Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Khoa Chăn Ni – Thú Y  DƯỢC PHÂN TÍCH Đề tài: “Định lượng Quercetin phương pháp HPLC” GVHD: SVTH: Thành phố Hồ Chí Minh ĐẶT VẤN ĐỀ .3 Phần TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Quercetin .4 1.1.1 Công thức Quercetin 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.3 Nguồn gốc cách điều chế 1.1.4 Tác dụng chế tác dụng 1.1.5 Chỉ định 1.1.6 Một số chế phẩm 1.2 Một số phương pháp định lượng Quercetin .6 1.2.1 Định lượng phương pháp HPLC 1.2.2 Định lượng phương pháp Von ampe 1.3 Tổng quan HPLC 1.3.1 Nguyên tắc trình sắc ký 1.3.2 Cơ sở lý thuyết trình sắc ký 1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống máy HPLC 1.3.4 Các thơng số đặc trưng q trình sắc ký 10 Phần THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18 2.1 Nguyên liệu phương pháp thực nghiệm 18 2.2 Kết thực nghiệm nhận xét 20 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 3.1 Kết luận .41 3.2 Đề xuất 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật Flavonoid khám phá nhà sinh hóa tiếng kỷ 20: Albert Szent – Gyorgyi (1893-1896) Ơng nhận thấy đặc tính Flavonoid khả chống bệnh Scurvy Flavonoid Ngày nay, tác dụng sinh học Flavonoid tìm hiểu đưa vào sử dụng để phịng chữa bệnh cho người cách rộng rãi Trong số khơng thể khơng nhắc đến Quercerin Quercetin Flavonoid, nghiên cứu có khả làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch, ngăn chặn phát triển bệnh ung thư, chống dị ứng giảm đau cho bệnh gout…Hiện nay, Quercetin sử dụng rộng rãi chủ yếu dạng thực phẩm chức có mặt thị trường dược phẩm với dạng bào chế khác nhau: viên nén, viên nang, dạng dung dịch,…Và có số sở nghiên cứu sản xuất nguyên liệu Quercetin Liên hiệp khoa học sản xuất công nghệ mới, sản xuất thực phẩm chức chứa Quercetin công ty TNHH Đại Y,… Việc xác định hàm lượng Quercetin nguyên liệu thực phẩm chức cần thiết Tuy nhiên, nước ta chưa có phương pháp định lượng Quercetin thức tiêu chuẩn ngành quốc gia Để giúp số sở nghiên cứu sản xuất nguyên liệu Quercetin, góp phần xây dựng tiêu chuẩn Quercetin, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu “Định lượng Quercetin phương pháp HPLC” với mục tiêu sau: Xậy dựng qui trình kỹ thuật định lượng Quercetin nguyên liệu phương pháp HPLC Đánh giá phương pháp xây dựng theo tiêu phương pháp đinh lượng Phần TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Quercetin Quercetin flavonoid thuộc nhóm flavonol Nhóm flavonol có màu vàng nhạt đến vàng Flavonoid chất màu thực vật có cấu tạo khung kiểu C – C3 - C6 hay nói cách khác khung gồm vòng benzene A B nối với qua mạch carbon Phần lớn flavonoid dẫn chất có gốc phenyl chất chúng polyphenol có tính acid 1.1.1 Công thức Quercetin Tên khoa học: 3, 3’ ,4’ ,5, – penta hydroxy flavon Tên khác: 3’, 4’, 5, – tetra hydro flavon – 3- ol 1.1.2 Tính chất lý hóa Bột mịn, màu vàng chói Tan nước dung môi hữu phân cực Nhiệt độ nóng chảy 3140C 1.1.3 Nguồn gốc cách điều chế + Nguồn gốc: Tự nhiên: Quercetin có nhiều táo, hành tây, tỏi, rượu vang đỏ, cải hoa, súp lơ, cải bắp,… Bán tổng hợp: Quercetin bán tổng hợp cách thủy phân Rutin + Cách điều chế Quercetin bán tổng hợp: Khoa hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội tiến hành sau: Rutin tổng hợp cách đun hồi