Đang tải... (xem toàn văn)
luận văn
Bộ giáo dục và đào tạo trờng đại học nông nghiệp i --------------------------- phạm thị thuý nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SSR (Simple sequence repeats) trong chọn giống lúa Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng Mã số: 60.62.05 Ngời hớng dẫn khoa học: TS. phan hữu tôn TS. Phạm Ngọc Lơng Hà nội 2006 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 2 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thục và cha từng đợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đ đợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đ đợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Phạm Thị Thuý Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 3 lời cám ơn Trớc hết tôi xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, Khoa Sau đại học, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ sinh học & Phơng pháp thí nghiệm, Bộ môn Di truyền và Chọn giống Cây trồng - Trờng Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội cùng tập thể cán bộ Bộ môn Di truyền và Công nghệ Lúa lai, Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp đ tạo mọi điều kiện thuận lợi, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập cũng nh hoàn thành luận văn. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phạm Ngọc Lơng, ngời thầy trực tiếp hớng dẫn, truyền thụ kiến thức khoa học, động viên về tinh thần, giúp đỡ để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài này. Đồng thời với tất cả lòng kính trọng, tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Tiến sĩ Phan Hữu Tôn, đ tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, tài liệu giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin vô cùng biết ơn bố, mẹ, chồng con và những ngời thân trong gia đình, là nguồn động viên khích lệ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2006 Tác giả luận văn Phạm Thị Thuý Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 4 Mục lục Lời cam đoan i Lời cám ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v 1. Mở đầu 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 8 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 9 1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 10 2. Tổng quan tài liệu 11 2.1. Ưu thế lai ở lúa 11 2.2. Đa dạng sinh học 23 2.3. Khái niệm về chỉ thị di truyền 25 2.4. Một số chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 31 2.5. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng chỉ thị phân tử SSR trong và ngoài nớc 38 3. Đối tợng, vật liệu, địa điểm, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 44 3.1. Đối tợng, vật liệu nghiên cứu 44 3.2. Địa điểm nghiên cứu 47 3.3. Nội dung nghiên cứu 47 3.4. Phơng pháp nghiên cứu 47 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận 54 4.1. Kết quả đánh giá một số đặc điểm nông sinh học của các dòng, giống lúa nghiên cứu 54 4.2. Kết quả nghiên cứu đa hình ADN lúa bằng chỉ thị phân tử SSR 57 4.2.1. Kết quả tách chiết ADN genome 57 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 5 4.2.2. Kết quả phản ứng PCR 58 4.2.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide, phân tích đa hình về mối quan hệ di truyền giữa 15 dòng, giống lúa nghiên cứu 60 4.3. Nghiên cứu u thế lai thực và mối tơng quan giữa khoảng cách di truyền với u thế lai con lai F1 của các tổ hợp lai giữa Indica/ Japonica và Indica/ Javanica ở một số tính trạng cơ bản 66 4.3.1. u th lai tớnh trng chiu cao cõy v chiu di bông ca các con lai F1 ở các tổ hợp lai giữa Indica/ Japonica và Indica/ Javanica 67 4.3.2. u th lai tớnh trng số hạt chắc trên bông và số bông trên khóm ca con lai F1 ở các tổ hợp lai giữa Indica/ Japonica và Indica/ Javanica 79 4.3.3. u th lai tớnh trng khối lợng nghìn hạt và năng suất lý thuyết ca con lai F1 ở các tổ hợp lai giữa Indica/ Japonica và Indica/ /Javanica 90 5. Kết luận và đề nghị 102 5.1. Kết luận 102 5.2. Đề nghị 103 Tài liệu tham khảo 104 Phụ lục 1 105 Phụ lục 2 109 Phụ lục 3 111 Các bài báo đ công bố liên quan đến luận văn 112 Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 6 Danh mục các chữ viết tắt ADN: Acid deoxyribonucleic ARN: Acid ribonucleic AFLP: Đa hình độ dài các đoạn đợc nhân chọn lọc (Amplified Fragment Lengh Polymorphisms) CTAB: Cetyl Trimethyl Amonium Bromid cs: Cộng sự dNTP: Dideoxy nucleosid triphosphate KCDT: Khoảng cách di truyền NST: Nhiễm sắc thể NSLT: Năng suất lý thuyết PCR: Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RAPD: Đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên (Randomly Amplified Polymorphic DNA) RFLP: Đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Lengh Polymorphisms) SSR: Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats) TAE: