đại học cần thơ - khoa nông nghiệp giáo trình giảng dạy trực tuyến Đờng 3/2, Tp Cần Thơ Tel: 84 71 831005, Fax: 84 71 830814 Website: http://www.ctu.edu.vn/knn email: dminh@ctu.edu.vn, vtanh@ctu.edu.vn Vi sinh đại c ơnG Ch ơng 2: Ph ơng tiện thủ thuật vi sinh học Vi sinh hc âải cỉång Chỉång CHỈÅNG II PHỈÅNG TIÃÛN V TH THÛT DNG TRONG VI SINH HC **** A PHỈÅNG TIÃÛN : I KÊNH HIÃØN VI QUANG HC : Kênh hiãøn vi thỉåìng : Kênh ny gäưm nhiãưu tháúu kênh quang hc âãø phọng âải váût quan sạt lãn nhiãưu láưn Kênh cọ hãû thäúng tháúu kênh : váût kênh v thë kênh Váût kênh gäưm nhiãưu tháúu kênh, phọng âải váût quan sạt lãn nhiãưu láưn hån nỉỵa Do âọ cọ kh nàng phọng âải váût lãn tỉì vi tràm âãún khong 25000 láưn låïn hån Ngoi hãû thäúng tháúu kênh chênh ny, cạc kênh hiãøn vi cn cọ hãû thäúng chiãúu sạng Âån gin nháút l mäüt gỉång phàóng hồûc gỉång lm âãø phn chiãúu ạnh sạng tråìi hồûc ạnh sạng ca mäüt ngn ân, tảo thnh mäüt chm sạng chiãúu xun qua váût quan sạt Âãø cọ thãø âiãưu chènh âỉåüc cỉåìng âäü chiãúu sạng, cọ mäüt hãû thäúng quang hc gäưm nhiãưu tháúu kênh cọ mủc âêch biãún chm tia sạng thnh chm tia häüi tủ nãn tàng cỉåìng âäü chiãúu saùng lón (Hỗnh 2-1) Kờnh hióứn vi quan saùt vỏỷt nhåì cạc tia sạng chiãúu xun qua váût nhåì âọ cọ thãø quan sạt âỉåüc cå cáúu bãn ca váût nãúu chụng ta càõt mng váût úu âiãøm cuớa kờnh naỡy laỡ khọng quan saùt õổồỹc hỗnh daỷng nọứi bón ngoaỡi cuớa vỏỷt vỗ chố nhỗn õổồỹc vỏỷt trãn cng mäüt màût phàóng thàóng gọc våïi äúng ngàõm Kênh phọng âải hai äúng ngàõm hay kênh hiãøn vi soi näøi (loupe binoculaire, stereomicroscope) : Kênh naìy duìng õóứ quan saùt bón ngoaỡi cuớa vỏỷt vồùi hỗnh aớnh näøi ca váût áúy Âäü phọng âải thỉåìng nh, khäng quạ 200 láưn Kênh ny gäưm hai äúng ngàõm ghẹp song song v quan sạt våïi hai màût cng mọỹt luùc Nhồỡ õoù chuùng ta thỏỳy õổồỹc hỗnh nọứi ca váût Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Hỗnh 2-1: Hỗnh veợ mỷt cừt doỹc cuớa mọỹt mọỹt kênh hiãøn vi quang hc thỉåìng dng Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Khạc våïi kênh hiãøn vi thỉåìng, kênh ny dng tia sạng phn chiãúu ca váût õóứ quan saùt (Hỗnh 2-2) Hỗnh 2-2: Kờnh hióứn vi soi näøi (kênh phọng âải hai äúng ngáúm) Kênh hiãøn vi âaïy âen (Darkfield microscope) : Kênh hiãøn vi ny gäưm mäüt kênh hiãøn vi thỉåìng cọ gàõn bäü häüi tủ tia sạng (condenser) âàûc biãût Bäü häüi tủ ny hồûc âỉåüc cáúu tảo âàûc biãût hồûc âỉåüc che åí pháưn giỉỵa, âọ ngàn cạc tia sạng chiãúu thàóng vo váût m chè cho cạc tia sạng chiãúu xión vaỡo vỏỷt maỡ thọi (Hỗnh 2-3) Hỗnh 2-3: Sồ âäư bäü tủ quang âạy âen mäüt kênh hiãøn vi âạy âen Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Khi quan sạt, chụng ta s tháúy thë trỉåìng coù maỡu õen, vỗ chố quan saùt õổồỹc vồùi tia sạng xiãn Nãúu cọ váût, tia sạng xiãn chiãúu vo váût s cho tia bỉïc xả, chụng ta quan sạt âỉåüc nh bãn ngoi ca váût nhåì cạc tia bỉïc xả ny Cäng dủng ca kênh hiãøn vi ny l cọ thãø quan sạt váût khäng cáưn nhüm mu âọ quan sạt âỉåüc váût âang cn säúng Kênh hiãøn vi tỉång phn (Contrast phase microscope) : Cng mủc âêch våïi kênh hiãøn vi âaïy âen, kênh