lưu với dung dịch HCl 5% vòng giờ, cho Quercetin kết tủa màu vàng dạng hydrat 0C Kết tinh lại Quercetin hỗn hợp ethanol – nước Viên công nghệ hóa học, viện KH & CN Việt Nam tiến hành sau: Rutin thủy phân dung dịch H2SO4 2% nhiệt độ sôi dung dịch 90 phút sử dụng máy khuấy từ có gia nhiệt, đệm lọc, phần lọc rửa nhiều lần nước lạnh thu Quercetin thô kết tinh ethanol nhiều lần ta có Quercetin tinh khiết 1.1.4 Tác dụng chế tác dụng Quercetin có khả làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch, ngăn chặn phát triển bệnh ung thư, chống dị ứng giảm đau gout, giảm nguy biến chứng bệnh nhân đái tháo đường…Bên cạnh đó, Quercetin cịn có phổ kháng rộng với vi khuẩn nấm, kháng mạnh với vi nấm vi khuẩn Gram+ Cơ chế tác dụng: Quercetin tác động lên peroxyl radicals ức chế hình thành hydroperoxide, đồng thời tác động lên alkoxyl radicals ngăn chặn oxy hóa LDL – Cholesterol nên làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch Quercetin có tác dụng chống dị ứng ngăn cản phóng thích histamin Quercetin làm giảm bớt sản xuất “mutant p53 protein” ngăn chặn hoạt động enzyme Tyrosine kinase nên làm chậm phát triển bướu ung thư Quercetin có khả chống bệnh gout ức chế xanthin oxidase Quercetin ức chế aldose reductase mạnh Enzyme có nhiệm vụ chuyển glucose máu thành sorbitol – hợp chất liên quan chặt chẽ với tiến triển biến chứng đái tháo đường (đục thủy tinh thể, tổn thương thần kinh, bệnh võng mạc đái tháo đường) 1.1.5 Chỉ định Dùng để phòng điều trị bệnh dị ứng, ung thư (ung thư tuyến tiền liệt, vú, dày, ruột kết), tim mạch bệnh gout, biến chứng bệnh đái tháo đường 1.1.6 Một số chế phẩm Các dạng bào chế Quercetin - Dạng viên nén 500mg 1000mg Quercetin - Dạng viên nang 300mg 500mg Quercetin - Dạng dung dịch chứa 134mg Quercetin Hiện thị trường dược phẩm Việt Nam biết có cơng ty TNHH Dược phẩm Đại Y sản xuất sản phẩm Cao Bạch Quả chứa Quercetin lại hầu hết nhập Ginkogink, Tanakan, Quercetin $ Bromelain, Ginkgo flavoglycosides,… 1.2 Một số phương pháp định lượng Quercetin 1.2.1 Định lượng Quercetin phương pháp HPLC 1.2.1.1 Chương trình - Cột C18 (4,6 mm x 250 mm, µm) - Pha động: Methanol:nước:acid phosphoric (100:100:1) - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút - Detector UV bước sóng 270 nm - Thể tích tiêm: 20µl 1.2.1.2 Chương trình - Cột C8 (125 mm x 4mm, µm) - Pha động: + Dung mơi A: acid phosphoric R 0,3g/l pH 2,0 + Dung môi B: Methanol Tỉ lệ pha động bảng 1: Thời gian (phút) -1 – 20 20 -21 Dung môi A 60 60 -> 45 45 -> Dung môi B 40 40 -> 55 55 -> 100 21 - 25 100 Bảng Tỉ lệ pha động - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Detector quang phổ 370 nm - Thể tích tiêm 10µl - Nhiệt độ: 25oC 1.2.1.3 Chương trình - Cột Lichrosorb RP 18 (10µm, 250 mm x mm) - Pha động: Hỗn hợp dung môi A:B (58:42) + Dung môi A: dung dịch acid phosphoric 0,5% + Dung môi B: methanol - Tốc độ dòng: 2,0 ml/phút - Detector UV bước sóng 370 nm - Thể tích tiêm: 20µl 1.2.1.4 Chương trình - Máy sắc ký lỏng hiệu cao HITACHI –LC – 1210 - Cột C 18, 300 mm x 3,9mm - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Thể tích tiêm: 50µl - Pha động: methanol:nước:acetonitrile (80:19:1) - Detector UV bước sóng 362 nm - Nhiệt độ: 370C ± 10C 1.2.2 Định lượng Quercetin phương pháp Von ampe Quercetin