XÁC ĐỊNH RHODAMINE TRONG MẪU HẠT DƯA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC SỬ DỤNG DETECTOR UV NỘI DUNG MỞ ĐẦU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.MỞ ĐẦU Vấn đề an tồn thực phẩm vệ sinh mơi trường => ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người Sự tồn dư chất độc hại thực phẩm vấn đề đáng lo ngại Khoa học kỹ thuật phát triển, nhiều kỹ thuật phân tích mới, đại áp dụng để kiểm định chất độc thực phẩm Trong chế biến, để tạo màu sắc đẹp, bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp Phẩm màu cơng nghiệp nói chung, Rhodamine B nói riêng độc hại, bị cấm sử dụng thực phẩm khó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận tồn dư lâu ngày gây độc hại đến thể người, đặc biệt gây ung thư Phẩm màu thực phẩm tự nhiên có độ bền hơn, lại đắt phẩm màu công nghiệp => nhiều người lạm dụng phẩm màu công nghiệp chất bị cấm sử dụng thực phẩm Vì việc nghiên cứu xác định hàm lượng Rhodamine B vấn đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng TỔNG QUAN MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B  Công thức cấu tạo - Rhodamine B hợp chất hóa học, thành phần phẩm màu công nghiệp - Công thức phân tử C28H31ClN2O3 - Phân tử khối 479,02g/mol TỔNG QUAN MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B  Tính chất vật lí - Rhodamin B tinh thể màu tối có ánh xanh hay dạng bột màu nâu đỏ - Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 210oC đến 211oC - Rhodamine B thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l) - Dung dịch nước rượu etylic có màu đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ dung dịch loãng Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có λ = 526 517 nm TỔNG QUAN MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B  Tính chất sinh học - Rhodamine B gây độc cấp mãn tính - Qua tiếp xúc, gây dị ứng làm mẩn ngứa da,mắt, - Qua đường hô hấp, gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau ngực - Qua đường tiêu hóa, gây nơn mửa, có hại cho gan thận - Nếu tích tụ dần thể gây nhiều tác hại gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh gây ung thư TỔNG QUAN MỘT VÀI NÉT VỀ RHODAMINE B Ứng dụng - Rhodamine B thường sử dụng nước để xác định tốc độ hướng dòng chảy vận chuyển - Được sử dụng rộng rãi ứng dụng công nghệ sinh học kính hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dịng chảy, quang phổ huỳnh quang - Rhodamine B thử nghiệm để sử dụng vắcxin bệnh dại cho động vật hoang dã - Nó trộn vào thuốc diệt cỏ, sử dụng để tạo màu nhuộm màu công nghiệp sợi, nhuộm màu để xét nghiệm tế bào tính bền màu - Rhodamine B sử dụng sinh học thuốc nhuộm huỳnh quang TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) - Phương pháp tối ưu để xác định Rhodamine B sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đây phương pháp ứng dụng nhiều năm gần Nó áp dụng để tách nhận dạng xác định hàng loạt hợp chất mà số phương pháp khác gặp nhiều khó khăn hợp chất khơng bền với nhiệt, hợp chất có tính chất hố học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm mà phương pháp khác khơng có như: xác định đồng thời nhiều chất, tốn mẫu, thao tác đơn giản,… - Có loại cột tách sử dụng: cột trao đổi ion cột tách pha đảo - Detectơ ghép nối HPLC cho phép phát xuất chất sau rửa giải Ngày có nhiều loại detectơ sử dụng mở rộng khả phát nhiều loại chất phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng người ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD), tách phân tích chất đối tượng phức tạp Cịn thơng dụng người ta dùng detectơ UV-Vis hay detectơ huỳnh quang Dùng detectơ UV-Vis xác định nhiều loại chất, detectơ huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc tương tác hợp chất có mẫu Ngồi cịn dùng số detectơ khác detectơ điot array (DAD), detectơ điện hoá ,… detectơ thường ứng dụng để phân tích chất có phẩm nhuộm TỔNG QUAN  PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) - Nguyên tắc chung trang bị Phương pháp HPLC HPLC kĩ thuật tách chất xảy q trình chất tan chuyển dịch cộ t tách có chứa chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác phụ thuộc vào hệ số phân bố Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiệu tách sắc ký tốt Thành phần pha động thay đổi để đạt lực rửa giải phù hợp Sau chất tan chuyển tới cuối cột tách chuyển tới detectơ để phát Tuỳ thuộc vào chất chất tan mà dùng loại detectơ khác  Phương pháp UV- Vis xác định Rhodamine B - Để xác định Rhodamine B, người ta sử dụng phương pháp UV- Vis Lấy mẫu chất đem hoà tan dung mơi thích hợp, lắc, rung siêu âm chiết lấy dung dịch Đem dung dịch chiết đo máy UV- Vis, dựa vào cực đại hấp thụ ta định tính định lượng Rhodamine B 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng mục tiêu nghiên cứu| - Phân tích Rhodamine B có thực phẩm, cụ thể hạt dưa - Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector hấp thụ phân tử UV-Vis lựa chọn Từ xây dựng quy trình phân tích để áp dụng xác định Rhodamine B thực phẩm KẾT QUẢ BẢNG KẾT QUẢ HÌNH 3.KẾT QUẢ • Căn vào bảng số liệu sắc đồ peak sắc ký nhận thấy sử dụng dung môi chiết etanol- nước thu hàm lượng Rhodamine B lớn Vì vậy, lựa chọn dung môi chiết etanol - nước (hỗn hợp b) để chiết Rhodamine B mẫu hạt dưa • Với dung mơi chiết lựa chọn, tiến hành khảo sát tỷ lệ etanol nước thích hợp • Tiến hành xử lý mẫu: cân 0,5 gam mẫu hạt dưa, cho vào bình 25 ml, thêm 10 ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ khác nhau, siêu âm 60 phút, lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45μm, pha loãng lần lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC • Kết thu được trình bày 3.KẾT QUẢ Với số liệu khảo sát mẫu hạt dưa tỷ lệ dung môi chiết etanol- nước khác nhau, nhận thấy dung mơi chiết thích hợp 60% nước- 40% etanol (hình 3.29- c) peak thu gọn diện tích lớn BẢNG 3.KẾT QUẢ HÌNH 3.KẾT QUẢ Phân tích mẫu thực từ dung dịch chiết Quy trình chiết sau: mẫu hạt dưa cân xác 0,5g cân phân tích chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 10ml hỗn hợp etanol nước theo tỷ lệ 40:60, lắc đều, siêu âm 60 phút Sau chiết, lấy 2,0ml dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 10ml định mức pha động, lắc lọc qua giấy lọc thường, lọc qua màng lọc Whatman 0,45µm, lấy 2ml dịch chiết bơm vào cột sắc ký HPLC với điều kiện sắc ký chọn Đối với chất mẫu phân tích thêm chuẩn lượng chất chuẩn thêm vào từ đầu trước chiết Các trình chiết tiến hành điều kiện tương tự mẫu phân tích khơng thêm 3.KẾT QUẢ • Xác định hàm lượng Rhodamine B mẫu hạt dưa theo phương pháp thêm tiêu chuẩn, thơng qua cách lập phương trình hồi quy đường thêm chuẩn dạng y= a+ bx • Ta có: Trong đó: • Cx: nồng độ chất phân tích có dung dịch bơm vào cột tách • a, b hệ số phương trình hồi qui • Sa, Sb: sai số hệ số phương trình hồi qui • Sx: sai số nồng độ xác định theo phương pháp thêm chuẩn 3.KẾT QUẢ HÌNH 3.KẾT QUẢ Ta có: Cx = a/b = 0,465 (ppm) Theo cơng thức tính hàm lượng chất phân tích 500mg mẫu ban đầu, tính được: mx= 0,02325(mg) Hay khối lượng Rhodamine B có gam mẫu hạt dưa 0,0465 mg/g Hiệu suất thu hồi tính theo cơng thức sau: Trong đó: a,b hệ số hồi qui phương trình đường chuẩn F hệ số pha lỗng m khối lượng cân mẫu phân tích Cx lượng chất tính từ đường chuẩn hồi qui C0 lượng chất thêm chuẩn ban đầu Dựa vào cơng thức tính hiệu suất thu hồi chất phân tích H= 0,465/0,5 x 100=93% 3.KẾT QUẢ Nhận xét: Với kết phân tích trên, nhận thấy rằng, đối tượng mẫu hạt dưa, hàm lượng Rhodamine B nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp, hiệu suất thu hồi tương đối tốt (93%) Như với đối tượng phân tích mẫu hạt dưa dung mơi chiết phương pháp tối ưu lựa chọn phù hợp cho hiệu phân