hiãøn vi tỉång phn dng âãø quan sạt cạc váût quạ nh tỗnh traỷng õang sọỳng cuớa vỏỷt ỏỳy (khọng nhuọỹm maỡu) Kờnh hióứn vi tổồng phaớn cho hỗnh aớnh cuớa váût r hån kênh hiãøn vi âạy âen, tháúy âỉåüc cạc chi tiãút bãn Kênh hiãøn vi ny cng chè l kênh hiãøn vi thỉåìng, nhỉng cọ gàõn thãm hai bäü pháûn âàûc biãût: vng måí tia sạng (annular diaphram) åí bäü pháûn âiãưu chènh lỉu lỉåüng ạnh sạng v âéa tảo tỉång phn hay tảo lãûch pha (phase shipting element) õỷt vỏỷt kờnh (Hỗnh 2-3) Nhồỡ bäü pháûn ny, ạnh sạng âi ngang qua váût quan sạt âỉåüc phán têch thnh hai chm tia, mäüt chm tia sạng cỉïng âi ngang qua váût v chm tia saùng bở khuùc xaỷ õi qua chung quanh vỏỷt Vỗ váût cháút vi sinh váût cọ chiãút sút gáưn bàịng âọ ráút khọ nháûn tháúy nãúu khäng nhüm mu (nhỉ ta quan sạt mäüt miãúng thy tinh âàût cháûu nỉåïc) Nhåì dng chm tia cọ âäü di sọng khạc chiãúu xun qua nãn ta cọ thãø tháúy âỉåüc cạc váût khạc cọ chiãút suáút gáön giäúng II KÊNH HIÃØN VI ÂIÃÛN TỈÍ : Ngun tàõc : Kênh hiãøn vi quang hc ngy cng âỉåüc ci tiãún Tỉì tháûp niãn 1690 âãún nay, kênh hiãøn vi tỉì l mäüt tháúu kênh âån gin våïi âäü phọng âải läúi vi mỉåi láưn, ngy chụng ta cọ kênh hiãøn vi quang hc våïi âäü phọng âải 2.500 láưn Tuy váûy kênh hiãøn vi quang hc khäng thãø vỉåüt lãn giåïi hản trãn âỉåüc, âọ khäng thãø giụp chụng ta quan sạt âỉåüc virụt L ca giåïi hản ny l vỗ aùnh saùng thổồỡng maỡ chuùng ta duỡng õóứ quan sạt kênh hiãøn vi quang hc, cọ âäü di sọng tỉång âäúi låïn, tỉì 400 - 700mµ Våïi âäü di sọng låïn váûy chụng ta khäng thãø quan saùt caùc vỏỷt nhoớ, nhổ thờ duỷ Hỗnh 2-5 Vi sinh hoỹc õaỷi cổồng Chổồng Hỗnh 2-4: Så âäư âỉåìng âi ca cạc tia sạng kênh hiãøn vi tỉång phn âãø tảo sỉû lãûch pha giụp cho tháúy r cạc chi tiãút bãn máùu váût hån 10 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Hỗnh 2-5: Thờ duỷ chổùng minh vỗ kờnh hióứn vi quang hc khäng thãø quan sạt váût cọ kêch thỉåïc quạ nh (virụt) A: våïi cạc hảt bủi mën (bỉåïc sọng ca tia âiãûn tỉí) bn tay s hiãûn r våïi âáưy â chi tiãút ca cạc tay B: Våïi cạc hảt to hån (bỉåïc sọng ca ạnh sạng tháúy âỉåüc), cạc tay khäng thãø hiãûn âỉåüc Do âọ hỉåïng phạt minh nhỉỵng dủng củ giụp chụng ta quan sạt âỉåüc nhỉỵng váût cỉûc nh, nàm 1931 Knoll v Ruska åí Âỉïc, â thỉûc hiãûn láưn âáưu tiãn kênh hiãøn vi âiãûn tỉí Kênh hiãøn vi ny ạp dủng ngun tàõc l nãúu mäüt ngưn bàõn âiãûn tỉí âàût åí mäüt hiãûu thãú cao (khong 30 - 150 KV) s bàõn cạc âiãûn tỉí cọ âäü di sọng ráút ngàõn (0,5mµ) Cạc âäü di sọng ny cọ thãø bë tỉì trỉåìng lm lãûch âỉåìng âi (giäúng tháúu kênh lm lãûch âỉåìng âi cuớa tia saùng) (Hỗnh 2-6) Aẽp duỷng nguyón từc trón kênh hiãøn vi âiãûn tỉí âỉåüc cáúu tảo sau Cáúu tảo kênh hiãøn vi âiãûn tỉí xun thúng (transmittion electron microscope): (Hỗnh 2-7) Tỏỳt caớ caùc bọỹ pháûn âỉåüc âàût mäüt trủ kên v tảo chán khäng bàịng mäüt båm hụt Trong chán khäng hoảt âäüng ca âiãûn tỉí khäng bë cn tråí Cạc âiãûn tỉí bàõn xun qua máùu váût âỉåüc cạc váût kênh v thë kênh bàịng âiãûn tỉí lm tn räüng (phán k), sau cng hiãûn lãn mng hunh quang cọ bäü mạy chủp nh âãø chủp nh cáưn Tia âiãûn tỉí xun qua máùu váût