cơng thức cấu tạo có nhóm phenol nên có khả oxi hóa điện cực carbon, định lượng theo sóng anod kỹ thuật von ampe, dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH 4,0 Nhận xét: Qua thực nghiệm nhận thấy phương pháp 1.2.1.3 1.2.1.4 nêu cho peak không đẹp, có hệ số bất đối xứng AF lớn, cịn phương pháp Von ampe điều kiện trang thiết bị phịng thí nghiệm khơng cho phép nên chúng tơi khơng thể tiến hành định lượng Vì vậy, với trang thiết bị sẵn có phịng thí nghiệm đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng Quercetin phương pháp HPLC cho hình dạng peak cân đối thời gian lưu ngắn, ứng dụng cơng tác kiểm nghiệm – góp phần quản lý chất lượng sản phẩm chứa Quercetin 1.3 Tổng quan HPLC 1.3.1 Nguyên tắc trình sắc ký Pha tĩnh nhồi vào cột tách theo kỹ thuật định Pha tĩnh yếu tố định chất trình sắc ký Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có sắc ký phân bố Nếu pha tĩnh chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột cho pha động liên tục qua thực trình sắc ký 1.3.2 Cơ sở lý thuyết trình sắc ký Quá trình phân tách kỹ thuật HPLC trình vận chuyển phân bố chất tan hai pha khác Khi pha động di chuyển với tốc độ định qua cột sắc ký đẩy chất tan bị pha tĩnh lưu giữ khỏi cột Tùy theo chất pha tĩnh, chất tan pha động mà trình rửa giải tách chất khỏi cột sắc ký Khi khỏi cột chất phát triển ghi dạng peak Tín hiệu trình sắc ký cho ta sắc ký đồ Một sắc ký đồ có hay nhiều peak phụ thuộc vào thành phần mẫu Nếu trình tách sắc ký tốt hỗn hợp mẫu có chất có nhiêu peak riêng biệt sắc ký đồ 1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống máy HPLC Hệ thống HPLC đơn giản đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm phận sau: 1.3.3.1 Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột sách Bơm phải điều chỉnh áp suất (thường từ 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với tốc độ dòng ổn định, phù hợp với q trình sắc ký Có loại bơm: - Một bơm áp suất định, áp dụng - Hai bơm tốc độ dòng định, loại áp dụng cho phân tách HPLC thơng thường 1.3.3.2 Bình chứa dung mơi hệ thống xử lý dung mơi Bình chứa dung môi thường thủy tinh thép không gỉ Dung môi chạy sắc ký lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) đuổi khí hịa tan Trong phương pháp thơng thường cần bình, phương pháp gradient cần phải có nhiều bình 1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tách vào cột Có thể tiêm mẫu tay hay tiêm mẫu hệ tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm (hệ tiêm mẫu tự động) Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng tiêm sau loại tạp qua màng lọc 0,45µm, cịn mẫu rắn cần hịa tan dung mơi thích hợp 1.3.3.4 Cột sắc ký lỏng HPLC Cột phận coi quan trọng hệ thống sắc ký Quá trình tách chất diễn cột Cột chế tạo thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu áp suất cao đến vài trăm bar Trong cột nhồi pha tĩnh Cột tách có nhiều cỡ khác tùy thuộc vào mức độ mục đích q trình sắc ký Nói chung, cột phân tách thường có chiều dài từ 10-25 cm, đường kính từ 2-5mm 1.3.3.5 Detector Là phân phát chất phân tách Tùy theo chất chất cần phân tách mà sử dụng detector thích hợp bao gồm loại sau: - Detector hấp thụ UV-VIS - Detector phổ phát xạ nguyên tử - Detector huỳnh quang - Detector điện hóa - Detector khúc xạ kế - Detector đo độ dẫn điện Detector hay sử dụng detector hấp thụ UV-VIS 1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết Có nhiều loại đơn giản máy tự ghi để tín hiệu đo dạng peak 1.3.4 Các thông số đặc trưng trình sắc ký Kết trình tách chất detector phát hiện, phóng đại ghi thành sắc ký đồ với thông số: Thời gian lưu tR (phút): thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến xuất đỉnh chất tan sắc ký đồ, tR lớn chất tan bị lưu giữ mạng tốc độ di chuyển nhỏ Thời gian lưu thơng tin mặt định tính sắc ký đồ chất tan Trong điều kiện sắc ký định (cột, pha động, nhiệt độ, tốc độ dịng,…) thời gian lưu số chất tan - Thời gian chết t0: thời gian lưu chất không bị lưu giữ pha - tĩnh Thời gian lưu thực (tR’): tR’ = tR – t0 - Thể tích lưu V R: thể tích lượng pha động bị đẩy khỏi cột từ lúc bắt đầu tiêm mẫu thử đến xuất đỉnh chất tan sắc ký đồ: VR=tR.Fc (Fc thể tích pha động đơn vị thời gian) - Hệ số phân bố K: K= k Cs/Cm Cs Cm nồng độ chất tan pha tĩnh pha động tương ứng, k hệ số phân bố trạng thái cân xác định tốc độ trung bình vùng chất tan pha động vận chuyển qua cột K phụ thuộc vào: chất chất tan, chất pha động, chất pha tĩnh, nhiệt độ K lớn tR lớn (ra muộn) K nhỏ tR nhỏ (ra sớm) - Hệ số dung lượng k’: đại lượng dùng để mô tả tốc dộ di chuyển chất: k’= – k’ phụ thuộc vào chất chất cần phân tích, đặc tính pha tĩnh, pha động đặc điểm cột Với chất k’ lớn tốc độ di chuyển thấp Nếu k’ lớn, peak bị doãng, độ nhạy Nếu k’ nhỏ t R nhỏ tách Trong thực tế k’ nằm khoảng từ 2-5 tốt Hai chất tách khỏi chúng có giá trị k’ khác Trong phân tích thường chọn cột, pha động điều kiện phân tách cho 1≤k’≤8 - Nếu k’≤1 peak sớm dễ lẫn với peak tạp Nếu k’≥8 thời gian phân tách dài Độ chọn lọc α biểu diễn mức độ tách hai đỉnh Độ chọn lọc tỷ số thời gian lưu đỉnh sắc ký đồ α= α khác nhiều khả tách rõ rang, tối ưu từ 1,5-2 Nếu α lớn chất tách tốt, α nhỏ chất khó tách nhau, - α q lớn thời gian phân tách dài Số đĩa lý thuyết N: đặc trưng cho hiệu lực cột N=16 []2 Số đĩa lý thuyết N lớn hiệu lực cột cao (đỉnh nhọn, hẹp) Nếu gọi L chiều cao cột sắc ký, chiều cao đĩa lý thuyết H tính theo cơng thức: H= Trị số H nhỏ hiệu lực cột cao 10 Bảng 2.3 Cách pha dung dịch kết khảo sát tuyến tính Bình Quercetin (ml) 0,8 Diện tích peak 10,681 (mAU.min) 0,9 1,0 1,1 1,2 11,861 12,960 14,072 15,206 Từ kết thu bảng 2.3, ta thiết lập mối tương quan diện tích peak thu sắc ký đồ nồng độ dung dịch Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan là: y = 1126,1 x + 1,695; với hệ số tương quan R = 0,9999 Độ lệch chuẩn y_intercept: Sb = 0,0741 Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy y_intercept: 0,0741 0,2358 hay – 0,1617 < y_intercept < 0,3099 => chứa gốc tọa độ Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích peak Quercetin ghi bảng 2.3 Hình 2.3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích peak Quercetin 28 Từ kết thu hình 2.3 cho thấy tất giá trị thu nằm đường hồi quy phân bố đồng phía đường hồi quy Nhận xét: Như phương pháp tuyến tính khoảng nồng độ khảo sát từ 0,008 mg/ml – 0,012 mg/ml hay tuyến tính khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc d Tính Nguyên tắc: Đánh giá tính phương pháp tiến hành việc khảo sát khả tìm lại phương pháp Để xác định tính đúng, khảo sát mức độ theo