Đang tải... (xem toàn văn)
Vi sinh vật (microorganisms) là những sinh vật nhỏ bé đến mức chỉ có thể thấy được chúng dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Vi sinh vật gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm. Tuy nhiên số vi sinh vật gây bệnh chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong thế giới vi sinh vật. Từ xa xưa người ta đã biết ứng dụng các vi sinh vật có ích (tuy chưa hề biết tới sự tồn tại của chúng) để chế biến thực phẩm ( như nấu rượu, làm tương, mắm, nước mắm, giấm, sữa chua, chao, muối dưa, muối cà, ...), ủ phân, ngâm vỏ cây lấy sợi, xếp ải đất, trồng luân canh với cây họ Đậu...; hoặc sử dụng các biện pháp để ngăn chặn tác hại của vi sinh vật (như ướp muối thịt, cá, làm mứt, phơi khô củ cải, tôm, cá...).
Lời ngỏ giáo sư Nguyễn Lân Dũng Cùng bạn đọc Vi sinh vật (microorganisms) sinh vật nhỏ bé đến mức thấy chúng kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử Vi sinh vật gây nhiều bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm Tuy nhiên số vi sinh vật gây bệnh chiếm phần nhỏ giới vi sinh vật Từ xa xưa người ta biết ứng dụng vi sinh vật có ích (tuy chưa biết tới tồn chúng) để chế biến thực phẩm ( nấu rượu, làm tương, mắm, nước mắm, giấm, sữa chua, chao, muối dưa, muối cà, ), ủ phân, ngâm vỏ lấy sợi, xếp ải đất, trồng luân canh với họ Đậu ; sử dụng biện pháp để ngăn chặn tác hại vi sinh vật (như ướp muối thịt, cá, làm mứt, phơi khô củ cải, tôm, cá ) Sau việc Leeuwenhoek phát vi sinh vật việc Louis Pasteur phát chất vi sinh vậttừ khai sinh ngành Vi sinh vật học (Microbiology)- nhân loại bắt đầu quan tâm nhiều đến lĩnh vực khoa học mẻ Vi sinh vật học trở thành tảng cho phát triển Công nghệ sinh học(CNSH) Người ta chia phát triển CNSH thành giai đoạn: * CNSH truyền thống trình dân dã nhằm chế biến , bảo quản loại thực phẩm, xử lý đất đai, phân bón để phục vụ nông nghiệp * CNSH cận đại q trình sử dụng nồi lên men cơng nghiệp để sản xuất quy mô lớn sản phẩm sinh học mỳ (bột ngọt), lizin axít amin khác, acid hữu cơ, dung mơi hữu cơ, chất kháng sinh, số vitamin (như vitamin B2, B12, C ), nhiều loại enzym * CNSH đại chia lĩnh vực CN di truyền (genetic engineering), công nghệ tế bào (cell engineering), công nghệ enzym protein (enzyme/protein engineering), CN vi sinh vật/ CN lên men (microbial engineering / fermentation), CN môi trường (environmental engineering) CNSH đại thường gắn liền với thể mang gen tái tổ hợp ( recombination gene) Vi sinh vật học khoa học nghiên cứu thể nhân tố nhỏ đến mức không thấy mắt thường, tức vi sinh vật Vi sinh vật học giảng dạy rât nhiều trường Đại học, Cao đẳng, Trung học chuyên nghiệp đề cập đến nhiều bậc phổ thông Vi sinh vật học kiến thức liên quan đến cuốc sống người Bên cạnh giáo trình Vi sinh vật học biên soạn từ lâu tái nhiều lần muốn cung cấp thêm cho đông đảo bạn đọc, thầy cô giáo giảng dạy vi sinh vật học tập tài liệu trình bày với nhiều tranh ảnh sơ đồ, biểu đồ Có thể coi phần tham khảo để thiết kế giảng nhằm mục tiêu cập nhật với tiến ngành khoa học luôn đổi Để giúp bạn trẻ tiếp cận với sách báo nước ngoài, cập nhật kiến thức qua Internet cố gắng viết thêm tiếng Anh sau thuật ngữ khoa học để ngun thích tiếng Anh hình vẽ Thông qua việc giáo viên hướng dẫn sinh viên điền tiếng Việt vào hình vẽ giúp ích nhiều cho trình tự học sinh viên Rất mong nhận ý kiến đóng góp bạn đồng nghiệp đơng đảo bạn đọc Vì mục đích phục vụ phi lợi nhuận mong lượng thứ việc sử dụng hình ảnh thu nhận qua Internet GS.TS Nguyễn Lân Dũng Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội Lược sử nghiên cứu Vi sinh vật học 1546- Girolamo Fracastoro (1478, 1553) cho thể nhỏ bé tác nhân gây bệnh tật Ông viết thơ Syphilis sive de morbo gallico (1530) từ tựa đề thơ đó, người ta dùng đề đặt tên bệnh 1590-1608- Zacharias Janssen lần lắp ghép kính hiển vi 1676- hồn thiện kính hiển vi khám phá giới vi sinh vật (mà ông gọi anmalcules) 1688- Nhà vạn vật học người Ý Francisco Redi công bố nghiên cứu phát sinh tự nhiên giịi 1765-1776- Spallanzani (1729-1799) cơng kích thuyết Phát sinh tự nhiên 1786- Müller đưa phân loại vi khuẩn 1798- Edward Jenner nghĩ phương pháp chủng mủ đậu bò để phong ngừa bệnh đậu mùa 1838-1839- Schwann Schleiden công bố Học thuyết tế bào 1835-1844- Basi công bố bệnh tằm nấm gây nên nhiều bệnh tật khác vi sinh vật gây nên 1847-1850- Semmelweis cho bệnh sốt hậu sản lây truyền qua thầy thuốc kiến nghị dùng phương pháp vơ khuẩn để phịng bệnh 1849- Snow nghiên cứu dịch tễ bệnh tả vùng London 1857- Louis Pasteur (1822-1895) chứng minh trình lên men lactic gây nên vi sinh vật 1858- Virchov tuyên bố tế bào sinh từ tế bào 1861- Pasteur chứng minh vi sinh vật không tự phát sinh theo thuyết tự sinh 1867- Lister công bố cơng trình nghiên cứu phẫu thuật vơ khuẩn 1869- Miescher khám phá acid nucleic 1876-1877- Robert Koch (1843-1910) chứng minh bệnh than vi khuẩn Bacillus anthracis gây nên 1880- Alphonse Laveran phát ký sinh trùng Plasmodium gây bệnh sốt rét 1881- Robert Koch nuôi cấy khiết vi khuẩn môi trường đặc chứa gelatin Pasteur tìm vaccin chống bệnh than 1882- Koch phát vi khuẩn lao - Mycobacterium tuberculosis 1884- Lần công bố Nguyên lý Koch Elie Metchnikoff (1845-1916) miêu tả tượng thực bào (phagocytosis) Triển khai nồi khử trùng cao áp (autoclave) Triển khai phương pháp nhuộm Gram 1885- Pasteur tìm vaccin chống bệnh dại Escherich tìm vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy 1886- Fraenkel phát thấy Streptococcus pneumoniae gây bệnh viêm phổi 1887- Richard Petri phái ta cách dùng hộp lồng (đĩa Petri) để nuôi cấy vi sinh vật 1887-1890- Winogradsky nghiên cứu vi khuẩn lưu huỳnh vi khuẩn nitrat hoá 1889- Beijerink phân lập vi khuẩn nốt sần từ rễ đậu 1890- Von Behring làm kháng độc tố chống bệnh uốn ván bệnh bạch hầu 1892- Ivanowsky phát mầm bệnh nhỏ vi khuẩn (virus) gây bệnh khảm thuốc 1894- Kitasato Yersin khám phá vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Yersina pestis) 1895- Bordet khám phá Bổ thể (complement) 1896- Van Ermengem tìm mầm bệnh ngộ độc thịt (vi khuẩn Clostridium botulinum) 1897- Buchner tách men (ferments) từ nấm men (yeast) Ross chứng minh ký sinh trùng sốt rét lây truyền bệnh qua muỗi 1899- Beijerink chứng minh hạt virus gây nên bệnh khảm thuốc 1900- Reed chứng minh bệnh sốt vàng lây truyền muỗi 1902- Landsteiner khám phá nhóm máu 1903- Wright cộng khám phá Kháng thể (antibody) máu động vật miễn dịch 1905- Schaudinn Hoffmann tìm mầm bệnh giang mai (Treponema pallidum) 1906- Wassermann phát xét nghiệm cố định bổ thể để chẩn đoán giang mai 1909- Ricketts chứng minh bệnh Sốt ban núi đá lan truyền qua ve mầm bệnh vi khuẩn (Rickettsia rickettsii) 1910- Rous phát ung thư gia cầm 1915-1917- D’Herelle Twort phát virus vi khuẩn ( thực khuẩn thể) 1921- Fleming khám phá lizôzim (lysozyme) 1923-Xuất lần đầu phân loại Vi khuẩn (Bergey’s Manual) 1928- Griffith khám phá việc biến nạp (transformation) vi khuẩn 1929- Fleming phát penicillin 1931- Van Niel chứng minh vi khuẩn quang hợp sử dụng chất khử nguồn cung cấp electron không sản sinh ôxy 1933- Ruska làm kính hiển vi điện tử 1935- Stanley kết tinh virus khảm thuốc (TMV) Domag tìm thuốc sulfamide 1937- Chatton phân chia sinh vật thành hai nhóm: Nhân sơ (Procaryotes) Nhân thật (Eucaryotes) 1941- Beadle Tatum đưa giả thuyết gen- enzym 1944- Avery chứng minh ADN chuyển thông tin di truyền trình biến nạp Waksman tìm streptomycin 1046- Lederberg Tatum khám phá trình tiếp hợp (conjugation) vi khuẩn 1949- Enders, Weller Robbins nuôi virus Polio (Poliovirus) mô người nuôi cấy 1950- Lwoff xác định thực khuẩn thể tiềm tan (lysogenic bacteriophages) 1952- Hershey Chase chứng minh thực khuẩn thể tiêm ADN vào tế bào vật chủ (host) Zinder Lederberg khám phá trình tải nạp (transduction) vi khuẩn 1953- Frits Zernike Làm kính hiển vi tương phản pha (phase-contrast microscope) Medawar khám phá tượng nhờn miễn dịch (immune tolerance) Watson Crick khám phá chuỗi xoắn kép ADN 1955- Jacob Monod khám phá yếu tố F plasmid Jerne Burnet chứng minh lý thuyết chọn lọc clone (clonal selection) 1959- Yalow triển khai kỹ thuật Miễn dịch phóng xạ 1961- Jacob Monod giới thiệu mơ hình điều hồ hoạt động gen nhờ operon 1961-1966- Nirenberg, Khorana cộng giải thích mã di truyền 1962- Porter chứng minh cấu trúc Globulin miễn dịch G Tổng hợp quinolone có tác dụng diệt khuẩn ( acid nalidixic) 1970- Arber Smith khám phá enzym giới hạn (restriction endonuclease) Temin Baltimore khám phá enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) 1973- Ames triển khai phương pháp vi sinh vật học để khám phá yếu tố gây đột biến (mutagens) Cohen, Boyer, Chang Helling sử dụng vectơ plasmid để tách dòng gen vi khuẩn 1975- Kohler Milstein phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng ( monoclonal antibodies) Phát bệnh Lyme 1977- Woese Fox thừa nhận Vi khuẩn cổ (Archaea) nhóm vi sinh vật riêng biệt Gilbert Sanger triển khai kỹ thuật giải trình tự ADN (DNA sequencing) 1979-Tổng hợp Insulin kỹ thuật tái tổ hợp ADN Chính thức ngăn chặn bệnh đậu mùa 1980- Phát triển kính hiển vi điện tử quét 1982- Phát triển vaccin tái tổ hợp chống viêm gan B 1982-1983- Cech Altman phát minh ARN xúc tác 1983-1984- Gallo Montagnier phân lập định loại virus gây suy giảm miễn dịch người Mulli triển khai kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 1986- Lần ứng dụng người vaccin sản xuất kỹ thuật di truyền (vaccin viêm gan B) 1990- Bắt đầu thử nghiệm lần liệu pháp gen (gene-therapy) người 1992- Thử nghiệm người liệu pháp đối nghĩa (antisense therapy) 1995- Hoa Kỳ chấp thuận sử dụng vaccin đậu gà Giải trình tự hệ gen vi khuẩn Haemophilus influenzae 1996- Giải trình tự hệ gen vi khuẩn Methanococcus jannaschii Giải trình tự hệ gen nấm men 1997- Phát loại vi khuẩn lớn Thiomargarita namibiensis Giải trình tự hệ gen vi khuẩn Escherichia coli 2000- Phát vi khuẩn tả Vibrio cholerae có nhiễm sắc thể riêng biệt Janssen Leeuwenhoek (1632-1723) Pasteur (1822-1895) Kính hiển vi Leeuwenhoek Bút tích miêu tả vi sinh vật Leeuwenhoek Robert Koch (1843-1910) Thí nghiệm bình cổ cong để phản đối thuyết tự sinh (Pasteur) Vi khuẩn lao chụp qua kính hiển Elie Metchnikoff (1845vi 1916) Alexander Fleming (1881-1955) Nấm Penicillium sản sinh penicillin Những đặc điểm chung Vi Sinh Vật -Vi sinh vật thuộc giới sinh vật nào? Vi sinh vật khơng phải nhóm phân loại sinh giới mà bao gồm tất sinh vật có kích thước