Tris-acetic acid EDTA TBE: Tris- borate - EDTA TL: u thế lai Các giống lúa: CPX: Chiêm Phú xuyên NT: Nếp tan KNT: Khẩu nua tẩu Plẩu: Plẩu la Trường ðại học Nông nghiệp 1 - Luận văn Thạc sỹ khoa học Nông nghiệp --------------------------------- 7 KRN: KhÈu ruéc n−¬ng Tan: Tan do KD18: Khang d©n 18 Tra: Tra lÌng Ma: Mµ cha TNR: TÎ n−¬ng r©u NV: NÕp vµng C¸c ch÷ viÕt t¾t trong h×nh ®iÖn di M: Macker chuÈn 1: SL12 2: DT28 8: TÎ n−¬ng r©u 3: KD18 9 : KhÈu ruéc n−¬ng 4: DT122 10: Tra lÌng 5: DT26 11: NÕp tan 6: PlÈu la 12: Chiªm Phó xuyªn 7: NÕp vµng 13: Tan do 14: Mµ cha 15: KhÈu nua tÈu Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 8 1. Mở đầu 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Lúa gạo có tầm quan trọng sống còn đối với hơn một nửa dân số thế giới, nhu cầu lơng thực của thế giới phải tăng gấp đôi vào những năm đầu thế kỷ 21, do đó cần phải tăng nhanh sản lợng lúa [23]. Một trong những biện pháp quan trọng nhất là phải tạo ra giống lúa có năng suất cao, vì vậy mục tiêu của các nhà khoa học trên thế giới đ tập trung nghiên cứu sử dụng u thế lai ở lúa đợc xem là hớng giải quyết có hiệu quả nhất. Trung quốc là một nớc đi tiên phong trong lĩnh vực nghiên cứu và đa vào sản xuất thành công thành tựu khoa học kỹ thuật về lúa lai. Mỗi năm ở nớc này có khoảng 17 triệu ha ruộng trồng lúa lai, chiếm trên 50% diện tích trồng lúa và 60% sản lợng lúa của cả nớc, năng suất bình quân tăng từ 20%-30% so với lúa thuần [3]. Việt Nam hiện nay là một trong những nớc đứng thứ hai trên thế giới về sử dụng u thế lai ở lúa, chơng trình nghiên cứu lúa lai của quốc gia thực sự trở thành một chiến lợc quan trọng nhằm tăng năng suất lúa. Lúa lai đ có một vị trí quan trọng không thể thiếu đợc trong cơ cấu giống ở miền Bắc. Cho đến năm 2004 diện tích gieo trồng lúa lai là 621.382 ha, năng suất lúa lai bình quân tăng từ 1,5 tấn đến 2 tấn/ha so với lúa thuần [13], [21]. Để nâng cao năng suất, cải thiện chất lợng lúa thờng tiến hành lai hữu tính giữa các dòng giống bố mẹ có mức độ xa nhau nhất định về mặt di truyền. Các dòng giống khác nhau nhiều về tính trạng nông sinh học, kiểu gen hay kiểu hình. Để đánh giá sự khác nhau này theo phơng pháp truyền thống là dựa vào độ lớn sai khác của các tính trạng nông sinh học quan trọng. Sự đa dạng di truyền ADN là rất lớn cho nên nó có thể dễ dàng phân biệt đợc sự khác nhau giữa các dòng giống. Sự khác biệt về di truyền là cơ sở tạo nên u thế lai, ở một chừng mực nào đó, khi bố mẹ sử dụng để lai có khoảng cách di Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 9 truyền càng xa nhau thì sự biểu hiện u thế lai càng cao. Để làm đợc điều này thì việc nghiên cứu, đánh giá đa dạng nguồn gen lúa cũng nh việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa các dòng, giống lúa là rất cần thiết. Nhằm khắc phục những trở ngại mà phơng pháp chọn giống truyền thống rất khó giải quyết, kỹ thuật chỉ thị phân tử nh RFLP, AFLP, RAPD, SSR . là những công cụ tỏ ra hữu hiệu để nghiên cứu đa hình của các giống, cho phép ta xác định đợc khoảng cách di truyền một cách nhanh chóng và chính xác. Trong số các chỉ thị phân tử thì chỉ thị SSR đợc đánh giá là có nhiều u điểm so với các chỉ thị khác, có khả năng cho đa hình cao, có bản chất đồng trội, di truyền theo quy luật Menden. Sử dụng chỉ thị này trong phân tích di truyền rất đơn giản, không cần dùng đồng vị phóng xạ, rất chính xác, ít tốn kém, có thể xác định đa hình giữa các dòng giống, các cá thể và là một trong những chỉ thị có nhiều triển vọng trong chơng trình chọn giống. Xuất phát từ những mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeats) trong chọn giống lúa. 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích Xác định đợc mối quan hệ di truyền giữa các dòng, giống lúa bằng chỉ thị phân tử SSR, tìm hiểu mối tơng quan giữa khoảng cách di truyền với u thế lai của con lai F1 ở một số tính trạng để định hớng trong chọn tạo giống lúa. 1.2.2. Yêu cầu - Sử dụng phơng pháp SSR để đánh giá đa dạng di truyền giữa 15 dòng, giống lúa trên cơ sở phân tích ADN, xác định khoảng cách di truyền, vẽ biểu đồ biểu hiện mối quan hệ này. Trng i hc Nụng nghip 1 - Lun vn Thc s khoa hc Nụng nghip --------------------------------- 10 - Tiến hành lai giữa hai phân loài phụ Indica/ Japonica, Indica/ Javanica, đánh giá u thế lai, xác định mối tơng quan giữa khoảng cách di truyền và u thế lai ở một số tính trạng nông sinh học quan trọng. 