dãy nồng độ khảo sát là: 80%, 100%, 120% so với nồng độ làm việc mẫu chuẩn Quercetin biết nồng độ Tiến hành: + Pha mẫu thử: 29 Cân xác khoảng 10,0 mg Quercetin chuẩn cho vào bình đựng mức 100,0 ml hịa tan pha lỗng dung môi pha động vừa đủ đến vạch Pha mức nồng độ 0,008 mg/ml, 0,01 mg/ml, 0,012 mg/ml theo cách sau:  Lấy xác 0,8 ml dung dịch cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Làm mẫu tiến hành sắc ký lấy kết trung bình  Lấy xác 1,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung mơi pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Làm mẫu tiến hành sắc ký lấy kết trung bình  Lấy xác 1,2 ml dung dịch cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Làm mẫu tiến hành sắc ký lấy kết trung bình + Pha mẫu chuẩn (đối chiếu): Cân xác 10,0 mg Quercetin chuẩn cho vào bình định mức 100,0 ml Hịa tan pha lỗng dung mơi pha động vừa đủ đến vạch Lấy xác 1,0 ml cho vào bình định mức 10,0 ml Thêm dung mơi pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua lọc 0,45 µm, dung dịch lọc tiêm sắc ký Tiến hành định lượng mẫu (theo mục 2.2.1.3) Tính hàm lượng phần trăm Quercetin có mẫu thử dựa chuẩn biết hàm lượng, từ tính phần trăm tìm lại mẫu thử Kết đánh giá tính phương pháp trình bày bảng 2.4 Mẫu đối chiếu: Sc = 13,189 mAU.min Bảng 2.4 Kết đánh giá tính phương pháp 30 Nồng độ Diện tích peak TB Khối lượng cho (mg/ml) (mAU.min) vào TB (mg) 0,008 0,01 0,012 Chuẩn 10,479 13,142 15,729 13,189 80 100 120 100 Khối tìm lượng lại (mg) 79,45 99,64 119,26 13,189 TB % tìm lại TB = 99,31 99,64 99,38 100 x = 99,44 % Số liệu thống kê RSD = 0,174 Hình 2.4 Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính mối tương quan lượng cân lượng hoạt chất tìm lại Qua phân tích ta có: Phần trăm tìm lại x = 99,44 % Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,174 31 Phương trình hồi quy tuyến tính mối tương quan lượng cân lượng hoạt chất tìm lại: Phương trình: y = 0,9953 x – 0,075 Độ lệch chuẩn của: Sa = 0,082 Độ lệch chuẩn y_intercept: Sb = 0,083 Với độ tin cậy 95 % ta có : Khoảng tin cậy độ dốc: a 12,71S a hay 0,8911 < a < 1,0995 => chứa nên khơng có sai số hệ thống tỷ lệ Khoảng tin cậy y_intercept: b 12,71S b hay – 1,125 < b < 0,876 => chứa gốc tọa độ nên khơng có sai số định Nhận xét: Qua kết ta thấy phương pháp có độ tốt khoảng khảo sát với khả tìm lại 99,44 % RSD = 0,174 e Tính đặc hiệu Trong ngun liệu Quercetin, ngồi Quercetin hoạt chất cịn có nhiều chất khác Rutin, đường Rutinose… Trong Rutin hợp chất ảnh hưởng nhiều đến kết định lượng Quercetin phương pháp, Quercetin bán tổng hợp cách thủy phân Rutin Do tiến hành khảo sát tính đặc hiệu phương pháp xậy dựng có mặt tạp chất Rutin Để khảo sát tính đặc hiệu phương pháp tiến hành sau: - Cân xác 10,0 mg Quercetin chuẩn cho vào bình định mức 100,0 ml Hịa tan pha lỗng hệ dung môi pha động (Methanol: acetonitril: đệm phosphate 0,01 M pH = 30: 60: 10) vừa đủ đến vạch lắc Lấy xác 1,0 ml dung dịch cho vào 32 bình định mức 10,0 ml, thêm dung mơi pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Cân xác 10,0 mg Rutin chuẩn cho vào bình định mức 100,0 ml Hịa tan pha lỗng hệ dung mơi pha động (Methanol: acetonitril: đệm phosphate 0,01 M pH = 30: 60: 10) vừa đủ đến vạch lắc Lấy xác 1,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Cân