hiển vi, khơng thấy rõ mắt thường, phải sử dụng kính hiển vi thường kính hiển vi điện tử Ngoài muốn nghiên cứu vi sinh vật người ta phải sử dụng tới phương pháp nuôi cấy vô khuẩn Từ trước đến có nhiều hệ thống phân loại sinh vật Các đơn vị phân loại sinh vật nói chung vi sinh vật nói riêng từ thấp lên cao Loài (Species), Chi (Genus), Họ (Family), Bộ (Order), Lớp (Class), Ngành (Phylum), Giới (Kingdom) Hiện giới cịn có mức phân loại gọi lĩnh giới (Domain) Đấy chưa kể đến mức phân loại trung gian Loài phụ (Subspecies), Chi phụ (Subgenus), Họ phụ (Subfamily), Bộ phụ (Suborder),Lớp phụ (Subclass), Ngành phụ (Subphylum) John Ray Carl Von Linnaeus Xưa John Ray (1627-1705) Carl Von Linnaeus (1707-1778) chia giới Thực vật Động vật Năm 1866 E H Haeckel (1834-1919) bổ sung thêm giới Nguyên sinh (Protista) Năm 1969 R H Whitaker (1921-1981) đề xuất hệ thống phân loại giới : Khởi sinh (Monera), Nguyên sinh (Protista), Nấm (Fungi), Thực vật (Plantae) Động vật (Animalia) Khởi sinh bao gồm Vi khuẩn (Bacteria) Vi khuẩn lam (Cyanobacteria) Nguyên sinh bao gồm Động vật nguyên sinh (Protzoa), Tảo (Algae) Nấm sợi sống nước (Water molds) Gần có hệ thống phân loại giới- giới thêm giới Cổ vi khuẩn (Archaebacteria), giới Khởi sinh đổi thành giới Vi khuẩn thật (Eubacteria) (P H Raven, G B Johnson, 2002) Cổ vi khuẩn Vi khuẩn thật thuộc Cịn T Cavalier-Smith (1993) lại đề xuất hệ thống phân loại giới: Vi khuẩn thật (Eubacteria), Cổ vi khuẩn (Archaebacteria), Cổ trùng (Archezoa), Sắc khuẩn (Chromista), Nấm (Fungi), Thực vật (Plantae) Động vật (Animalia) Theo R Cavalier-Smith Cổ trùng (như Giardia) bao gồm thể đơn bào nguyên thuỷ có nhân thật, có ribosom 70S, chưa có máy Golgi, chưa có ty thể (mitochondria) chưa diệp lục (Chloroplast), chưa có peroxisome Sắc khuẩn bao gồm phần lớn thể quang hợp chứa thể diệp lục phiến (lumen) mạng lưới nội chất nhăn (rough endpplasmic reticulum) tế bào chất (cytoplasm), chẳng hạn Tảo silic , Tảo nâu, Cryptomonas, Nấm noãn Năm 1980, Carl R Woese dựa nghiên cứu sinh học phân tử phát thấy Cổ khuẩn có sai khác lớn trật tự nucleotid ARN ribosom 16S 18S Ông đưa hệ thống phân loại ba lĩnh giới (Domain) bao gồm Cổ khuẩn (Archae), Vi khuẩn (Bacteria) Sinh vật nhân thực (Eucarya) Cổ khuẩn nhóm vi sinh vật có nguồn gốc cổ xưa Chúng bao gồm nhóm vi khuẩn phát triển môi trường cực đoan (extra), chẳng hạn nhóm ưa mặn (Halobacteriales), nhóm ưa nhiệt (Thermococcales, Thermoproteus, Thermoplasmatales), nhóm kỵ khí sinh mêtan (Methanococcales, Methanobacteriales, Methanomicrobiales), nhóm vi khuẩn lưu huỳnh ưa nhiệt (Sulfobales, Desulfurococcales) Monera hệ thống giới tương đương với Vi khuẩn Cổ khuẩn hệ thống giới hệ thống lĩnh giới Nguyên sinh hệ thống giới tương đương với giới Cổ trùng (Archaezoa), Nguyên sinh (Protista- Protozoa) Sắc khuẩn (Chromista) hệ thống giới tương đương với nhóm sau hệ thống lĩnh giới (domain): Archaezoa, Euglenozoa, Alveolata, Stramenopila Rhodophyta Theo hệ thống lĩnh giới Archaezoa bao gồm Diplomonad, Trichomonad Microsporidian Euglenozoa ao gồm Euglenoid Kinetoplastid Alveolata bao gồm Dinoflagellate, Apicomplexan, Ciliate Strmenopila bao gồm Tảo silic (Diatoms) , Tảo vàng (Golden algae), Tảo nâu (Brown algae) Nấm sợi sống nước (Water mold) Rhodophyta gồm Tảo đỏ (Red algae) Riêng Tảo lục (Green algae) phần thuộc Nguyên sinh (Protista) phần thuộc Thực vật (Plantae) Hệ thống phân loại giới sinh vật Phiếu thông tin chủng vi sinh vật bảo quản: Đại học Quốc gia Hà Nội Thông tin chung chủng vi sinh vật bảo quản Trung tâm Công nghệ Sinh học Bảo tàng Giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) Nấm sợi Nấm men Xạ khuẩn Vi khuẩn Tên khoa học: Giống (Genus) Loài (Species) Dưới loài (Subspecies) Tên khác có (synnonym): Nguồn phân lập: Nơi phân lập: Thời gian bắt đầu bảo quản VTCC: Người phân lập: Người cung cấp: Nơi cung cấp: Ký hiệu chủng VTCC: Ký hiệu lý lịch chủng từ bảo tàng khác: VTCC < < < Chủng chuẩn (Type) < < Chủng tự nhiên (wild) Đột biến (cụ thể…) 10 Hình thức sinh sản: 11 Gây bệnh cho: Người Động vật 12 Dấu chuẩn di truyền (nếu có): 13 Hình thái tế bào, khuẩn lạc: 14 Khả ứng dụng: 15 Tài liệu liên quan: 16 Các phương pháp bảo quản: Thực vật Không Đông khô Lạnh sâu Nitơ lỏng Cấy truyền 17 Mơi trường ni cấy thích hợp: 18 Nhiệt độ ni cấy thích hợp: 19 Ghi chú: Chức sưu tập vi sinh vật: Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng đặc biệt, làm tảng cho nghiên cứu ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp môi trường Nhiệm vụ quan trọng Bộ sưu tập chủng vi sinh vật thu thập, làm giàu chủng vi sinh vật hữu ích bảo quản chúng theo phương pháp thích hợp Việc thu thập chủng vi sinh vật nhiều cách phân lập, tuyển chọn từ môi trường, trao đổi nước quốc tế Các chủng vi sinh vật phải định hướng theo mục tiêu cụ thể Bộ sưu tập, ví dụ chủng vi sinh vật chuẩn, chủng có hoạt tính sinh học chủng làm sở cho tra cứu nghiên cứu tính đa dạng vi sinh vật Bảo quản chủng vi sinh vật công việc khơng dễ dàng, xuất phát từ mục đích bảo quản khơng trì khả sống vi sinh vật, chủng, tránh tạp nhiễm mà đảm bảo tính ổn định di truyền đặc tính sinh học suốt q trình bảo quản Thực tế khơng có phương pháp bảo quản vạn dùng chung