s bë ngàn cn hồûc khäng 11 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång tuyỡ theo tờnh chỏỳt cuớa mỏựu vỏỷt seợ hióỷn hỗnh trãn mng hunh quang thnh nh âen tràõng Cạc nåi ca máùu váût ngàn cn tia âiãûn tỉí s cọ maỡu õen (A) (B) Hỗnh 2-6: Nguyón từc cỏỳu taỷo ca kênh hiãøn vi âiãûn tỉí (A) so sạnh våïiì kờnh hióứn vi quang hoỹc (B) Hỗnh 2-7: Anh chuỷp bãn ngoi ca mäüt kênh hiãøn vi âiãûn tỉí xun thàóng 12 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Âãø cọ thãø quan sạt våïi kênh hiãøn vi âiãûn tỉí, máùu váût âỉåüc càõt lạt (vi pháùu thût) thnh nhỉỵng lạt tháût mng, bãư dy dỉåïi 1µ, cọ thãø âảt õóỳn khoaớng 0,02à óứ cừt nhổợng laùt moớng nhổ vỏỷy mỏựu vỏỷt õổồỹc õởnh hỗnh, sau õoù ngỏm vaỡ õuùc khn räưi càõt lạt våïi mạy siãu vi phán Dao âãø càõt lạt lm bàịng thy tinh, âãø cọ thãø tảo nhỉỵng cảnh tháût bẹn måïi cọ thãø tảo âỉåüc nhỉỵng pháùu thỉïc cåỵ âọ Máùu váût cáưn âỉåüc nhüm våïi cạc cháút ngàn cn âiãûn tỉí âãø tảo sỉû tổồng phaớn cuớa hỗnh aớnh trón maỡng huyỡnh quang Coù ráút nhiãưu họa cháút dng âãø nhüm máùu váût, thỉåìng gàûp l basic lead citrate, hồûc uranyl acetate 1% hồûc phosphotungstic acid Vé chỉïa máùu váût l miãúng lỉåïi âäưng, bãn trãn ph bàịng mäüt låïp phim tháût mng bàịng váût cháút khäng háúp thu hồûc khäng lm tn mạt tia âiãûn tỉí, phi â bãưn, khäng bë tia õióỷn tổớ bừn thuớng Ngoaỡi õóứ quan saùt hỗnh näøi ca váût, cọ thãø ph lãn trãn mäüt låïp mng kim loải (shadowing) Th thût ny âỉåüc thỉûc hiãûn mäüt läưng kên chán khäng, såüi kim loải vng hồûc palladium , âỉåüc âun nọng bàịng âiãûn v bäúc håi, håi kim loải råi xúng ph trãn váût quan sạt Nãúu váût quan sạt âỉåüc âàût nghiãng so våïi hỉåïng ph ca kim loải, s cọ bọng ng ty theo chiãưu cao ca váût, nhåì âọ quan sạt chuùng ta thỏỳy õổồỹc hỗnh cuớa vỏỷt nọứi lón Anh kênh hiãøn vi âiãûn tỉí cung cáúp cọ thãø quan sạt trỉûc tiãúp âỉåüc, cng cọ thãø chủp nh nhåì mäüt bäü pháûn chủp nh âàût bãn dỉåïi mng hunh quang Cáúu tảo kênh hiãøn vi âiãûn tỉí soi nọứi (Scanning electron microscope) : Hỗnh 2-8: Kỗnh hióứn vi âiãûn tỉí näøi (Scanning electron microscope) 13 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Ngoi ra, våïi cng ngun từc trón, tia õióỷn tổớ thay vỗ xuyón qua mỏựu váût, kênh hiãøn vi âiãûn tỉí soi näøi (scanning electron microscope) (cng cn gi l kênh hiãøn vi âiãûn tỉí quẹt) tia âiãûn tỉí chiãúu lãn bãư màût ca mỏựu vỏỷt vaỡ phaớn chióỳu laỷi vaỡ hióỷn hỗnh aớnh bón ngoaỡi cuớa mỏựu vỏỷt lón maỡng huyỡnh quang (Hỗnh 2-8) Âãø cọ thãø quan sạt våïi kênh hiãøn vi âiãûn tỉí näøi, máùu váût cáưn âỉåüc ph bàịng mäüt låïp kim loải, thỉåìng dng vng, âãø cọ thãø phn chiãúu cạc tia âiãûn tỉí lải II MẠY LY TÁM : Mạy ly tám l dủng củ dng âãø làõng cạc váût thãø to mäüt dung dëch hồûc âãø phán tạch cạc váût thãø cọ khäúi lỉåüng khạc mäüt dung dëch Mạy ly tám cọ thãø l : Bäü ly tám quay tay : Quay bàòng tay, cáúu tảo âån gin Váûn täúc quay thỉåìng kẹm, khong 700 - 1500 vng/phụt Thỉåìng dng âãø làõng tuún trng, bo tỉí náúm, vi khøn Mạy ly tám thäng thỉåìng : Quay bàịng âäüng cå âiãûn, váûn täúc thỉûc dủng täúi âa khong 16000 