xác 10,0 mg Quercetin chuẩn cho vào bình định mức 100,0 ml Hịa tan pha lỗng hệ dung môi pha động (Methanol: acetonitril: đệm phosphate 0,01 M pH = 30: 60: 10) vừa đủ đến vạch lắc Lấy xác 1,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm 10% Rutin so với Quercetin thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiêm 10 µl dung dịch chuẩn bị vào hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động 30 phút Tiến hành sắc ký theo chương trình chọn Song song tiến hành ghi sắc ký đồ mẫu trắng Sắc ký đồ dung dịch đo ghi lại hình 2.5, 2.6, 2.7, 2.8 Hình 2.5 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Quercetin Sắc ký đồ dung dịch Quercetin chuẩn (0,01 mg/ml) cho peak thời gian lưu tR = 4,293 phút, peak cân xứng Hình 2.6 Sắc ký đồ Rutin chuẩn 33 Sắc ký đồ dung dịch Rutin (0,01mg/ml) cho peak thời gian lưu tR = 3,101 phút - Sắc ký mẫu trắng (Methanol: acetonitril: đệm phosphate 0,01 M pH (30: 60: 10)), ghi sắc ký đồ Hình 2.7: Sắc ký đồ mẫu trắng Từ sắc ký đồ mẫu trắng ta thấy khơng có peak lạ thời gian lưu Quercetin Rutin Sắc ký đồ hỗn hợp Quercetin, Rutin cho peak Quercetin Rutin Peak Quercetin tách rời peak Rutin Độ phân giải peak Quercetin Rutin ghi bảng 2.5 Bảng 2.5 Độ phân giải peak Quercetin Rutin Chất Quercetin Rutin Thời gian lưu 4,293 3,014 34 Độ phân giải Rs 1,91 Hình 2.8 Sắc ký đồ hỗn hợp Quercetin Rutin Vậy phương pháp định lượng Quercetin nguyên liệu xây dựng có tính đặc hiệu cao Rutin tạp chất khác không ảnh hưởng tới kết định lượng 2.2.1.5 Kết đánh giá phương pháp định lượng Quercetin Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích đại, ứng dụng phòng tâm kiểm nghiệm Việt Nam Ưu điểm phương pháp HPLC có ổn định độ chọn lọc, tiến hành nhanh chóng, áp dụng để định tính định lượng đồng thời nhiều hoạt chất mà không cần phải tách chiết riêng biệt Kết thực nghiệm xử lý thống kê cho thấy phương pháp xây dựng đáp ứng đầy đủ tiêu phương pháp định lượng Trên sắc ký đồ, peak Quercetin nhọn, cân xứng Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) thời gian lưu diện tích peak Quercetin phép thử song song nhỏ 2, giá trị hệ thống bất đối xứng dao động từ 1,69 đến 1,76 Điều chứng tỏ hệ thống HPLC mà ta sử dụng phù hợp đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lượng Quercetin 35 Kết đánh giá tính xác phương pháp cho thấy, điều kiện sắc ký chọn, độ lệch chuẩn tương đối kết nhỏ cho thấy phương pháp định lượng Quercetin nguyên liệu xác có độ xác cao Trong khoảng nồng độ khảo sát, phương pháp xây dựng đảm bảo tính có độ cao Giá trị trung bình tỷ lệ thu hồi lại là: 99,44%, độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,174, không mắc sai số tỷ lệ không mắc sai số hệ thống Tính tuyến tính khảo sát khoảng nồng độ rộng cho thấy có phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ nồng độ dung dịch diện tích peak Quercetin Đặt biệt phương pháp có tính đặc hiệu cao Phương pháp dễ thực thời gian ngắn, tiết kiệm thời gian dung môi, thuận tiện cho sở trang bị máy HPLC 2.2.2 Ứng dụng phương pháp Ứng dụng phương pháp vừa xậy dựng để định lượng mẫu Quercetin nguyên liệu Liên hiệp khoa học sản xuất công nghệ sản xuất Cách tiến hành:  Dung dịch thử: Cân xác 10,0 mg Quercetin ngun liệu cho vào bình định mức 100,0 ml Hịa tan pha