Đang tải... (xem toàn văn)
Thiết lập quy trình điện di protein SDS -PAGE và ứng dụng đánh giá phản ứng của cây lúa
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐIỆN DI PROTEIN SDS– PAGE VÀ ỨNG DỤNG ĐÁNH GIÁ PHẢN ỨNG CỦA CÂY LÚA ĐỐI VỚI THUỐC SINH HỌC KÍCH KHÁNG Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: LÊ NGUYỄN PHÚC SƠN Thành Phố Hồ Chí Minh 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐIỆN DI PROTEIN SDS– PAGE VÀ ỨNG DỤNG ĐÁNH GIÁ PHẢN ỨNG CỦA CÂY LÚA ĐỐI VỚI THUỐC SINH HỌC KÍCH KHÁNG Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS LÊ ĐÌNH ĐƠN LÊ NGUYỄN PHÚC SƠN Thành Phố Hồ Chí Minh 9/2007 LỜI CẢM TẠ Để có đƣợc thành ngày hôm nay, trƣớc tiên, xin cảm ơn bố mẹ gia đình tạo điều kiện thuận lợi để yên tâm học tập, nghiên cứu hồn thành tốt luận văn TƠI CHÂN THÀNH CẢM ƠN Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Bộ mơn Bảo vệ Thực vật, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trƣờng, Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Đã tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập để hồn thành khóa luận tốt nghiệp TƠI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN Thầy Lê Đình Đơn tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ chúng tơi hồn thành khóa luận Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí tạo điều kiện cho thực tập Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trƣờng Anh Nguyễn Văn Lẫm nhiệt tình dẫn tơi suốt trình thực đề tài Các anh chị ở, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trƣờng Các anh chị Bộ môn Bảo vệ Thực vật, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Các thành viên lớp Cơng nghệ Sinh học 29 động viên, giúp đỡ thời gian thực tập iii TÓM TẮT Đề tài “Thiết lập quy trình điện di protein SDS- PAGE ứng dụng đánh giá phản ứng lúa thuốc sinh học kích kháng” Lê Nguyễn Phúc Sơn thực từ 15/03/2007 đến 31/08/2007 môn Bảo vệ Thực vật, khoa Nông học, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh phịng Cơng nghệ Sinh học Thực vật, viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học Công nghệ Môi trƣờng, trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Đề tài hƣớng nghiên cứu phát triển phƣơng pháp sinh học phân tử điều kiện phịng thí nghiệm, mà bƣớc đầu hoàn thiện phƣơng pháp SDS– PAGE áp dụng protein lúa Quy trình trải qua giai đoạn: Chuẩn bị mẫu lúa Ly trích protein lúa Điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích đƣợc từ lúa Tóm lại, đề tài thiết lập đƣợc quy trình SDS– PAGE đối tƣợng protein lúa nhƣng chƣa hồn thiện đƣợc quy trình mức độ protein có độ tinh cao Kết đề tài sở ban đầu việc hoàn thiện phƣơng pháp phân tích proteomics để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng công tác bảo vệ thực vật iv MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG ix Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vài điều sơ lƣợc lúa 2.1.1 Nguồn gốc phân bố 2.1.2 Đặc điểm hình thái lúa 2.1.3 Đặc điểm hạt lúa 2.1.4 Điều kiện để hạt lúa nảy mầm 2.1.4.1 Nƣớc 2.1.4.2 Nhiệt độ 2.1.4.3 Khơng khí 2.2 Một số phƣơng pháp tách chiết protein tổng số từ thực vật 2.2.1 Quy trình có sử dụng SDS 2.2.2 Quy trình có sử dụng phenol 2.2.3 Quy trình có sử dụng PMSF 2.3 Phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide 2.3.1 Sơ lƣợc lịch sử gel polyacrylamide phát triển phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide 2.3.2 Gel polyacrylamide 2.3.3 Phƣơng pháp SDS- PAGE 10 v 2.3.4 Nhuộm gel sau điện di 11 2.3.5 Một số yếu tố cần quan tâm điện di gel polyacrylamide 13 2.3.6 Phƣơng pháp điện di hai chiều 14 2.4 Một số nghiên cứu liên quan đến điện di protein SDS- PAGE 16 2.4.1 Nghiên cứu nƣớc 16 2.4.2 Nghiên cứu nƣớc 17 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 18 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 18 3.2 Hóa chất vật liệu dùng thí nghiệm 18 3.2.1 Thuốc sinh học 18 3.2.2 Hóa chất dùng ly trích 18 3.2.3 Hóa chất điện di 19 3.2.4 Trang thiết bị thí nghiệm 19 3.3 Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu 19 3.3.1 Chuẩn bị mẫu lấy mẫu 19 3.3.1.1 Chuẩn bị mẫu lúa 19 3.3.1.2 Xử lý thuốc lấy mẫu 20 3.3.2 Ly trích protein tổng số từ lúa 21 3.3.2.1 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng SDS 21 3.3.2.2 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình có sử dụng phenol 21 3.3.2.3 Các bƣớc ly trích protein theo quy trình cải tiến có dụng SDS 22 3.3.3 Điện di kiểm tra mẫu protein ly trích 23 3.3.3.1 Chuẩn bị hóa chất 23 3.3.3.2 Chuẩn bị mẫu chạy điện di 24 3.3.3.3 Tiến hành điện di xem kết 24 3.3.4 Thí nghiệm khảo sát chọn điều kiện điện di 25 3.3.5 Khảo sát nồng độ gel 25 3.3.6 Điện di mẫu protein để kiểm tra phản ứng lúa thuốc sinh học kích kháng 26 vi Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1 Kết ly trích protein tổng số 27 4.2 Kết khảo sát chọn điều kiện điện di 29 4.3 Ảnh hƣởng nồng độ gel đến kết