vng/phụt, thäng thỉåìng l 3.000 vng/phụt Ráút thäng dủng cạc phng nghiãn cỉïu vi sinh hc Mạy siãu ly tám : (Ultracentrifuge) Cọ váûn täúc quay ráút nhanh, cọ thãø âảt âãún 100.000 vng/phụt Tuy nhiãn åí váûn täúc trãn 25.000 vng/phụt, mạy cáưn cọ bäü pháûn tảo chán khäng cho nọửi quay khọng bở ma saùt vỗ khọng khờ, õóứ trạnh nguy hiãøm Ngoi ra, mạy cn âỉåüc trang bë thãm bäü pháûn lm lảnh åí nhiãût âäü cäú âënh Mạy ráút cáưn thiãút cho cạc nghiãn cỉïu vãư virụt (virus) Khi sỉí dủng mạy ly tám, nháút l mạy siãu ly tám cáưn quan tám âãún viãûc lm cán bàịng trng lỉåüng cạc äúng ly tám Mäüt sỉû chãnh lãûch nh vãư trng lỉåüng giỉỵa hai äúng ly tám âäúi xỉïng nhau, cọ thãø gáy nguy hiãøm chãút ngỉåìi nãúu quay våïi váûn täúc quay låïn 14 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång B CẠC TH THÛT CÀN BN ẠP DỦNG TRONG VI SINH HC : I NHÜM MU : Khi quan sạt máùu vi sinh váût qua kênh hiãøn vi quang hoüc, pháön låïn cå cáúu bãn ca vi sinh váût cọ chiãút sút gáưn bàịng cho nãn ráút khọ phán biãût âỉåüc Âãø cọ thãø quan sạt dãù dng hån chụng ta phi nhüm mu váût Ty theo loải mu ạp dủng ton thãø vi sinh váût hồûc mäüt vi cå quan bãn vi sinh vỏỷt n maỡu khióỳn cho hỗnh aớnh caùc cå quan ny cọ thãø quan sạt âỉåüc r rng hån Pháưn låïn mu nhüm vi sinh hc l cạc múi v âỉåüc phán lm hai nhọm : nhọm mu acid gäưm cạc múi m ion mang mu l anion (mang âiãûn têch -) v nhọm cạc bazå cọ ion mang maìu laì cation (mang âiãûn têch +) Thê dủ : sodium+ eosinate- l mu eosin cọ acid v methylene blue (methylene+ chloride- ) cọ bazå Mu acid vỗ ion mang maỡu hồỹp vồùi mọỹt bazồ (NaOH) õóứ cho mọỹt muọỳi maỡu Coỡn maỡu bazồ vỗ ion mang mu cọ tạc âäüng mäüt bazå, phäúi håüp våïi mäüt acid (HCl) cho mäüt muäúi maìu Mäüt cạch täøng quạt mu acid phäúi håüp chàût (àn mu) våïi thnh pháưn ca tãú bo cháút ca tãú baìo vaì maìu bazå phäúi håüp (àn maìu) våïi thaình pháưn ca nhán tãú bo (cọ acid) Mäüt säú cạc mu nhüm chè bao ph ngoi màût máùu váût õổồỹc nhuọỹm quaù trỗnh hỏỳp thu hoỷc laỡ noù tan hay kãút ta chung quanh váût âỉåüc nhüm Nhüm âån : Pháưn låïn dng mu âãø nhüm âån, thỉåìng dng l methylene blue, crystal violet, basic fuchsin Chụng thüc nhọm mu aniline (hàõc in) Cọ ráút nhiãưu cäng thỉïc v th thût âãø nhüm âån máùu váût Âäúi våïi vi khøn, thỉåìng dng dung dëch Loeffler's methylene blue : - Methylene blue 0,3g Dëch A Dëch B : KOH (0,01%) 100ml - Ethyl alcohol 95% 30,0ml 15 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Ha hai dung dëch A v B lải, cọ Loffler's methylene blue Âãø dnh láu âỉåüc Dung dëch Loffler giụp quan sạt âỉåüc nhióửu chi tióỳt vóử hỗnh daỷng vaỡ cỏỳu truùc cuớa tóỳ baỡo Hỗnh 2-9: Kóỳt quaớ cuớa vióỷc nhuọỹm maỡu quan sạt vi khøn dỉåïi kênh hiãøn vi quang hoüc: (A): nhuäüm våïi crystal violet; (B) nhuäüm våïi iodine; (C) nhuäüm våïi cäön; (D) nhuäüm våïi safranin; (E) nhuọỹm vồùi nigrosin (F) hỗnh veợ chố caùc vi khuỏứn gram + v gram - cho tháúy cọ sỉû àn maỡu khaùc vaỡ thóứ hióỷn hỗnh daỷng khaùc giỉỵa vi khøn gram + v gram - 16 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Âäúi våïi náúm, thỉåìng duìng dung dëch Lactophenol