cho nhóm vi sinh vật mà nhóm vi sinh vật thích hợp với vài phương pháp bảo quản định Các chủng vi sinh vật bảo quản cung cấp cho người sử dụng nhiệm vụ quan trọng sưu tập vi sinh vật thu thập cung cấp thông tin quan trọng chủng vi sinh vật bảo quản cho người sử dụng như: môi trường ni cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh học, tên phân loại v.v Như yêu cầu cán phụ trách Bộ sưu tập vi sinh vật phải có kiến thức vững vi sinh vật, di truyền học, sinh hoá học, sinh lý vi sinh vật bệnh học vi sinh vật để kiểm sốt đặc tính quan trọng vi sinh vật bảo quản Một số điểm lưu ý Bộ sưu tập vi sinh vật: 3.1 Duy trì khả sống vi sinh vật bảo quản: Trong thực phương pháp bảo quản trình bảo quản tế bào vi sinh vật bị chết phải áp dụng phương pháp bảo quản thích hợp nhằm hạn chế thấp khả chết tế bào 3.2 Quan tâm đến số lượng tế bào tiến hành bảo quản: Trong trình bảo quản số lượng tế bào vi sinh vật giảm dần theo thời gian cần tính tốn số lượng vi sinh vật thời điểm bảo quản thích hợp để trì số lượng vi sinh vật sống thời gian bảo quản dài 3.3 Duy trì đặc tính di truyền ổn định chủng vi sinh vật bảo quản: Nói chung với chủng vi sinh vật bảo quản, đặc biệt với chủng vi sinh vật chuẩn, chủng vi sinh vật có ứng dụng cơng nghiệp u cầu trì đặc tính sinh học, tính trạng di truyền quan trọng Các phương pháp bảo quản khơng thích hợp dẫn đến đột biến plasmid Vì cần phải chọn phương pháp bảo quản thích hợp cho chủng 3.4 Tính chủng vi sinh vật bảo quản: Chủng vi sinh vật từ bảo quản đến sử dụng phải đảm bảo chủng theo tên đặc điểm sinh học đặc trưng Đây yêu cầu tiên công việc Bảo tàng vi sinh vật, mà thao tác phương pháp tiến hành phải thực cho hạn chế tới mức tối thiểu chủng bảo quản nhằm tránh tạp nhiễm 3.5 Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật: Kinh phí bao gồm kinh phí lương cho cán bộ, thiết bị, vật tư hoá chất, nhà xưởng điện nước tiêu hao Các kinh phí tuỳ thuộc vào quy mô Bộ sưu tập giống vi sinh vật phương pháp bảo quản, phạm vi dịch vụ thực khách hàng Tên Bảo tàng vi sinh vật (viết tắt) Nước Số lượng chủng vi sinh vật ATCC Mỹ 73507 DSMZ Đức 14460 NBRC Nhật 18300 Bảng Quy mô số sưu tập giống vi sinh vật STT Tên Bảo tàng vi sinh vật, Nước Giá thành (USD) ATCC, Mỹ 80 CBS, Hà Lan 60 VKM, Nga 45 Thái Lan 40 Bảng Giá thành cho bảo quản chủng vi sinh vật hàng năm 3.6 Bảo quản chủng có giá trị: Đối với chủng vi sinh vật có giá trị tuỳ theo yêu cầu mà cần thực nhiều phương pháp khác bảo quản nơi khác để hạn chế khả đặc tính quý chủng rủi ro ngẫu nhiên (cháy nổ, động đất, chiến tranh v.v ) 3.7 Cung cấp chủng giống cho khách hàng: Đối với chủng cần cung cấp nhiều cho khách hàng (hoặc chủng cần cho nghiên cứu thường xuyên) cần phải bảo quản với số lượng lớn với phương pháp thích hợp cho việc vận chuyển đến khách hàng 3.8 Cung cấp thông tin liên quan đến chủng bảo quản: Chất lượng Bộ sưu tập giống liên quan đến số liệu, thông tin chủng vi sinh vật bảo quản Do đó, nhu cầu nghiên cứu để thu nhận thông tin cần thiết cung cấp cho khách hàng quan trọng 3.9 Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản: Các chủng Bộ sưu tập vi sinh vật cần phải tuân theo qui định nghiêm ngặt kiểm tra định kỳ theo thời gian bảo quản tỷ lệ sống sót, mức tạp nhiễm, thay đổi đặc tính di truyền dấu chuẩn di truyền, tồn plasmid, đặc điểm phân loại, khả sinh chất có hoạt tính sinh học…Một cách đánh giá khả sống sót chủng vi sinh vật bảo quản dựa theo phương trình sau: t = 8Log(So/Log So-Log Sac) Trong đó: t - Thời gian mẫu bảo quản ampoule So - Số lượng tế bào sống sót sau bảo quản Sac - Số lượng tế bào sống sót sau tiến hành thí nghiệm 3.10 Cơ sở liệu Bộ sưu tập vi sinh vật: Ngày nay, tin học lĩnh vực xâm nhập làm thay đổi sâu sắc đến lĩnh vực đời sống việc quản lý Bộ sưu tập vi sinh vật khơng cịn ngoại lệ Người ta ứng dụng phần mềm máy tính phù hợp để quản lý chủng vi sinh vật bảo quản, thông tin liên quan chương trình kiểm tra chất lượng định kỳ Sử dụng tin học cơng việc có tiện ích lớn, giúp cho người quản lý nắm bắt tồn thơng tin lý lịch chủng vi sinh vật dễ dàng tra cứu, làm báo cáo khoa học theo tiêu chí riêng Nói chung với sưu tập có số lượng vi sinh vật khơng lớn sử dụng phần mềm: Microsoft Access, Access Visual Basic Giới thiệu chung số phương pháp bảo quản vi sinh vật: Trong phần mô tả phương pháp dùng chung cho đối tượng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn, vi tảo) 4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật: Hình Bảo quản phương pháp cấy truyền môi trường thạch Đây phương pháp bảo quản đơn giản, chủng vi sinh vật cấy môi trường thích hợp (dịch thể hay thạch) ống nghiệm hay bình tam giác để điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau chủng vi sinh vật chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Q trình lặp lại thời hạn định, đảm bảo chủng vi sinh vật chuyển đến môi trường trước già chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản như: Staphylococi, Coliform sống vài năm theo cách Cho dù phương pháp phương pháp phổ biến dùng sở nghiên cứu sử dụng chủng vi sinh vật đặc biệt chủng dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ nhiều nhược điểm sau: - Dễ bị tạp nhiễm dễ dẫn đến chủng