Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Khoa Chăn Nuôi – Thú Y Mơn: Dược Phân Tích XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN TRONG CAFÉ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN GVHD: Sv thực hiện: mssv lớp Mục Lục I Đặt vấn đề: Café thức uống quen thuộc với người, phổ biến toàn giới Café sử dụng lần đầu vào kỉ 9, khám phá từ vùng cao nguyên Ethiopia Và phổ biến Việt Nam gần 100 năm Ở Việt Nam nơi từ lề đường đến quán cà phê sang trọng ta thấy ly cà phê người nhâm nhi thưởng thức Không giống loại đồ uống khác, chức cà phê nước giải khát nhiều người dùng với mục đích tạo cảm giác hưng phấn Vậy “cảm giác hưng phấn” mà cà phê mang lại có từ đâu? Câu trả lời nằm thành phần hạt cà phê, vào năm 1820 nhà khoa học người Đức Friedlieb Ferdinand Runge tìm chất có café cách đun hạt cà phê rang lên thu lại nước sinh Chất tạo vị đắng cho cà phê Có lẽ nói đến số bạn biết chất Đó cafein Cafein chất kích thích tìm thấy số loại hạt, trái cây,… nhiên nguồn cung cấp cafein chủ yếu từ cà phê loại trà Cung cấp lượng cafein vừa đủ cho thể có nhiều tác dụng hữu hiệu Ngồi cafein chất có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương làm cho tỉnh táo, kích thích khả làm việc, đặc biệt làm việc trí óc, tăng cường hoạt động Vậy cafein xác định nào, thuyết trình nhóm hơm xin đưa phương pháp “XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN” Tiêu chuẩn qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để xác định hàm lượng cafein của: cà phê nhân; cà phê rang; cà phê hịa tan, loại thơng thường loại tách cafein; sản phẩm cà phê hịa tan hỗn hợp (ví dụ: hỗn hợp cà phê/chicory (rễ rau diếp xoăn) đồ uống từ cà phê kiểu capuccino) II Đối tượng phương pháp nghiên cứu:  Đối tượng: Caffein chiết xuất từ café sản phẩm café: cà phê nhân, cà phê, bột có cà phê, cà phê hịa tan, hỗn hợp hịa tan…  Phương pháp nghiên cứu: • Dấu hiệu nhận biết cafein: + Tính chất lý hóa caffeine: Cafein (C8 H10 N4 O2) có cơng thức cấu tạo: Caffein dạng tinh thể, không màu, không mùi, vị đắng Khối lượng mol: 197.19 g/mol Nhiệt độ nóng chảy 2380C Tan nhiều nước nóng chloroform tan Phần rượu Cafein có vị đắng tạo hiệu ứng sinh lý dễ nhận biết Chúng sử dụng nhiều công nghiệp sản xuất đồ uống Cafein có khả tồn lâu máu bị thăng hoa 178oc nên tổn thất nhiều sấy • Ảnh hưởng cafein người: Cafein chuyển hóa gan hệ thống enzyme cytochrome P450 oxydase thành chất có tác dung riêng biệt đới với thể paraxanthine, theobromin theophiline Paraxanthine( 84%) có tác dụng tăng cường tiêu hóa chất béo dẫn đến tăng hàm lượng glycerol axit béo tự tromg huyết tương Theobromin ( 12% ) làm dãn mạch máu tăng lượng nước tiểu Theobromin alcoloid có hạt cacao Theophylline ( 4% ) có tác dụng làm dãn trơn phế quản, theophiline thường dùng bệnh hen suyễn với liều lượng lớn nhiều so với lượng theophiline thu từ chuyển hóa cafein Các chất chuyển hóa và tiết qua đường nước tiểu  Thiết • bị, dung cụ hóa chất: Thiết bị dụng cụ: Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: + + Cân phân tích, có khả cân xác đến ± 0,1 mg Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 µm, để lọc pha động dịch chiết mẫu pha loãng + Máy sắc ký lỏng hiệu nâng cao, trang bị để thực rửa giải đẳng dịng, có detector UV cài đặt 272 nm (270 nm