cotton blue : - Phenol (tinh thãø tinh roìng) 20g - Lactic acid (sp.gr 1.21) 20g - Glycerol 40g - Næåïc cáút 20ml - Cotton blue (methyl blue) 0,05g Cotton blue nhuäüm xanh nguyãn sinh cháút ca náúm Lactophenol cọ chiãút xút l 1,45 nãn giụp quan sạt náúm r rng hån Lactophenol cọ lm cho tãú bo håi co lải nãn máùu quan sạt âỉåüc hồi nhoớ hồn bỗnh thổồỡng Nhuọỹm gram : Duỡng âãø nhüm vi khøn Âáy l phỉång phạp nhüm mu coù phỏn bióỷt, vỗ khọng phaới nhuọỹm tỏỳt caớ vi khuáøn maì chè nhuäüm mäüt säú chi vi khuáøn coìn caùc chi vi khuỏứn khaùc thỗ khọng n maỡu Qua phỉång phạp nhüm Gram, chụng ta chia vi khøn lm hai nhọm, vi khøn gram dỉång v vi khøn gram ám Phỉång phạp ny ráút quan trng viãûc phán loải vi khøn Âãø nhüm gram, trỉåïc hãút ta nhuäüm máùu váût våïi maìu crystal violet (läúi 30 giáy) Sau rỉía sảch mu, nhüm thãm våïi dung dëch lugol iodine (läúi 30 giáy) Táút c vi khøn âãưu àn mu têm sáùm Âem nhụng máùu cäưn 95o (20 giáy âãún phụt), cäưn s táøy mu têm trãn mäüt säú vi khuáøn Ta goüi caïc vi khuáøn cn giỉỵ mu têm l vi khøn gram dỉång (+), coìn vi khuáøn bë táøy maìu laì gram ám (-) Âãø cọ thãø phạt hiãûn vi khøn gram -, ta nhüm máùu våïi mu â eosin, hồûc â safranin hồûc lủc brillant green hồûc náu Bismarck brown Vi khøn gram + cọ mu têm cn vi khøn gram- cọ mu â hồûc lủc hồûc náu ty họa cháút L ca vi khøn gram - bë khỉí mu têm båíi cäưn 95o l cáúu tảo l v họa ca vạch tãú bo vi khøn nhọm ny khạc Vi khøn gram + cọ vạch dy cn vi khøn gram - cọ vạch gäưm nhiãưu låïp phỉïc tảp Cáúu tảo l v họa ca vạch vi khuỏứn gram + õaợ taỷo tỗnh traỷng giổợ maìu têm crystal violet vaì iod ráút chàût nãn khäng bë cäưn khỉí 17 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Nhüm roi : Âỉåìng kênh roi ca vi khøn ráút nh nãn khọ quan sạt âỉåüc qua kênh hiãøn vi quang hc Âãø quan sạt âỉåüc cáưn nhüm mu âàûc biãût Ngun tàõc l, trỉåïc hãút ph lãn roi mäüt låïp họa cháút âãø lm cho roi to ra, v họa cháút ny cng giỉỵ mu nhüm Họa cháút âãø tä ph roi cọ thãø l tannic acid, mu nhüm cọ thãø dng pararosaniline II KHỈÍ TRNG : Trong nghiãn cỉïu vi sinh váût, chụng ta thỉåìng ạp dủng th thût ni cáúy vi sinh váût thưn chng Trong mäüt äúng nghiãûm hồûc l kên hồûc âéa petri nãúu chè chỉïa thưn mäüt chng loải vi sinh váût m thäi, ta gi l mäüt m cáúy (inoculum) Trong lục ni cáúy, âãø cọ thãø giỉỵ âỉåüc mäüt m cáúy thưn chng, cáưn phi thỉûc hiãûn viãûc ni cáúy âiãưu kiãûn vä trng Vi sinh váût cọ màût åí khàõp nåi, khäng khê, håi thåí v mäi trỉåìng âãø ni cáúy nãn lm cho m cáúy bë nhiãùm vi sinh váût lả Do âọ, chụng ta cáưn khỉí trng mäi trỉåìng v dủng củ ni cáúy Ngun tàõc : Cọ ngun tàõc khỉí trng : a/ Thanh trng (Sterilization) : Tiãu diãût táút c vi sinh váût trãn v dủng củ cáưn trng Thỉåìng dng nhiãût, håi formol, ethylen oxide cạc dung dëch họa cháút HgCl2, Sodium hypochloride hồûc dng cạc tia cỉûc têm, tia gamma Hồûc tạch vi sinh váût dung dëch cáưn trng våïi phỉång phạp ly tám, phỉång phạp lc, b/ Táøy âäüc (disinfection) : Chè diãût hồûc tạch cạc vi sinh váût cọ thãø gáy nhiãùm trng, khäng cáưn phi tạch hồûc diãût táút c cạc vi sinh váût Thê dủ : táøy âäüc sỉỵa tỉåi (milk pasteurization) óứ gỗn giổợ sổợa tổồi nhióửu ngaỡy ồớ nhiãût âäü lảnh m sỉỵa khäng hỉ, ngỉåìi ta âỉa sỉỵa lãn âãún 71 - 80oC 15 - 30 giáy âäưng häư ÅÍ nhiãût âäü v thåìi gian ny táút c cạc vi sinh váût chëu lảnh âãưu chãút hãút, chè cn lải vi sinh váût chëu nhiãût âäü trung bỗnh vaỡ vi sinh vỏỷt chởu noùng Hai nhoùm ny khäng phạt triãøn âỉåüc åí nhiãût âäü lảnh ca t täưn trỉỵ (4 -10oC) Ngoi phỉång phạp táøy âäüc ny khäng lm máút dỉåỵng cháút cọ sỉỵa tỉåi 18 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång c/ Kiãưm hm (microbistasis) : (Stasis = giỉỵ lải, khäng cho phạt triãøn thãm) Ngun tàõc náưy khäng cọ mủc âêch giãút vi sinh váût m chè giỉỵ vi sinh vỏỷt coù sụn tỗnh traỷng bỏỳt õọỹng (khọng gia tàng thãm máût säú) mäüt thåìi gian láu daìi v sau âọ vi sinh váût áúy tỉû chãút dáưn m khäng sinh sn thãm Thỉåìng dng cạc tạc nhán sỉû khä rạo, nhiãût âäü lảnh, cháút khạng sinh, cạc antiseptic, cạc họa cháút thüc nhọm sulfonamic, mäüt säú mu nhüm dung dëch ỉu trỉång Phỉång phạp : Cạc phỉång phạp khỉí trng thỉåìng dng l : a/ Phỉång phạp dng nhiãût : Dng nhiãût khä : ạp dủng âãø trng cạc dủng củ khäng chạy, thê dủ kim loải, thy tinh, Pháưn låïn vi sinh váût bë giãút chãút åí 100oC Tuy nhiãn cọ mäüt säú chi vi khøn cọ kh nàng tảo näüi bo tỉí (näüi bo tỉí cn âỉåüc gi l nha bo = endospore) v chëu âỉûng âỉåüc nhiãût âäü ny mäüt thåìi gian Do âọ trng dủng củ bàịng phỉång phạp nhiãût khä chụng ta phi dng nhiãût âäü 150oC180oC täúi thiãøu giåì hồûc 120oC täúi thiãøu giåì, måïi âm bo giãút âỉåüc vi sinh váût bạm trãn dủng củ Dng nhiãût ỉåït : âãø trng hồûc táøy âäüc mäi trỉåìng ni cáúy, thỉûc pháøm hồûc dủng củ, họa cháút + Thỉåìng dng håi nỉåïc säi (100oC) âãø táøy âäüc våïi mủc âêch loải virụt v mäüt säú vi khøn thỉåìng gàûp Thỉåìng ạp dủng nghiãn cỉïu virụt Thåìi gian táøy âäüc täúi thiãøu giåì + Âãø truìng vi khøn v náúm, phi dng håi nỉåïc säi näưi kên âãø tảo ạp sút tỉì 1kg/cm2 tråí lãn, âãø âỉa nhiãût âäü lãn âãún 121oC Thåìi gian trng täúi thiãøu 20 (näưi autoclave) + Âäúi våïi cạc họa cháút bë phán hy åí nhiãût âäü trãn 100oC ta trng åí nhiãût âäü 100oC giåì, sau âọ âãø åí nhiãût âäü thỉåìng (20 - 30oC) ngy Häm sau lải trng åí nhiãût âäü 100oC giåì räưi âãø åí nhiãût âäü thỉåìng Láûp lải láưn (phỉång phạp ny cn gi l Tyndallization) L : 19 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång ÅÍ 100oC giãút táút c cạc vi sinh váût åí dảng âang hoảt âäüng trỉì cạc daỷng lổu tọửn nhổ nọỹi baỡo tổớ, bỗ baỡo tổớ, Cạc dảng lỉu täưn s chuøn sang dảng hoảt õọỹng trồớ laỷi nhióỷt õọỹ bỗnh thổồỡng Sau âọ chụng ta giãút chụng åí nhiãût âäü 100oC giåì våïi láưn trng thỉï hai Láưn trng thỉï ba våïi mủc âêch âm bo diãût táút c vi sinh váût cn sọt lải sau hai âåüt trng trỉåïc + Lỉu : Khi sỉí dủng näưi trng bàịng håi nỉåïc cáưn kiãøm tra lải xem âọ l näưi autoclave hay näưi trng Tyndall (Tyndallization) b/ Phỉång phạp dng họa cháút : Cọ ráút nhiãưu họa cháút cọ kh nàng diãût táút c vi sinh váût nãn âỉåüc dng âãø trng : - Cạc halogens : + CaCl2 : dng åí näưng âäü tỉì 0,5 -5% Cháút tạc âäüng trng l chlor Thỉåìng