giống gốc - Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu chủng trình bảo quản - Phải nghiên cứu theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp chủng bảo quản - Tốn nhiều công sức để cấy truyền - Giống gốc sai sót dùng mơi trường cấy truyền khơng thích hợp - Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi đặc điểm sinh học đột biến xuất sau lần cấy truyền * Phương pháp làm nước môi trường bảo quản: Phương pháp thường dùng cho chủng nấm sợi nấm men Theo phương pháp chủng vi sinh vật bảo quản với chất mang phổ biến sau: a Trên đất, cát silicagel Các nghiên cứu cho thấy bào tử nấm sống 4-5 năm bị làm khô đất mà không bị thay đổi đặc tính sinh học Ngày silicagel chất mang dùng phổ biến có hiệu bảo quản nấm men, nấm sợi b Bảo quản giấy: Các chủng nấm men nấm sợi làm khơ giấy sau bọc giấy bạc đựng hộp kín Ưu phương pháp bảo quản lượng mẫu lớn c Bảo quản gelatin: Để thực phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật mơi trường có gelatin Sau giọt mẫu làm khô đĩa petri Phương pháp bảo quản vi khuẩn vài năm Nhìn chung, khơng có phương pháp vạn cho bảo quản nhóm vi sinh vật khác Thực khó đánh giá cách đầy đủ xét theo yêu cầu đặt Chính mà phương pháp bảo quản phải kiểm nghiệm thực tế với loại vi sinh vật, từ kết chọn phương pháp thích hợp đồng thời sử dụng phương pháp khác 4.2 Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp: a Phương pháp đơng khơ: Hình Đơng khơ vi sinh vật Đơng khơ q trình mà nước lấy khỏi mẫu mẫu trạng thái lạnh sâu Ở vi sinh vật huyền phù mơi trường thích hợp làm lạnh môi trường chân không Thiết bị đông khô hút nước cuối mẫu làm khơ đến mức định Mẫu hàn kín môi trường chứa mẫu chân không Đây phương pháp phổ biến có hiệu cao cho bảo quản đối tượng vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn số virut Tuy nhiên, phương pháp ứng dụng tảo, động vật nguyên sinh tế bào động vật b Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying): Ngồi phương pháp đơng khơ mơ tả trên, cịn có phương pháp đơng khơ trực tiếp Khác biệt với phương pháp chỗ dịch huyền phù vi sinh vật làm khô nhanh chế độ chân khơng thích hợp mà mẫu khơng cần làm lạnh từ trước Phương pháp đặc biệt có ý nghĩa nhóm vi khuẩn khơng có khả sống nhiệt độ thấp giai đoạn tiền đông Các thông số quan trọng cần quan tâm thực phương pháp là: - Tuổi vi sinh vật bảo quản - Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật - Tốc độ đông khô - Nhiệt độ đông khô thấp - Khoảng thời gian làm khô mẫu độ ẩm cuối mẫu Phương pháp nhanh thuận lợi cho đợt bảo quản số lượng lớn mẫu Thông thường theo phương pháp vi sinh vật bảo quản từ 10-20 năm Nói chung hai phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp trước thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm công sức sai sót nhãn mác tạp nhiễm Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp giá thành thiết bị Độ ổn định chủng vi sinh vật bảo quản theo đợt đông khô khác Hơn chủng trước đem sử dụng phải hoạt hố mơi trường thích hợp số lần để phục hồi đặc tính sinh học 4.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu: Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu vi sinh vật bảo quản môi trường dịch thể nước cần cho hoạt động sống vi sinh vật bị bất hoạt nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C) Hình Bảo quản lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào bị vỡ trình làm lạnh làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào việc tích luỹ chất điện giải mẫu bảo quản hình thành tinh thể nước tế bào Để khắc phục nhược điểm người ta bổ sung chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu làm tan nhanh glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thực thang nhiệt độ khác -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C -196° C Nói chung mức nhiệt độ cao -30° C cho hiệu thấp tế bào chịu nồng độ muối cao sinh từ chất điện giải Phương pháp bảo quản có hiệu với nhiều nhóm vi sinh vật khác nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn virut Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng phương pháp vạn Phương pháp thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm đầu tư kinh phí cho thiết bị điện, nitơ lỏng rủi ro cháy nổ Đặc biệt phương pháp khơng thích hợp với chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp thường dùng với chủng vi sinh vật có đặc tính q mà khơng thích hợp với phương pháp đơng khơ Hình Bảo quản nitơ lỏng Một số phương pháp phổ biến sử dụng bảo quản nhóm vi sinh vật cụ thể: Trong phần giới thiệu cụ thể số phương pháp thông dụng 5.1 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn: Bảo quản vi khuẩn: a Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization): Đây phương pháp phổ biến sử dụng bảo tàng vi sinh vật giới Phương pháp đông khô hạn chế thay đổi đặc tính vi sinh vật bảo quản thời gian dài Phương pháp đơng khơ trình bày phương pháp dùng NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) 1, Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn cấy môi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, chuẩn bị dịch vi khuẩn môi trường dịch thể phải làm đậm đặc tế bào li tâm Tuổi tế bào quan trọng thường chọn tế bào nằm pha sinh trưởng log 2, Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng hai loại đệm sau: + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyết ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng phương pháp lọc vi khuẩn, sau phân 5ml vào bình vơ trùng + Đệm inositol: Mơi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: gam Nước cất: đủ 100 ml Phân ml vào bình khử trùng nhiệt độ 121OC 3, Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng chất lượng bảo quản Thơng thường thu sinh khối từ ống thạch nghiêng dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật khơng có bào tử) Mật độ giảm với vi sinh vật có bào tử Hai đệm pha mẫu dùng với vi khuẩn trường hợp enterobacteria khơng dùng đệm huyết gây thay đổi đặc tính miễn dịch vi khuẩn 4, Chuẩn bị ống đông khơ: Ống đơng khơ rửa sau ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) lại rửa sạch, làm khô chuẩn bị nút bông, ống trùng khô khử trùng theo phương pháp thông thường 5, Chuẩn bị mẫu trước đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn đưa cẩn thận pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía ống đông khô 6, Bước tiền đông khô: Mục tiêu bước làm bay bị lạnh đông tạo đá Trước tiến hành đông khô mẫu chuẩn bị qua bước tiền đông (như trình bày trên) sau bước tiền đơng khơ tiến hành mẫu lắp vào hệ thống đông khơ q trình làm nước điều kiện lạnh tiến hành khoảng 7, Tạo chỗ thắt ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt Việc tạo vết thắt thực với hệ thống đèn hàn Tuy nhiên, sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn tạo vết thắt thiết bị tự động 8, Hậu đông khô: Trong bước mẫu lại tiếp tục làm khô độ ẩm cuối đạt khoảng 1% Thời gian cho bước thay đổi từ 1-2 9, Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp thiết bị đơng khơ (manifold) cần có kinh nghiệm cẩn thận Trước hết phải tiến hành khoá van sau thực thao tác hàn ống đông khô 10, Kiểm tra độ chân không ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị đèn phát mức độ chân không Với mẫu đạt độ chân khơng cần thiết xuất màu xanh tím nhạt Đối với mẫu khơng đạt tiêu chuẩn khơng có tín hiệu màu tím đậm 11, Kiểm tra khả sống mẫu: Đếm số lượng tế bào phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Việc đếm thực trước sau đông khô Các bước kiểm tra thực sau năm để đánh giá chất lượng mẫu đơng khơ Nói chung khả sống vi sinh vật có bào tử cao vi sinh vật khơng có bào tử loại gram dương cao vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí u cầu phải tiến hành theo qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy 12, Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường bảo quản 4OC hay nhiệt độ phòng b Phương pháp giữ lạnh sâu: 1, Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào nuôi cấy môi trường nhiệt độ thích hợp đầu pha log 2, Pha dịch tế bào với glycerol DMSO trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 3, Dịch huyền phù tế bào đưa vào ống lạnh sâu đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để dịch xanh metylene 0.05% để phát ống bị rị rỉ) Tồn mẫu để nhiệt độ phòng 30 phút cân áp suất thẩm thấu tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng mẫu chuyển sang bình nitơ lỏng Mẫu đưa vào lạnh sâu cần theo tốc độ định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu Sau mẫu làm lạnh tiếp với tốc độ cao 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến -80 OC) Hiện nay, có thiết bị làm lạnh sâu chương trình hố với tốc độ mong muốn Tuy nhiên, đơn giản mẫu ban đầu đặt đá khơ sau lại đưa vào tủ lạnh sâu đặt thời gian vài để đạt nhiệt độ -65OC 4, Hoạt hoá mẫu: mẫu lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) hoạt hoá cách làm tan nhanh tới mức (thơng thường đưa vào tủ ấm 37 OC 40-60 giây) Như vậy, theo cách đạt khả sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản c Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản gelatin silicagel Bảo quản xạ khuẩn: Xạ khuẩn mang đặc tính vi khuẩn nấm sợi (có sợi bào tử) cần có phương pháp bảo quản thích hợp Thơng thường xạ khuẩn bảo quản theo cách thông thường cấy truyền, đông khô lạnh sâu với vi khuẩn Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà chúng tơi trình bày đây, phương pháp bảo quản đất Các bước tiến hành bảo quản đất: 1, Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô 150 OC để làm chết vi sinh vật có bào tử trứng giun có Đất sau trùng nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh Đất sau nghiền đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút trùng 60 phút Trước tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm khuẩn đất cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn giữ 24 O C, 28 OC 37 OC, kiểm tra sau 2-4 ngày 2, Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn Nước cất vô trùng dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng Lấy ml dịch huyền phù cho vào ống nghiệm để khô nhiệt độ phòng (24OC) thời gian tháng Đập nhẹ vào thành ống cho hạt tách bảo quản mẫu 4OC 3, Hoạt hoá mẫu đơn giản cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch dịch thể) để nhiệt độ thích hợp 5.2 Bảo quản vi tảo: Vi tảo thông thường bảo quản theo phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu đông khô