đến 280 nm) detector có lọc (254 nm) có hệ thống thu nhận/tích phân liệu Việc sử dụng khử khí tùy chọn + Cột sắc ký dùng cho HPLC, dài tối thiểu 125 mm, nhồi vật liệu C18, tốt hạt hình cầu có cỡ µm, hiệu tách 000 đĩa lý thuyết Số đĩa lý thuyết cột, Nth tính cách xác định diện tích pic sau bơm dung dịch chuẩn cafein, Công thức (1): N th =  tr    × 5,54 b Trong đó: Tr thời gian lưu pic, tính giây (s); B chiều rộng pic, nửa chiều cao pic, tính giây (s) (1) Cột sắc ký + Máy khuất từ, có phận gia nhiệt nồi cách thủy + Bể siêu âm + Xiranh microlit + Máy xay cà phê, phù hợp để xay nhân cà phê rang + Máy xay với bánh xe có răng, có túi làm lạnh, máy nghiền phân tích, có lưỡi dao túi làm lạnh dụng cụ phù hợp khác để xay nhân cà phê nhân + Sàng, cỡ lỗ danh định 630 µm, phù hợp với yêu cầu TCVN 2230 (ISO 565), dãy R 20 + Bình định mức vạch, dung tích lít 250 ml, phù hợp với loại A TCVN 7153 (ISO 1042) + Pipet, dung tích 50 ml ml, phù hợp với loại A TCVN 7151 (ISO 648) • Hóa chất : + Thuốc thử: Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước phù hợp với yêu cầu loại TCVN 4851 (ISO 3696) trừ có quy định khác + Metanol, loại dùng cho HPLC + Magie oxit (mgo), loại nặng, có chất lượng cao CHÚ THÍCH: Việc sử dụng mgo quan trọng tuổi thọ cột phân tích, đặc biệt phân tích cà phê nhân Lượng mgo sử dụng tùy thuộc vào thiết bị dạng sản phẩm cà phê Dữ liệu độ chụm thu quy trình mơ tả tiêu chuẩn Việc xuất pic gây nhiễu sắc đồ hấp thụ khơng Trong trường hợp này, cần kiểm tra mgo sử dụng + Cafein (1,3,7-trimetylxantin; 1,3,7-trimetyl-1H-purin-2,6(3H,7H)-dion; metyltheobrom; C8H10N4O2), dạng khan tinh khiết + Pha động, 24 % phần thể tích metanol nước CHÚ Ý AN TOÀN – Đeo găng tay, kính bảo vệ mắt phân phối thuốc thử buồng hút khói tốt Chuyển 240 ml metanol vào bình định mức vạch lít Thêm nước đến vạch, trộn lọc qua lọc cỡ lỗ 0,45 µm CHÚ THÍCH: Thời gian lưu cafein chỉnh để tối ưu hóa việc tách HPLC cột sử dụng cách thay đổi tỷ lệ metanol với nước + Dung dịch chuẩn cafein  Dung dịch gốc, tương ứng với 200 mg/l Cân (0,200 ± 0,100) g cafein dạng khan vào bình định mức vạch lít Thêm nước ấm đủ đến nửa bình Xoay bình để hịa tan cafein, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm nước đến vạch trộn Dung dịch bền tháng bảo quản +4 oc Bảo quản dung dịch tủ lạnh  Dung dịch chuẩn pha loãng cà phê thông thường, tương ứng với khoảng 40 mg/l Dùng pipet lấy 50 ml dung dịch chuẩn gốc cafein cho vào bình định mức vạch 250 ml Thêm nước đến vạch trộn Chuẩn bị dung dịch chuẩn pha loãng ngày sử dụng  Điều kiện quy trình q trình thực hiện: • Lấy mẫu Phòng thử nghiệm phải nhận mẫu đại diện Mẫu không hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu khơng quy định tiêu chuẩn Các bên có liên quan cần thỏa thuận với vấn đề Bảo quản mẫu thử cho mẫu không bị giảm chất lượng thay đổi thành phần Trong trường hợp bột uống hỗn hợp, cần tối thiểu 50 g sản phẩm (đối với bao gói chia nhỏ: tối thiểu năm bao gói) Chuẩn bị mẫu thử + Cà phê nhân • Dùng máy nghiền để nghiền nhân cà phê nhân cho 50 % phần khối lượng mẫu lọt qua sàng Sau lấy mẫu thử từ tồn cà phê bột trộn kỹ + Cà phê rang Dùng máy xay để xay nhân cà phê rang cho 50 % khối lượng lọt qua sàng Dùng ln cà phê rang xay bao gói bán sẵn mà khơng cần xử lý thêm đồng hóa