dng khỉí âäüc nỉåïc dng thnh phäú + Iodine : l mäüt cháút trng täút nhỉng ờt duỡng hồn vỗ õừt vaỡ vỗ noù coù maỡu Ngy xỉa, ngnh y tãú thỉåìng dng cäưn iod 2% trng vãút thỉång - Cạc kim loải nàûng : + Chlorua thy ngán (Bichloride of mercury) HgCl2 : dng åí dảng dung dëch /oo hồûc 1/5000 Dng khỉí âäüc ngoaìi màût máùu váût nuäi cáúy o + Sulfat bảc : thúc nh màõt dnh cho tr så sinh (1%) + Sulfat âäưng : dng âãø diãût rong xanh (lm xanh nỉåïc) häư nỉåïc v l thúc diãût náúm näng nghiãûp Lỉu l cạc kim loải nàûng l nhỉỵng cháút lỉu tänư ráút bãưn ngoi thiãn nhiãn, dáy chuưn thỉûc pháøm Nọ l mäüt cạc cháút gáy ä nhiãùm cho mäi trỉåìng säúng Cáưn hãút sỉïc tháûn trng sỉí dủng Khäng âỉåüc âäø cạc cháút náưy qua âỉåìng cäúng nỉåïc m khäng cọ hãû thäúng xỉí l chäúng ä nhiãùm 20 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång - Cạc cháút khạc : + Phenol : l cháút chäúng vi sinh váût ráút täút, âỉåüc dng y khoa, táøy rỉía phng mäø Vo thåìi sau Pasteur, cạc bạc sé phi rỉía tay bàịng acid phãnic long trỉåïc vo phng mäø + Cäưn : cäưn ethyl v cäưn isopropyl âỉåüc dng âãø trng: rỉía tay, trng vãút thỉång chêch Cäưn ethyl dng trng täút nháút åí 70% Dng näưng âäü cao hån 95% hồûc 100%, hiãûu qu kẹm hån + X bäng : x bäng cng cọ tạc dủng trng tay Dng rỉía tay, duûng cuû + Cháút táøy: bäüt giàût täøng håüp cọ trng täút, nhỉït l våïi virụt + Formol : cọ trng mảnh, giãút âỉåüc bo tỉí vi khøn Formol bäúc håi nhanh, håi formol cọ thãø trng nh cỉía, phng äúc hồûc dủng củ Âiãưu kiãûn täút nháút âãø håi formol phạt huy tạc dủng trng l áøm âäü 70% v nhiãût âäü khong 22oC Formol nỉåïc cng cọ kh nàng trng mảnh c/ Phỉång phạp dng tia sạng : - Tia cỉûc têm (ultraviolet light) : tia cỉûc têm cọ trng mảnh, diãût âỉåüc c bo tỉí vi khøn Tia cỉûc têm cọ âäü di sọng ri tỉì 13,6mµ - 400mµ Chè cọ cạc tia 230 - 280mµ, âàûc biãût l 253,7mµ, l cọ tạc dủng trng mảnh nháút µ Dng trng phng äúc, dủng củ Cáưn bo vãû màõt -3 -6 Ghi chụ: 1mµ (mili-micromẹt)= 1nm (nanomẹt)= 10 µm (micromẹt)= 10 mm -6 -9 1mµ = x 10 mm = x 10 m - Tia ám cæûc (cathode ray) : tæïc tia âiãûn tỉí cọ kh nàng trng v xun qua kim loải mng Dng trng dủng củ y khoa â âọng gọi, thët, rau ci v thỉûc pháøm khạc â âọng gọi d/ Phỉång phạp lc : Rüt bàịng sổù xọỳp cuớa bỗnh loỹc nổồùc, caùc loaỷi giỏỳy loỹc âàûc biãût nhåì cọ cạc läù hng nh nãn cọ thãø âãø cho cạc cháút lng âi qua nhỉng ngàn cn vi khøn, náúm lải, nãn cọ thãø dng âãø trng hồûc táøy âäüc 21 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång Mng lc cỉûc (ultra-filter) âỉåüc lm bàịng collodion cellulose acetate hồûc nhỉỵng cháút tỉång tỉû cọ läù ráút nh nãn âỉåüc dng cho ráút nhiãưu mủc âêch Kêch thỉåïc läù lc cọ thãø tỉì 0,005 - 1µm Nhåì âọ cọ thãø dng mng lc thêch nghi âãø loải táút c vi sinh váût, kãø c virụt nh nháút dung dëch mún trng III LY TÁM : Ly tám âỉåüc sỉí dủng nhiãưu nghiãn cỉïu vãư vi sinh hc Ngun tàõc ca phỉång phạp ly tám l mäüt váût bë tạc dủng båíi ly tám s bë läi kẹo båíi mäüt lỉûc v di chuøn theo chiãưu hỉåïng ly tám Khäúi lỉåüng ca váût bë tạc dủng cng låïn, lỉûc ly tám cng låïn Trong mäüt dung dëch cọ chỉïa