Các phương pháp trình bày chi tiết phần vi khuẩn Một số điểm cần ý bảo quản vi tảo chỗ: Nên dùng tế bào già pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết tốt phương pháp đông khô 5.3 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi: a Phương pháp cấy truyền: Phương pháp thường ứng dụng với sợi nấm có bào tử Các chủng nấm sợi ni mơi trường thạch thích hợp sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau q trình hình thành bào tử, ống giống bảo quản theo cách khác nhau: - Các ống thạch để tủ lạnh (4-7 OC) Bảo quản thạch lớp dầu: Các ống thạch bảo quản lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối 0.83- 0.89 khử trùng nhiệt độ 121 OC 15 phút Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng cm Nhiệt độ bảo quản 15-20 OC - b Bảo quản nước, nấm sợi nuôi môi trường thạch đĩa Sau sợi phát triển cực đại cắt thành miếng nhỏ kích thước khoảng mm2 cho vào lọ nước trùng Bảo quản nhiệt độ phịng Bảo quản nấm sợi có bào tử silicagel: Chuẩn bị: 1, Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) trùng nhiệt độ 170 OC 2, Silicagel: Loại suốt, khơng có màu, kích thước số lượng hạt silicagel đưa vào khơng q 1/3 thể tích lọ, trùng nhiệt độ 170 °C 3, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) 4, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel Chú ý silicagel hút nước sinh nhiệt việc đưa dịch bào tử vào phải thực chậu nước đá Lượng dịch bào tử đưa vào khơng vượt q 1/3 thể tích hạt silicagel lọ Sau dùng tay lắc đảm bảo hạt silicagel dính dịch bào tử nấm sợi Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp 3, Lọ silicagel đậy nắp cẩn thận khơng vặn chặt (nới 1,5 vịng) sau giữ bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC tuần Vặn chặt nút quấn giấy parafil giữ 4OC Kiểm tra độ sống sót sau bảo quản: Mẫu silicagel °C, dùng que cấy vô trùng lấy hạt silicagel để mặt thạch mơi trường mầm thóc (Maltagar), lắc cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường Để nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp c Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đơng khơ (freez-drying): Chuẩn bị: 1, Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170OC 2, Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 - 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết mã số chủng, ngày bảo quản, mơi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút bơng hay giấy bạc 3, Giữ -80°C trước tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, nhiệt độ đạt -40 OC, đưa mẫu vào tủ đông khô Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55 OC, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5OC, để qua đêm 4, Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25 °C, đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không không tắt DuraDry 5, Tắt Dura-Stop, nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC Chú ý: Trong trường hợp dùng Dura-Dry thực sau: - Tiến hành bước 1,2,3,4 Mẫu để tiền đông khô -80°C Bật máy Dura-Dry, đạt nhiệt độ -60 oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC Kiểm tra độ sống sót sau đơng khơ: 1, Mở ống đơng khơ cách đốt nóng đầu hàn đèn cồn làm lạnh đột ngột cồn đốt 2, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan mẫu đơng khơ Hút tồn dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất Trộn nhỏ vào vị trí khác (mỗi vị trí giọt) mơi trường thạch đĩa thích hợp nghiêng cho dịch chảy dọc theo hướng hình vẽ: 3, Sau đậy nắp đĩa, bao quanh parafil để nhiệt độ thích hợp 4, Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc Khá: 50 – 100 khuẩn lạc Trung bình: 10-50 khuẩn lạc Kém: < 10 khuẩn lạc Không mọc Bảo quản thực với mẫu từ trở lên Tuy nhiên, có số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan đánh sau: Nếu khuẩn lạc mọc khắp bề mặt đĩa tốt Mẻ đông khô thành cơng số khuẩn lạc mọc chiếm nửa bề mặt môi trường đĩa petri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc mức phải làm tăng mật độ bào tử trước đông khô thay đổi môi trường sinh bào tử, chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi d Bảo quản nấm sợi phương pháp đông khô trực tiếp: Phương pháp đông khô trực tiếp thực tương tự phương pháp đơng khơ trình bày thực sau: Chuẩn bị: 1, Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170oC 2, Mơi trường L-drying chuẩn có thành phần sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml Monosodium glutamat: g Adonitol: 1.5 g (Khử trùng 115oC/20 phút) 3, Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường ni cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) 2, Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng, dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, mơi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút bơng hay giấy bạc 3, Đồng thời bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75 oC, nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không nối ampoule mẫu với tube manifold sau lại mở ra, để đảm bảo độ chân khơng cần thiết làm đông khô phải đưa mẫu vào tín hiệu đèn thị cho phép) Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành q trình làm khơ 4, Hàn kín ampoule mẫu: Khi máy Dura-Dry chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, khoá