mẫu + Cà phê hòa tan Đối với cà phê hịa tan khơng cần xay • Đồ uống hỗn hợp Dùng máy xay, đồng hóa bột uống cà phê hỗn hợp trước chiết để tránh bị tách rời  Cách tiến hành + Phép xác định tùy chọn chất khơ cà phê Tính hàm lượng chất khô cà phê từ độ ẩm xác định phần mẫu thử theo: - TCVN 6928 (ISO 6673) cà phê nhân, - TCVN 9721 (ISO 11817) cà phê rang, - TCVN 5567 (ISO 3726) cà phê hòa tan Đối với dạng khác cà phê sản phẩm có nguồn gốc từ cà phê, bên có liên quan cần thỏa thuận phép xác định hàm lượng chất khô + Phần mẫu thử  Cà phê rang cà phê nhân Dùng cân ,cân khoảng g mẫu thử (cà phê nhân, cà phê rang) xác đến miligam chuyển vào bình định mức 250 ml (5.11)  Cà phê hòa tan Dùng cân,cân khoảng 0,5 g mẫu thử (cà phê hịa tan) xác đến miligam chuyển vào bình định mức 250 ml  Đồ uống hỗn hợp Dùng cân ,cân khoảng g mẫu thử (đồ uống hỗn hợp) xác đến miligam chuyển vào bình định mức 250 ml  Chiết cafein Thêm g magie oxit khoảng 200 ml nước vào phần mẫu thử (cà phê: rang, nhân, hỗn hợp,hòa tan) đựng bình định mức Đặt bình vào nồi cách thủy trì điểm sơi chờ dung dịch đạt đến 90 oc Tiếp tục gia nhiệt bình nồi cách thủy 20 min, trộn lượng chứa bình cách khuấy lắc bình Lấy bình khỏi nồi cách thủy, làm nguội đến nhiệt độ phòng vòi nước thêm nước đến vạch Chờ chất rắn lắng xuống Lấy phần dịch lỏng phía lọc qua lọc cỡ lỗ 0,45 µm, loại bỏ vài mililit Dịch lọc dùng để tách HPLC  Tiến hành xác định: Nhồi đầy cột Cột I (Cột kềm) Lớp A Trộn cẩn thận g điatomit ml dung dịch hyđroxit natri dao trộn mềm, đồng (xem thích) Thu bột ướt Cho phần , khoảng mg bột lên cột sắc ký đường kính 21 mm, đầu cột nhồi len thủy tinh Sau lần đưa bột lên cột, dùng đũa thủy tinh có đầu phẳng khít với đường kính cột lèn nhẹ lên để có lớp đồng kết chặt với Có thể dùng miếng bơng len thủy tinh nhỏ để phủ lên mặt lớp A Chú thích – Chất liệu nhồi cột chuẩn bị trước bảo quản vật chứa kín Mỗi cột kiềm cần 5,16 g Lớp B Chuyển hỗn hợp đất diatomit mẫu thử vào cột lên mặt lớp A Làm khơ cốc thí nghiệm lần, với khoảng g đất điatomit cho điatomit vào cột Lèn nhẹ xuống để có lớp đồng phủ miếng len thủy tinh lên mặt lớp B Cột II (Cột axit) Cho lên cột sắc ký đường kính 17 mm, đầu cột nhồi len thủy tinh, g điatomit ml dung dịch axit sunphuric trộn cẩn thận nhồi vào cột mô tả lớp A cột I Dùng miếng len thủy tinh để phủ lên mặt lớp Chú thích – Chất liệu nhồi cột chuẩn bị trước bảo quản vật chứa kín Mỗi cột kiềm cần 6,36 g Chạy sắc ký Dựng cột chồng lên nhau, cho chất chảy từ cột I giọt trực tiếp vào cột II Cho 150 ml đietyl ete chảy qua cột Điều chỉnh van khóa cột cho lượng chất lỏng bề mặt lớp (cột II) Tháo cột I Cho 50 ml đietyl ete chảy qua cột II, dùng phần đietyl ete để rửa miệng cột I cho nốt phần lên cột II Cho chất lỏng chảy hết khỏi cột II Chú thích – Đietyl ete dùng tái sinh cách lắc khuấy sắt (II) sunphat Thổi luồng khơng khí từ đỉnh xuống đáy cột II (thí dụ dùng bóp cao su), khơng cịn đietyl ete nhỏ giọt từ cột luồng khơng khí từ van khố thoang thoảng có mùi đietyl ete (xem cảnh báo sau) Dùng 45 đến 50 ml cloroform để làm chất hấp thụ cột II Thu chất thơi vào bình thể tích 50 ml vạch, dùng cloroform pha lỗng tới vạch khuấy kỹ Tốc độ chảy đietyl ete cloroform điều kiện chảy tự nhiên phải nằm khoảng từ 1,5 ml/phút đến ml/phút Nếu vượt tốc