tích tốt Kết phân tích cho thấy mẫu hạt dưa phân tích có chứa Rhodamine B 0,0465mg/g, chất bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm 4.KẾT LUẬN Trên sở nghiên cứu điều kiện thực nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng detector UV-Vis để xác định hàm lượng Rhodamine B thực phẩm đánh giá phương pháp phân tích: Khoảng tuyến tính Rhodamine B: 0,01- 2ppm •Giới hạn phát hiện: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 1ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 15ppb •Giới hạn định lượng: + Theo phương pháp phân tích trực tiếp 3,33ppb + Theo phương pháp đường chuẩn 50,2ppb Khảo sát mẫu thực chọn quy trình phân tích khảo sát dung môi chiết tách loại thực phẩm 60% nước- 40% etanol Trên sở quy trình tối ưu tìm tiến hành xác định hàm lượng Rhodamine B mẫu hạt dưa với độ lặp lại tốt 4.KẾT LUẬN  Kết xác định mẫu thực cho thấy: mẫu thực phẩm lưu hành thị trường lấy mẫu, hàm lượng Rhodamine B xác định nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Chứng tỏ bị cấm sử dụng chế biến bảo quản thực phẩm, Rhodamine B sử dụng phổ biến số loại thực phẩm kiểm tra  Từ kết thu được, nhận thấy phương pháp HPLC sử dụng detectơ UV-Vis có độ nhạy cao, thích hợp cho việc xác định hàm lượng Rhodamine B có loại thực phẩm với cách xử lý mẫu thích hợp 5.TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Thái Bình (18/ 11/2009), “Rhodamine B có vị thuốc đơng y chất gây ung thư”, báo Sức khoẻ đời sống 2.Nguyễn Thạc Cát, Từ Vọng Nghi, Đào Hữu Vinh (1980) “Cơ sở ký thuyết hố học phân tích”, nhà xuất Đại học trung học chuyên nghiệp, Hà Nội 3.Nguyễn Xuân Dũng, Từ Vọng Nghi, Phạm Luận (1986) “Các phương pháp tách- Sắc ký lỏng cao áp”, Đại học Tổng hợp Amsterdam, Hà Nội 4.Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003), “Hoá học phân tích- Phần II- Các phương pháp phân tích cơng cụ”, ĐHQG Hà Nội 5.Phạm Luận (1999), “Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao”, Đại học Tổng hợp Hà Nội 6.Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Đào Tố Uyên, Phạm Văn Hoan (2009), “Xác định Sudan I số loại gia vị kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)”, tạp chí y học thực hành, số (641+642), trang 58-60 7.Đỗ Văn Quân (2007), “Xác định hợp chất Sudan phương pháp sắc ký lỏng có độ phân giải cao” Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội 5.TÀI LIỆU THAM KHẢO TCVN 8670-2011 việc xác định Rhodamine B HPLC http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodamine_B (7/2011) http://vietbao.vn/Suc-khoe/Phat-hien-chat-doc-Rhodamine-B-tronggiavi/70077015/248/ (9/2/2007) http://wordpress.com/2010/03/02/vấn-đề-an-toàn-thực-phẩm-tạiviệtnam-nổi-cộm-trở-lại-với-vụ-bột-gia-vị-nhiễm-Rhodamine B/Tonelli http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Tools/Phuongphap/SKLM.htm (6/2011) http://www.leo.com (9/2008) “Using LC- TOFMS for screening of Sudan Dyes in food” http://duocphamvn.com/baiviet/6159-28-TCN198-2004-Histamintrongsan-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-luong-bang-sac.thuoc http://3c.com.vn/Story/vn/tintucvasukien/diemtin/2007/2/8174.htmlc (6/2011) “khâu liên quan đến trình sản xuất lương thực thực phẩm” Cảm ơn cô bạn lắng nghe ! ... độ lặp lại tốt 4.KẾT LUẬN  Kết xác định mẫu thực cho thấy: mẫu thực phẩm lưu hành thị trường lấy mẫu, hàm lượng Rhodamine B xác định nằm giới hạn phát giới hạn định lượng phương pháp Chứng tỏ... detector hấp thụ phân tử UV-Vis lựa chọn Từ xây dựng quy trình phân tích để áp dụng xác định Rhodamine B thực phẩm 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp nghiên cứu - Đối tượng phân tích... nghiệm, nhằm ứng dụng kỹ thuật phân tích HPLC sử dụng detector UV-Vis để xác định hàm lượng Rhodamine B thực phẩm đánh giá phương pháp phân tích: Khoảng tuyến tính Rhodamine B: 0,01- 2ppm •Giới