lỗng hệ dung mơi pha động Lấy xác 1,0 ml dung dịch cho vào bình định mức 10,0 ml Thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua lọc 0,45 µm  Dung dịch chuẩn (đối chiếu): Cân xác 10,0 mg Quercetin chuẩn cho vào bình định mức 100,0 ml Hịa tan pha lỗng hệ dung mơi pha động Lấy xác ml dung dịch cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm 36  Mẫu trắng: Dung môi pha động: Methanol: acetonitril: đệm phosphate 0,01 M pH (30: 60: 10) Chuẩn bị cho hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động vòng 30 phút Tiêm 10 µl dung dịch thử chuẩnvà mẫu chuẩn bị vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký theo chương trình chọn Ghi diện tích peak thu sắc ký đồ mẫu thử mẫu chuẩn tương ứng Tiến hành định lượng mẫu mẫu thử 1; mẫu mẫu thử mẫu chuẩn Quercetin theo bước Kết định lượng trình bày bảng 2.6, 2.7 Bảng 2.6 Kết định lượng Quercetin nguyên liệu mẫu Mẫu thử STT Lượng cân (mg) Diện tích peak (mAU.min) 13,389 13,235 13,438 13,472 13,500 10,2 10,1 10,2 10,3 10,3 Lượng (mg) 10,1 10,2 10,1 10,3 10,4  Số liệu thống kê bảng 2.6: x = 98, 43 Hàm lượng Mẫu chuẩn S = 0,1453 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,148 % Sai số chuẩn: Sx = 0,065 V x = t a(n-1) Sx = 0,18 Khoảng tin cậy = 98,43 0,1 37 cân Quercetin Diện tích peak % (mAU.min) 13,216 13,312 13,236 13,423 13,556 98,31 98,40 98,52 98,36 98,54 Bảng 2.7 Kết định lượng Quercetin nguyên liệu mẫu Mẫu thử STT Lượng cân (mg) Diện tích peak (mAU.min) 10,834 11,002 10,947 10,876 11,012 10,1 10,3 10,2 10,2 10,3 Hàm lượng Mẫu chuẩn Lượng (mg) 10,1 10,2 10,1 10,3 10,4 cân Quercetin Diện tích peak % (mAU.min) 13,216 13,312 13,236 13,423 13,556 80,34 80,21 80,26 80,18 80,38  Số liệu thống kê bảng 2.7: x = 80,27 S = 0,0849 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,1058 % Sai số chuẩn: Sx = 0,038 V x = t a(n-1) Sx = 0,11 Khoảng tin cậy = 80,27 0,11 Nhận xét: Kết trình bày bảng 2.6 cho thấy mẫu trình bày nguyên liệu Quercetin đem định lượng có hàm lượng là: 98,43 % kết trình bày bảng 2.7 cho thấy mẫu nguyên liệu Quercetin đem định lượng có hàm lượng là: 80,27 % Hình 2.9 Sắc ký đồ mẫu thử 38 Hình 2.10 Sắc ký đồ mẫu thử PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 3.1 Kết luận 39 Trong trình làm khóa luận tốt nghiệp chúng tơi thu số kết : Đã xây dựng chương trình định lượng Quercetin phương pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện, với điều kiện sắc ký sau: Cột sắc ký Nucleosil C18 ( 250 x mm, m ) Detector UV:bước sóng= 371 nm Pha động: Methanol: acetonitril: đệm phosphat 0,01M pH = 30: 60: 10 Thể tích tiêm: 10 Tốc độ dỏng: 0,6 ml/phút Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phịng thí nghiệm Đã tiến hành đánh giá phương pháp định lượng tính thích hợp hệ thống sắc ký, tính xác, tính tuyến tính, tính đúng, tính đặc hiệu Kết nghiên cứu cho thấy: Phương pháp có tính đặc hiệu cao Tính xác cao với độ lệch chuẩn tương đối kết lả 0,189 nhỏ 2% Độ với khả tìm lại 99,44% ( nằm khoảng 98 -102%) Tính tuyến tính chặt chẽ khoảng nồng độ khảo sát Xác định hàm lượng Quercetin nguyên liệu Liên hiệp khoa học sản xuất công nghệ sản xuất : mẫu có hàm lượng 98,43%, mẫu có hàm lượng 80,27% (sản phẩm khơ) 3.2 Đề xuất Qua q trình thực nghiệm dựa kết thu được, chúng tơi có số đề xuất sau: Tiến hành nghiên cứu sản xuất xác định hàm lượng Quercetin, xây dựng mẫu chuẩn Quercetin Việt Nam Nghiên cứu áp dụng phương pháp đo quang định lượng Quercetin so sánh với phương pháp định lượng Quercetin phương pháp HPLC Tiếp tục nghiên cứu khảo sát để định lượng Quercetin chế phẩm chứa Quercetin viên nén, viên nang, dạng dung dịch… 40 TÀI LIỆU THAM THẢO Tiếng Việt Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB y học Hà Nội Bộ mơn hóa phân tích, Hóa phân tích tập (2006), Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.173-209 Bộ môn dược liệu, Bài giảng Dược liệu tập I (2004), Đại học Hà Nội, tr 259289 Công ty TNHH Dược phẩm Đại y, Tiêu chuẩn sở Cao Bạch Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Thu Hương, Hồ Việt Anh (2006), “So sánh hoạt tính chống oxy hóa số flavonoid ( dạng glucosid genin ) từ hoa hịe vỏ qt”, Tạp chí Dược liệu, Tập 11, số 5, tr.187 Nguyễn Văn Đậu (2001), “Đóng góp vào việc nghiên cứu flavonoid nụ hoa hòe”, Tạp chí Dược học – số 8, tr.13-14 Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên, NXB Y Học, tr 49- 170 Nguyễn Tiến Dũng, Hà Hồi, Huỳnh Thị Thành - Trần Thị Huỳnh Chi - Lê Thị Thu Cúc – Ngơ Thị Hồng Linh (2005), “Nghiên cứu độ ổn định nụ hoa hòe sau thu hoạch”, Tạp chí dược học – số 11, tr.9 41 Nguyễn Tiến Khanh (1995): Thống kê ứng dụng tác Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, tủ sách sau đại học, tr.17,27-35 10 Từ Văn Mạc (1995), Phân tích hóa lý, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.313-339 11 Nguyễn Văn Tuyền, Chu Thị Lộc, Nguyễn Thị Kiều Anh (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Đại học Dược Hà Nội, tr.83-98 12 http://sức khỏe cộng đồng com/content/view/830/104 13 http://Bệnh viện Việt Đức.mht 14 http://www.khoahoc.net 15 http:// Minh Tân – Siêu thị trực tuyến – Thuốc – Dược phẩm Bệnh liên quan đến khớp Thuốc giúp bệnh Thống Phong QUERCETIN & BROMELAIN (120 viên).mht Tiếng Anh 16 Brishtish pharmacopoeia (2001), Volume II, p.A 141- p.A 145 17 Brishtish pharmacopoeia (2005), Volume I, p.908 18 Ping Xiao, Faquiong Zhao, Baizhao Zeng (2007), “Voltammetric determination of quercetin at a multi – walled carbon nanotubes paste electrode”, Mircochimical Jounal (85), pp.244-249 19 Prof.yuri Kazakevich,prof.H.M.Harold MeNair (1996), Text book on High pergormance liqiud chromatogaphy (HPLC), p.127-129;231-239 20 The United State pharmacopoeia (2004), p.2272, p.2278, p.2278-2282 21 The United State pharmacopoeia (2001), p.1225 22 USP 30 – NF 25, Volume 32, p.164 23 http://vitaminstuff.com 24 http;//unbound medline quercetinpharmacokinetics in human – Journal article.mht 42 ... xác định hàm lượng Quercetin, xây dựng mẫu chuẩn Quercetin Việt Nam Nghiên cứu áp dụng phương pháp đo quang định lượng Quercetin so sánh với phương pháp định lượng Quercetin phương pháp HPLC. .. ? ?Định lượng Quercetin phương pháp HPLC? ?? với mục tiêu sau: Xậy dựng qui trình kỹ thuật định lượng Quercetin nguyên liệu phương pháp HPLC Đánh giá phương pháp xây dựng theo tiêu phương pháp đinh lượng. .. kết định lượng 2.2.1.5 Kết đánh giá phương pháp định lượng Quercetin Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) phương pháp phân tích đại, ứng dụng phòng tâm kiểm nghiệm Việt Nam Ưu điểm phương pháp