độ phải nghi ngờ có chảy xói tiến hành xác định lại Cảnh báo – Việc cho đietyl ete cloroform phải thực tủ hút thơng gió tốt để đề phịng khả hít phải dung mơi lẫn khả nổ Đo quang phổ 10 Đo dung dịch thử Để tránh sai sót cloroform bay hơi, dùng cuvet silica đo độ hấp thụ dung dịch caphêin cloroform đối chiếu với cloroform máy đo quang phổ dùng bước sóng hấp thụ cực đại (khoảng 276 nm), bước sóng bước sóng 30 nm nhằm kiểm tra độ tinh khuyết caphêin thu Nếu độ hấp thụ cực đại vượt khả đo xác máy sử dụng tiến hành đo lại với phần thử khác dung dịch caphêin pha lỗng cloroform Trong trường hợp tính kết cần ý đến hệ số pha loãng; thừa số thích hợp cơng thức nêu vàcũng phải điều chỉnh cho phù hợp 11 Nếu độ hấp thụ cực đại thấp 0,2 tiến hành lại phần thử khác có khối lượng lớn Chuẩn bị đo dung dịch chuẩn (đối chứng) Chuẩn bị dung dịch caphêin chuẩn theo cách sau: Cân lấy 100 mg ± 20 mg caphein khan tinh khiết, xác tới 0,1 mg Cho vào bình định mức dung tích 000 ml hịa tan cloroform pha loãng đến vạch Dung pipet chuyển 5,0 ml dung dịch vào bình định mức dung tích 50 ml pha loãng đến vạch cloroform Đo độ hấp thụ dung dịch theo mô tả Độ hấp thụ dung dịch chuẩn phải nằm vùng 0,4 Số lần xác định Tiến hành hai phép xác định phần thử riêng rẽ lấy từ mẫu thử Thử trắng Tiến hành thử trắng thuốc thử, sử dụng qui trình mơ tả trên, bỏ qua phần mẫu thử Trước sử dụng thuốc thử tái tinh chế , cần lặp lại thử trắng để kiểm tra độ tinh khiết chúng III Tính tốn kết quả:  Hàm lượng cafein mẫu Tính hàm lượng cafein, wx, biểu thị phần trăm khối lượng, tương đương với gam 100 g cà phê, theo Công thức: Wx = Ax ρ cV × 100 Ax ρ c × 25 = Ac ms Ac ms Trong đó: Ac diện tích pic cafein dung dịch chuẩn cafein xác định HPLC, tính đơn vị diện tích; 12 Ax diện tích pic cafein dung dịch mẫu xác định HPLC, tính đơn vị diện tích; Ms khối lượng phần mẫu thử, tính gam (g); V thể tích dung dịch mẫu chiết được, xác định (V = 0,25 l), tính lít (l); Ρc nồng độ khối lượng dung dịch chuẩn cafein, tính gam lít (g/l) CHÚ THÍCH: Chiều cao pic sử dụng để thay cho diện tích pic Nếu sử dụng nhiều chuẩn hiệu chuẩn dựng đường chuẩn tuyến tính nồng độ chuẩn cafein, để thu độ dốc giá trị chắn Sử dụng đường chuẩn để tính nồng độ cafein mẫu Lấy kết giá trị trung bình hai lần xác định tiến hành điều kiện lặp lại (10.2)  Phép xác định tùy chọn hàm lượng cafein mẫu theo chất khơ Tính hàm lượng cafein, w’x, theo phần trăm khối lượng, tương ứng với số gam 100 g chất khô, Công thức (3): W’x = Ax ρcV × 100 A ρ × 2500 × 100 = x c Ac ms wd Ac ms wd (3) Trong wd hàm lượng chất khô mẫu (gam 100 g), xác định Lấy kết giá trị trung bình hai lần xác định tiến hành điều kiện lặp lại IV Kết bàn luận:  Kết quả: • Độ chụm  Phép thử liên phòng thử nghiệm Các kết chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm để xác định độ chụm phương pháp nêu Phụ lục A Các kết cafein đưa theo loại cà phê Các giới hạn lặp lại giới hạn tái lập TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), tương ứng, tính theo 4.14 TCVN 6910-6:2002 (ISO 5725-6:1994) Để ước tính giới hạn tái lập Horwitz, sử dụng hàm Horwitz Tài liệu viện Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với giá trị nêu 13 Dữ liệu độ chụm đánh giá theo TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) nêu