vi sinh váût, nãúu chëu tạc dủng ca ly tám, cạc vi sinh váût cọ kêch thỉåïc to s chëu tạc dủng ca lỉûc ly tám låïn cọ khuynh hỉåïng di chuøn vãư phêa âạy äúng nãúu lỉûc ly tám thàõng âỉåüc âäü nhåït ca cháút lng ÅÍ mäüt täúc âäü quay nháút âënh, cạc váût to s bë làõng vo âạy äúng Cn cạc váût nh s cn lå lỉíng dung dëch Ạp dủng ngun tàõc ny viãûc : a/ Táøy âäüc dëch chæïa vi khuáøn, làõng vi khuáøn xúng âạy äúng, dëch bãn trãn khäng chỉïa vi khøn ÅÍ täúc âäü 6000 vng/phụt 20 ta cọ thãø làõng táút c vi khøn nỉåïc xúng âạy ọỳng Caùc vi sinh vỏỷt nhoớ hồn, nhổ viruùt thỗ hy cn lå lỉíng nỉåïc Nhỉ váûy, chụng ta cọ thãø tạch vi khøn dëch chỉïa virụt våïi phỉång phạp ly tám b/ Thu tháûp hay cä âng vi sinh váût mäüt huưn ph våïi máût säú cao hån: ly tám våïi täúc âäü quay vaì thåìi gian thêch håüp âãø vi sinh váût áúy làõng xúng âạy äúng Sau chàõt b låïp dëch bãn trãn, ta cho mäüt êt cháút lng måïi, cọ thãø l dung dëch âãûm (buffer), räưi khúy vi sinh váût áúy lãn cho lải dung dëch âãûm ny c/ Tinh rng vi sinh váût: mäüt dëch chỉïa nhiãưu loải vi sinh váût v cạc thnh pháưn nh ca vi sinh váût, chụng ta cọ thãø ạp dủng phỉång phạp ly tám âãø phán tạch cạc vi sinh váût v cạc váût thãø cọ kêch cåí khạc chỉïa dëch ny tỉìng låïp riãng biãût Trỉåïc hãút phi ly tám åí váûn täúc quay v thåìi gian thêch håüp âãø coï thãø làõng vi sinh váût mún tinh rng xúng âạy äúng âãø cä âng lải, âäưng thåìi loải båït cạc thnh pháưn nh hån Trong dëch måïi chụng ta cọ vi sinh váût mún tinh rng láùn våïi 22 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång vi sinh váût khạc cng kêch thỉåïc hồûc to hån, âäưng thåìi cọ láùn cạc tảp cháút cọ cng kêch thỉåïc hồûc to hån Sau âọ âem nh dëch ny lãn trãn màût dung dëch âỉåìng cọ âäü nhåìn tàng dáưn tỉì trãn xúng âạy ca cạc äúng ly tám Sau âọ âem ly tám åí täúc âäü v thồỡi gian cỏửn thióỳt (sugar gradient centrifugation) Vỗ õọỹ nhồỡn ca dung dëch âỉåìng låïn v âỉåüc sàõp xãúp âãø cọ näưng âäü tàng dáưn tỉì trãn xúng dỉåïi âạy äúng, nãn sau cng cạc váût cháút s âỉåüc sàõp xãúp lải thnh tỉìng låïp äúng ly tám, mäùi låïp chỉïa mäüt säú váût cháút cọ kêch thỉåïc bàịng Vi sinh váût mún tinh rng cng âỉåüc táûp trung mäüt låïp riãng biãût, chụng ta cọ thãø thu tháûp båíi mäüt mạy nh git tỉì âạy äúng ly tám Taìi liãûu âoüc thãm: Madigan, M T , J M Martinko & J Parker, 1997 Brock Biology of Microorganisms Prentice Hall International, Inc Trang 397-429 Frobisher, M.,1968 Fundamental of Microbiology W B Saunder Co Trang 14-31 23 ... låïn 14 Vi sinh hc âải cỉång Chỉång B CẠC TH THÛT CÀN BN ẠP DỦNG TRONG VI SINH HC : I NHÜM MU : Khi quan sạt máùu vi sinh váût qua kênh hiãøn vi quang hoüc, pháön låïn cå cáúu bãn ca vi sinh váût... âãûm ny c/ Tinh rng vi sinh váût: mäüt dëch chỉïa nhiãưu loải vi sinh váût v cạc thnh pháưn nh ca vi sinh váût, chụng ta cọ thãø ạp dủng phỉång phạp ly tám âãø phán tạch cạc vi sinh váût v cạc váût... âạy ọỳng Caùc vi sinh vỏỷt nhoớ hồn, nhổ viruùt thỗ hy cn lå lỉíng nỉåïc Nhỉ váûy, chụng ta cọ thãø tạch vi khøn dëch chỉïa virụt våïi phỉång phạp ly tám b/ Thu tháûp hay cä âng vi sinh váût mäüt