Đang tải... (xem toàn văn)
luận văn, khóa luận, tiểu luận, đề tài, chuyên đề, báo cáo
Phần 1: Tổng quan 1.1. Tổng quan về Tobramycin 1.1.1. Công thức cấu tạo C 18 H 37 N 5 O 9 PTL: 467.5 Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy--D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6- diamino-2,3,6-trideoxy--D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21]. 1.1.2. Tính chất lý hóa Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nớc, rất khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether. Góc quay cực riêng [] D 20 : +138 0 đến +148 0 [7] 1.1.3. Nguồn gốc Chiết xuất từ môi trờng nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán tổng hợp từ kanamycin B [7]. 1.1.4. Dợc động học Tobramycin hầu nh không hấp thu qua đờng tiêu hoá nhng hấp thu tốt qua đờng tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Thuốc ít liên kết với protein huyết tơng. Do 3 phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não. Thuốc đạt nồng độ cao trong vỏ thận. Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con. Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải giảm liều khi suy thận, thờng dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính. Hiện nay, tobramycin đợc dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày. Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày nh trớc đây. Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu. aeruginosa ở ngời giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6] 1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí. Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận. Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin. Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom [2], [11]. 1.1.6. Chỉ định Đợc chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân cha rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr (-). Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng phối hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam. 4 Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha - Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc benzylpenicilin nhng phải tiêm riêng rẽ. [2] 1.1.7. Chống chỉ định Ngời có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, ngời nghe kém và ngời có bệnh thận. [2] 1.1.8. Dạng bào chế và liều lợng Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (ngời lớn), 10 mg/ml (trẻ em). Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ. Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %. Dạng thuốc hít qua đờng miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P. aeruginosa đờng hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11] 1.2. Một số phơng pháp định lợng Tobramycin 1.2.1. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp vi sinh 1.2.1.1. Phơng pháp 1 [15] - Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501. - Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g - Môi trờng định lợng: Pepton : 5,0 g Cao thịt : 3,0 g Dikali hydrophosphat : 3,0 g Thạch : 15,0 - 20,0 g Nớc cất : 1000 ml pH sau khi tiệt trùng : 7,8 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15] 5 1.2.1.2. Phơng pháp 2 [3] - Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241. - Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 0,1 Dikali hydrophosphat : 16,75 g Kali dihydrophosphat : 0,523g - Môi trờng định lợng: Cao men bia : 3,0 g Pepton : 6,0 g Casein pancreatic : 4,0 g Glucose : 1,0 g Cao thịt : 1,5 g Thạch : 15,0 g Nớc cất : 100 ml pH sau khi tiệt trùng : 8,2 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20 IU/ml và 40 IU/ml. - Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phơng pháp hoạt lực kháng sinh - DĐVN III. 1.2.1.3. Phơng pháp 3:[14], [20] - Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phơng pháp vi sinh vật theo BP 2000 hay JP14 - Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633 - Môi trờng nuôi cấy : Môi trờng đặc - Dung dịch chuẩn Cân chính xác một lợng tobramycin chuẩn, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính 6 xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt độ từ 5 C đến 15 C và sử dụng trong vòng 30 ngày. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực). - Dung dich thử: Cân chính xác một lợng tobramycin, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml. Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực). 1.2.2. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV- VIS 1.2.2.1. Phơng pháp 1: [4] Cân một lợng tobramycin sulfat tơng ứng với khoảng 0,3 g tobramycin nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nớc cất 2 lần vừa đủ đến vạch, trộn đều. Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO 4 . Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 40 0 C trong 60 phút. Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối chiếu tobramycin. Mẫu trắng tiến hành nh mẫu thử nhng không có tobramycin. Sau khi đun cách thuỷ ở 40 0 C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang của các dung dịch này ở bớc sóng 425 nm, cuvet dày 1cm. 1.2.2.2. Phơng pháp 2: [19] Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2 benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl 3 . Sản phẩm có độ hấp thụ lớn nhất ở 645 nm. Định luật Lambert-Beer đợc áp dụng trong khoảng nồng độ từ 50-500 mUI/ml. 1.2.3 Định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC 1.2.2.1 Phơng pháp 1 [14] 7 - Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8àm). - Nhiệt độ cột: 55 0 C. - Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nớc đã loại CO 2 gồm: 52 g natri sulfat khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã đợc chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong n- ớc đã loại CO 2 . Tốc độ 0,3 ml/phút. - Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tơng tự. - Thể tích tiêm: 20 àl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml. 1.2.2.2 Phơng pháp 2 [20], [23] - Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm). - Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong khoảng 800 ml nớc, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc đều. - Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%. - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. - Detector UV: 365 nm. - Thể tích tiêm: 20 àl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch acid sulfuric 0,004 N. - Các dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4- dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trớc khi tiêm sắc ký. 1.2.2.3 Phơng pháp 3 [15] - Cột Purospher STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 àm, Merck). - Pha động: Acetonitril - nớc (50:50). 8 - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút. - Detector UV: 230 nm. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 àg/ml trong nớc. - Dung dịch chuẩn và dung dịch thử đợc tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 70 0 C. 1.2.2.4 Phơng pháp 4 [16] - Cột Xterra RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 àm). - Nhiệt độ cột: 30 0 C. - Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1 lít nớc Milli - Q . Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH pha động A đến 11,0. - Pha động B: Acetonitril. - Tiến hành sắc ký theo chơng trình gradient dung môi nh sau: Thời gian (phút) Pha động A (%) Pha động B (%) 0 100 0 10 0 100 - Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút. - Detector: Khối phổ. - Thể tích tiêm: 4àl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,35 mg/ml trong dung dịch NaCl 0,9 %. 1.2.2.5 Phơng pháp 5 [15] - Cột Ultrasphera RP 8 (4,6 x 250 mm, 5àm). - Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38] - Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút. - Thuốc thử tạo dẫn chất: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic. 9 - Detector UV: 340 nm. - Thể tích tiêm: 20 àl. - Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,02 mg/ml trong đệm phosphat pH 7,4. - Dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với thuốc thử acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ở 70 0 C. 1.2.2.6. Phơng pháp 6 [5] - Cột : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5àm) - Detector huỳnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm - Tốc độ dòng: 1ml/phút - Tốc độ thuốc thử: 0,7ml/phút - Thể tích tiêm: 20 àm - Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nớc, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm. - Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100 ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút. Thêm 1,5 ml dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4 lắc đều. - Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml nớc. Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nớc tới vừa đủ 1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm (pha theo BP 2005). 1.2.2.7. Phơng pháp 7 [9] Dung dịch thử Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình định mức 20,0 ml. Hòa tan và pha loãng bằng nớc vừa đủ đến vạch. Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml. Thêm 0,5 ml thuốc 10 thử X, đem đun cách thủy ở 80 0 C trong 60 phút. Thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 àm. Dung dịch chuẩn (đối chiếu) Tiến hành tơng tự nh dung dịch thử nhng thay tobramycin nguyên liệu bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu). - Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5àm). - Detector UV : = 215 nm. - Pha động: Methanol : Đệm phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80 - Thể tích tiêm: 10 àl. - Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút. - Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm. * Nhận xét: Qua các phơng pháp định lợng nêu trên, chúng tôi nhận thấy: - Định lợng bằng phơng pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết bị phức tạp nhng có nhợc điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc hiệu do sự có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không cao. - Định lợng bằng phơng pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao, tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng và có thể áp dụng định lợng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nớc. Tuy nhiên, nhợc điểm của phơng pháp là: Tính đặc hiệu cha cao (sự có mặt của chất khác có khả năng hấp thụ tử ngoại khả kiến nh benzalkonium clorid, một chất bảo quản hay dùng, sẽ ảnh hởng kết quả định lợng), hoặc phải dùng thuốc thử nhập ngoại để tạo dẫn chất. - Định lợng bằng phơng pháp HPLC : u điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng đợc hoạt chất. Nhợc điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền vì detector UV thờng không dùng đợc mà thờng phải tạo dẫn chất. 11 Phơng pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích các hợp chất phân cực và hấp thụ UV. Nhng với các hợp chất hấp thụ UV yếu nh tobramycin thì thờng phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc biệt đắt tiền. Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc thử tạo dẫn xuất nh các phơng pháp hiện nay với hi vọng có thể đa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lợng các sản phẩm chứa tobramycin. 1.3. Tổng quan về phơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1.3.1. Nguyên tắc Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách. Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị trên màn hình hoặc đa ra máy in [8]. 1.3.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột. 12