Bảng Bảng – Giá trị trung bình, giới hạn lặp lại giới hạn tái lập Giá trị trung bình Giới hạn lặp lại R Giới hạn tái lậpR % phần khối lượng % phần khối lượng % phần khối lượng Cà phê nhân Cà phê tách cafein (decaf) 0,057 0,004 0,009 Cà phê tách cafein 0,075 0,003 0,006 Cà phê chè (arabica) thông 1,14 0,05 0,15 thường Cà phê vối (robusta) thông 2,18 0,096 0,37 thường Cà phê rang Cà phê tách cafein 0,055 0,007 0,026 Hỗn hợp cà phê thông thường/ 0,642 0,054 0,091 cà phê tách cafein Cà phê thông thường 1,22 0,053 0,176 Bột uống có thành phần cà phê Cà phê kiểu cappucino 0,403 0,024 0,068 Cà phê hòa tan Cà phê tách cafein 0,072 0,004 0,024 Cà phê tách cafein 0,109 0,008 0,030 Cà phê đông khô thông thường 2,51 0,050 0,23 Cà phê kết tụ thông thường 3,19 0,085 0,372 Hỗn hợp cà phê hòa tan Cà phê/chicory 2,45 0,066 0,216 Mẫu/sản phẩm • Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử nghiệm độc lập, đơn lẻ thu sử dụng phương pháp, vật liệu thử, phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % (nghĩa độ lặp lại xác suất 95 %) trường hợp vượt giá trị giới hạn lặp lại, r, nêu Bảng • Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ thu sử dụng phương pháp, tiến hành thử vật liệu giống thử hệt nhau, phòng thử nghiệm 14 khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không % (nghĩa độ tái lập xác suất 95 %) trường hợp vượt giá trị giới hạn tái lập, R, nêu Bảng  Bàn luận: Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin sau:      thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu; phương pháp sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; kết thử nghiệm thu được; kiểm tra độ lặp lại, nêu kết cuối thu được; chi tiết thao tác khác với quy định tiêu chuẩn tùy chọn cố ảnh hưởng đến kết thử nghiệm Tài liệu tham khảo: [1] ISO Guide 30:1992, Term and definition used in connection with reference material [2] TCVN 6910-1:2010 (ISO 5725-1:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2:2010 (ISO 5725-2:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] TCVN 6910-6:2010 (ISO 5725-6:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 6: Sử dụng giá trị độ xác thực tế [5] TCVN 9722 (ISO 20938), Cà phê hòa tan – Xác định độ ẩm – Phương pháp Karl Fischer (Phương pháp chuẩn) 15 [6] Thompson, M Ellison, S.R.L., Wood, R., for the international working party for harmonization of quality assuarance schemes The international harmonized protocol for the proficiency testing of analitycal chemistry laboratories IUPAC technical report Pure appl.Chem 2006, 78, pp 145-196 Available (2007-12-06) at: http://www.iupac.org/pulications/pac/2006/pdf/7801x0145.pdf 2800C 16 ... Vậy cafein xác định nào, thuyết trình nhóm hơm xin đưa phương pháp “XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CAFEIN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) – PHƯƠNG PHÁP CHUẨN” Tiêu chuẩn qui định phương pháp sắc ký lỏng. .. Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2:2010 (ISO 5725-2:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo – Phần 2: Phương pháp xác định. .. đó: Ac diện tích pic cafein dung dịch chuẩn cafein xác định HPLC, tính đơn vị diện tích; 12 Ax diện tích pic cafein dung dịch mẫu xác định HPLC, tính đơn vị diện tích; Ms khối lượng phần mẫu thử,