1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1. ý nghĩa khoa học Đề tài nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR, trên cơ sở phân tích ADN đ xác định đợc khoảng cách di truyền giữa các dòng, giống lúa. Đề tài nghiên cứu u thế lai của các con lai F1 thuộc các phân loài phụ Indica/ Japonica, Indica/ Javanica, mối tơng quan giữa khoảng cách di truyền và u thế lai của chúng ở một số tính trạng cơ bản, vì vậy đề tài cung cấp thêm số liệu và thông tin khoa học cho các nhà nghiên cứu khoa học tham khảo. 1.3.2. ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài đóng góp một số thông tin cần thiết trong chơng trình chọn tạo giống lúa siêu cao sản, khai thác sử dụng nguồn gen thuộc các phân loài phụ, tìm đợc những con lai có khả năng kết hợp tốt có thể sử dụng trong chọn giống lúa. [...]... với tốc độ khác nhau trong trờng điện di một chiều hay hai chiều tạo ra những đặc điểm đặc trng trên gel điện di v có thể hiển thị bằng phơng pháp nhuộm Phân tích Isozym l phơng pháp đánh giá nhanh vì cùng một lúc có thể phân tích đợc nhiều mẫu v khối lợng cho mỗi mẫu phân tích cần rất ít, thích hợp cho việc nghiên cứu phục vụ phân loại Vấn đề l phải chọn hệ Isozym n o để có sự phân biệt rõ giữa các... thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái nh sau: 1/ Kiểu gen của các locut chỉ thị phân tử có thể đợc xác định tại bất kỳ giai đoạn n o v ở bất cứ mức độ n o: tế b o, mô hay to n bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt đợc trong những giai đoạn nhất định v thờng ở mức độ to n bộ cơ thể 2/ Số lợng các chỉ thị phân tử ADN l cực lỳ lớn, trong khi đó... khác di truyền ở mức độ phân tử (Bùi Bá Bổng, 2002), (Nguyễn Thị Kim Liên, 2003) [4], [15] Các kết quả n y sẽ l tiền đề cho các nghiên cứu chọn tạo giống lúa mới dới sự trợ giúp của chỉ thị phân tử Các nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử để xác định khoảng cách di truyền giữa các dòng bố mẹ trong tập đo n các giống lúa thuộc 3 lo i phụ (Indica, Japonica, Javanica) đ đợc tập trung nghiên cứu mạnh mẽ ở nhiều... điểm trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại Lợi thế của phơng pháp n y l không cần biết thông tin về trình tự đoạn nhân RAPD đợc dùng nhiều nhất trong xác định các trạng thái khác nhau, xác định quan hệ di truyền v nghiên cứu đa dạng ở nhiều lo i cây trồng trong đó có lúa [27] Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng trong nghiên cứu sự thay đổi ADN genome Nghiên. .. chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử n y, đây đợc gọi l phơng pháp chọn lọc dựa v o chỉ thị ADN - Marker-Assisted Selection (MAS) [25] Với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới Nhờ v o u điểm tuyệt đối của chỉ thị phân tử nh tìm v phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định n o đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của... cả khi quần thể chọn giống có kích thớc nhỏ v các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Trong một số trờng hợp, các nh chọn giống đôi khi chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ l có thể đạt đợc mục tiêu của mình [37] Điều n y chứng tỏ công nghệ chỉ thị có lợi thế khi ứng dụng trong chọn tạo giống lúa 2.4 Một số chỉ thị phân tử ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 2.4.1 Đa hình độ d i các đoạn... (AFLP) - Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại (Repeatitive sequences): + Tiểu vệ tinh (Minisatellite) + Đa hình các đoạn lặp lại đơn giản - Simple Sequence Repeats (SSR) hay còn gọi l chỉ thị vi vệ tinh (Microsatellite) Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gen trên rất nhiều loại cây trồng sử dụng các chỉ thị phân tử đợc phát triển nhanh chóng Ngời ta đ thiết lập đợc bản đồ chi tiết... dụng v dựng cây phát sinh chủng loại (dendrogram) Giá trị của SSR l ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tơng ứng, bao phủ rộng khắp genome v có bản chất đồng trội, dễ d ng phát hiện bằng PCR Chỉ thị SSR đ đợc nghiên cứu lần đầu tiên trên ngời ở ngời, SSR đợc gọi l thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử [39] Cho đến nay nó đợc tìm thấy trong các genome của cơ thể Eukaryot khác nh gia cầm, động vật... giản n y đ đợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tợng động vật v thực vật [35], [60] ở thực vật, tần số v số lợng SSR đ đợc xác định trên lúa mì [54] v 34 giống cây trồng khác [50], [56] Những kết quả nghiên cứu n y đ chỉ ra rằng ở thực vật, SSR mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với động vật Những nghiên cứu trên lúa [62], ngô [58] cũng cho kết quả tơng tự Trong hệ gene lúa, (GA)n... của chỉ thị phân tử thờng không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thờng hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn 4/ Các alen của các chỉ thị phần lớn l đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly n o, còn các alen của các chỉ thị hình thái thờng tơng tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều