết với protein quan tâm thẩm tích lên màng nitrocellulose sau thực kỹ thuật SDS-PAGE - Nếu mức độ biểu thấp nên đặt gen lacZ hướng với gen biểu Như vậy, phiên mã dịch mã hạn chế biểu thay đổi hệ thống biểu kiểm sốt thay đổi hoạt tính β-galactosidase ▪ Phân tích Western blot - Kỹ thuật SDS-PAGE Điện di polyacrylamide gel với có mặt SDS cho phép phân ly phân tử protein có khối lượng khác SDS có điện tích âm lớn có khả liên kết với mạch peptide Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với kích thước phân tử protein điện tích SDS bám vào làm phân tử protein chuyển động điện trường từ cực âm sang cực dương Do đó, phương pháp điện di, phân tách riêng biệt protein có khối lượng phân tử khác (Hình 2.14) Ngồi ra, điện di protein tùy theo điểm đẳng điện (isoelectric point-IEP) chúng Phương pháp gọi điện di tập trung đẳng điện (isoelecric focusing-IEF) Trong dung dịch đệm có pH biến thiên liên tục (gradient pH), protein phân ly đến vị trí tương thích với SDS-PAGE: Điện di SDS-polyacrylamide gel (sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis) Nhập môn Công nghệ sinh học 55 điểm đẳng điện chúng Hai phương pháp điện di theo khối lượng phân tử điểm đẳng điện kết hợp với tạo nên kỹ thuật điện di chiều (2-D electrophoresis) Điện di protein polyacrylamide gel cho phép phân đoạn, xác định khối lượng phân tử phân lập protein Ngoài ra, khối lượng phân tử protein cịn xác định xác phương pháp sắc ký khối phổ WM Hình 2.14 Hình ảnh điện di SDS-PAGE WM: chuẩn khối lượng phân tử protein Các đường từ 1-5: mẫu protein điện di - Phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể Phản ứng liên kết kháng ngun-kháng thể có tính đặc hiệu cao Vì vậy, áp dụng phản ứng để phát có mặt tinh protein Kháng thể (antibody) sản xuất đưa kháng nguyên vào thỏ tinh từ máu thỏ sau gây nhiễm Những kháng thể tạo cách kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do tế bào lympho khác tiết ra), chúng có khả nhận biết số kháng nguyên Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) tương tác với kháng nguyên định Kháng thể đánh dấu enzyme (hoặc chất phát huỳnh quang) để phát protein đặc hiệu (thường thẩm tích lên màng nitrocellulose sau chạy điện di SDS, cố định đó) thơng qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 2.15) Nguyên lý phản ứng liên Nhập môn Công nghệ sinh học 56 kết kháng nguyên-kháng thể trình bày hình 2.16 Sau protein màng nitrocellulose gắn với kháng thể thứ đặc hiệu tiếp đến kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (ví dụ: alkaline phosphatase, horseradish peroxidase…) phức hợp liên kết với chất để tạo màu Sự diện protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã gen ngoại lai chuyển vào tế bào vật chủ) phát nhờ xuất màu phản ứng liên kết Sự phân bố protein đặc hiệu tế bào tổ chức mô phát kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot Ngoài ra, kháng thể sử dụng để tinh protein đặc hiệu kết tủa miễn dịch sắc ký lực (affinity chromatography) Kháng thể đánh dấu dùng để định lượng kháng nguyên kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt ELISA Điện di SDS protein tổng số thẩm tích lên màng nitrocellulose Bước Ngăn chặn phản ứng không đặc hiệu Bước Bổ sung kháng thể đánh dấu enzyme Bước Rửa màng Bước Bổ sung kháng thể đặc hiệu (kháng thể đơn dòng) Bước Bổ sung chất bắt màu Bước Rửa màng Bước Dừng phản ứng bắt màu Hình 2.15 Sơ đồ kỹ thuật Western blot Nhập môn Công nghệ sinh học 57 Alkaline phosphatase Kháng thể thứ hai (thỏ) Kháng thể thứ (thỏ) Kháng ngun Thẩm tích (blot) Hình 2.16 Sơ đồ phản ứng liên kết kháng nguyên với kháng thể thứ đặc hiệu kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme Western blot Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed John Wiley & Sons Inc USA Glick BR and Pasternak JJ 2003 Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA 3rd ed ASM Press, USA Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory, USA Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, New Jersey, USA Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook Humana Press Inc New Jersey, USA Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology ed The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK th Nhập môn Công nghệ sinh học 58 ... dịng mang DNA tái tổ hợp Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, hỗn hợp vector lượng lớn phân tử DNA cắt enzyme hạn chế gắn lại với enzyme DNA ligase Kết quả, hỗn hợp có plasmid tái tổ hợp lẫn... Nhập môn Công nghệ sinh học 32 (physical mapping) Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA Đoạn DNA tổng hợp dựa khuôn mẫu mRNA gọi cDNA (complementary DNA) ba sau: - (Mg2+ - mRNA-cDNA (khi tổng hợp sợi th... mang đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) dùng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Các vector dùng để tạo dòng đoạn DNA in vitro 5’-PO4 Trong thực tế, đoạn DNA gắn với để tạo phân tử DNA tái tổ hợp thường