van cho ampoule mẫu tiến hành hàn với mẫu vị trí ống bị thắt Dùng lửa gas để đốt nóng phần ống thắt cho phía xoay cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống Sau dùng lửa gas để cắt rời phần (nối với manifold) phần chứa mẫu Hết đợt lại khoá van ampoule mẫu hàn Kiểm tra chất lượng sau bảo quản: - Để kiểm tra độ sống sót mẫu nấm sợi bảo quản, thực theo cách mô tả phần đông khô - Kiểm tra độ chủng: mẫu cấy môi trường thích hợp quan sát hình thái đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả tạp nhiễm đặc tính sinh học - Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: mẫu sau đông khô trực tiếp giữ 37 oC tuần Độ sống sót mẫu bảo quản giảm tuần 37oC tương đương với bảo quản 10 năm 4oC e Bảo quản nấm sợi phương pháp lạnh sâu -80 oC nitơ lỏng (-196 oC): Chuẩn bị: 1, Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml ống nghiệm) khử trùng 121 oC 15 phút Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sonic cleaner, khử trùng 170 oC 2, Chuẩn bị mẫu nấm sợi mơi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn Cách tiến hành: 1, Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol trùng vào ống nhựa đựng mẫu Sau dùng dao vơ trùng cắt lấy miếng nhỏ môi trường chứa sợi bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút bao băng parafil sau dán nhãn 2, Mẫu trước tiên phải để 5oC (tạo điều kiện cho glycerol vào tế bào), sau làm lạnh sâu tử 25 oC xuống -55oC với tốc độ -1oC/phút Trong trường hợp thiết bị làm lạnh để -20 oC giờ, sau chuyển sang -80oC hay nitơ lỏng (-196oC) Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết nấm sợi sinh bào tử tế bào có vách ngăn Nhưng phương pháp tỏ khơng thích hợp với nấm sợi khơng sinh bào tử khơng có vách ngăn Trong trường hợp cần nuôi cấy nấm sợi mơi trường thích hợp để tạo bào tử Nếu khơng khắc phục phải tiến hành ni môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối giữ glycerol 10% Đánh giá khả sống mẫu bảo quản: 1, Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80oC nitơ lỏng -196oC) bể ổn nhiệt 37oC phút 2, Dùng que cấy lấy miếng môi trường thạch đặt vào vị trí khác mơi trường thạch đĩa thích hợp Để nhiệt độ thích hợp xem khả mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày) Chú ý lấy mẫu cần lấy sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa Một số điều ý bảo quản nấm sợi: - Ảnh hưởng ánh sáng với trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thành cơng phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử Ánh sáng tác nhân quan trọng trình hình thành bào tử nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích q trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc kích thước khuẩn lạc - Thành phần mơi trường: Nói chung mơi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thường cho lượng bào tử lớn - Tránh nhiễm tạp mạt (mite), chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại Đầu tiên chúng ăn chủng giống làm hỏng, sau gây tạp nhiễm mang bào tử vi khuẩn thể từ ống sang ống khác Vì lý mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường chủng giống phải bảo quản nơi sạch, nhiệt độ 4-8oC 5.4 Phương pháp bảo quản nấm men: Tương tự nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men Chúng đề cập đến phương pháp thông dụng sử dụng sưu tập nấm men lớn giới a Phương pháp cấy truyền: Cấy truyền phương pháp đơn giản, nhanh rẻ tiền thông dụng nhất, nhiên hạn chế phương pháp dễ tạp nhiễm thay đổi đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền bất lợi bảo quản theo phương pháp Cấy truyền môi trường dịch thể: - Cách tiến hành đơn giản chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường môi trường YM Yeast extract – Maltose) lọ McCartney khử trùng nhiệt độ 121 oC 15 phút Thường làm lọ cho chủng bảo quản - Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản đưa vào môi trường thao tác vô trùng giữ 25oC 72 Phải kiểm tra phát triển chủng bảo quản - Sau mẫu giữ 4oC - Thông thường theo cách thời gian bảo quản chủng thường thay đổi từ 2- tháng Cấy truyền môi trường thạch: Cấy truyền môi trường thạch tương tự môi trường dịch thể môi trường bổ sung thạch (1.6%) Giống sau cấy giữ 72 nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau để 48oC Theo phương pháp giống có thời gian sống lâu phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống bảo quản từ 3-6 tháng Thời gian bảo quản kéo dài từ 2-3 năm ống giống bảo quản dầu parafil trùng đổ lên môi trường thạch cho tạo lớp dày khoảng 1cm b Phương pháp bảo quản lạnh sâu đông khô (xem phần phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn) ... hiện, có khơng lồi vi sinh vật Virus dạng đặc biệt chưa có cấu trúc thể chưa kể đến số 200 000 lồi vi sinh vật nói Số virus đặt tên khoảng 4000 loài Poliovirus Virus cúm gà H5N1 Virus HIV/AIDS Trong... thuyết tự sinh (Pasteur) Vi khuẩn lao chụp qua kính hiển Elie Metchnikoff (184 5vi 1916) Alexander Fleming (1881-1955) Nấm Penicillium sản sinh penicillin Những đặc điểm chung Vi Sinh Vật -Vi sinh. .. thuộc giới sinh vật nào? Vi sinh vật khơng phải nhóm phân loại sinh giới mà bao gồm tất sinh vật có kích thước hiển vi, khơng thấy rõ mắt thường, phải sử dụng kính hiển vi thường kính hiển vi điện