điện di 30 4.4 Đánh giá phản ứng lúa thuốc sinh học 32 4.4.1 Kết điện di tất mẫu protein 12 nghiệm thức 32 4.4.2 Kết điện di mẫu protein lúa lô II 33 4.4.3 Kết điện di mẫu protein lúa lô III 34 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2- DE Two- dimensional electrophoresis AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism APS ammonium persulfate CBB Coomassie Brilliant Blue DTT Dithiotheitol EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic Acid HPLC High performance liquid chromatography IEF Isoelectric focusing KDa kilo Dalton PCR Polymerase Chain Reaction PVDF Polyvinylidene difluoride RADP Randomly Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SDS– PAGE Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis SNP Single Nucleotide Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Site TEMED N,N,N’,N’-tetramethylenediamide SDS Sodium dodecyl sulfate TE Tris – EDTA w/v Weight for volume viii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC BẢNG Hình 2.1 Hình thái lúa (Oryza sativa L.) Hình 2.2 Cấu trúc protein trƣớc sau làm biến tính SDS 11 Hình 3.1 Lúa mầm hộp nhựa ngày 20 Hình 4.1 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích quy trình 28 Hình 4.2 Kết khảo sát điều kiện điện di phù hợp với protein lúa 30 Hình 4.3 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein khảo sát nồng độ gel 31 Hình 4.4 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein lúa nghiệm thức (nghiệm thức 1, 2, 3,4, 6) 32 Hình 4.5 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein lúa nghiệm thức (nghiệm thức 4, 5, 6, 7, 10 11) 32 Hình 4.6 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein lúa nghiệm thức (nghiệm thức 5, 8, 9, 10 12) 32 Hình 4.7 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lơ II 33 Hình 4.8 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lơ III 34 Bảng 3.1 Bảng bố trí phân lơ thí nghiệm theo nghiệm thức 20 Bảng 3.2 Thời gian xử lý thuốc trƣớc lấy mẫu theo nghiệm thức 21 Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát điều kiện điện di 25 ix Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Lúa lƣơng thực quan trọng, nhu cầu thiếu ngƣời, đặc biệt nƣớc Châu Á Việt Nam với đặc điểm khí hậu nhiệt đới gió mùa, mƣa nhiều, ẩm độ cao, thích hợp cho việc trồng lúa Mặt khác ngƣời Việt Nam cịn có truyền thống canh tác lúa từ lâu đời Trƣớc đây, với điều kiện vật chất thiếu thốn, lƣơng thực khơng đủ ăn ngƣời ta có nhu cầu đƣợc ăn no Hiện với mức sống ngƣời dân ngày đƣợc nâng cao ngồi nhu cầu ăn no, việc ăn ngon, có dinh dƣỡng cao dần trở nên nhu cầu quan trọng ngƣời Nhƣng bệnh trồng hoành hành dội, gây cản trở sản xuất phát triển ngành nông nghiệp Ngày nay, với thành công lớn công nghệ sinh học giới nhƣ nƣớc, định hƣớng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học công tác bảo vệ thực vật có chuyển hƣớng rõ rệt Trƣớc hết đầu tƣ lớn để khai thác ứng dụng công nghệ sinh học việc phòng trừ nấm bệnh, sâu rầy hại, virus, cỏ dại loại côn trùng gây hại sản xuất nơng nghiệp Theo hƣớng ứng dụng cơng nghệ sinh học nghiên cứu chế phẩm sinh học có chất polyamin ngày phát triển Đây hƣớng nghiên cứu trở thành cơng nghệ phịng trừ sâu bệnh hại nƣớc ta đƣợc đầu tƣ phát triển Cùng với thành công lớn công nghệ sinh học kỹ thuật sinh học phân tử đời nhƣ phƣơng pháp Southern blot, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RADP (Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP (Single Nucleotide Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) tạo nên chuyển biến rõ rệt hƣớng nghiên cứu acid nucleic Tuy nhiên phƣơng pháp sinh học phân tử 24 b) Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu (sample buffer) dung dịch đệm điện di (electrode buffer) Pha dịch nạp mẫu gồm: 3,55 ml nƣớc cất lần khử ion; 1,25 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 2,5 ml glycerol; ml SDS 10% (w/v); 0,2 ml bromophenol blue 0,5%(w/v) Khi dùng thêm vào 50 µl 2- Mercaptoethanol 0,5 ml dithiothreitol M (DTT) Dung dịch đệm điện di Tris– glycine, pH 8,3 Pha 1l Tris– glycine (196mM glycine, 0,1% SDS, 50 mM Tris– HCl pH 8,3) c) Chuẩn bị dung dịch nhuộm dung dịch giải nhuộm Dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R- 250 Pha hỗn hợp theo tỉ lệ nhƣ sau vào hộp nhựa có nắp: 0,2% Coomassie Brilliant Blue R- 250 (w/v), 45% methanol (v/v), 45% nƣớc cất hai lần khử ion (v/v), 10% acid acetic (v/v) Đậy kín lại giữ tối đến sử dụng Dung dịch giải nhuộm Pha hỗn hợp sau theo tỉ lệ vào hộp nhựa khác: 25% methanol (v/v), 65% nƣớc cất hai lần khử ion (v/v), 10% acid acetic (v/v) Đậy kín, giữ tối đến sử dụng 3.3.3.2 Chuẩn bị mẫu chạy điện di Dùng pipette loại 0,5 – 10 µl hút µl dung dịch nạp mẫu µl mẫu protein vào eppendorf 0,2 ml sạch, trộn đều, đậy nắp gia nhiệt 950C từ – phút gây biến tính protein Sau gia nhiệt ly tâm 10.000 vịng/phút phút 3.3.3.3 Tiến hành điện di xem kết Dùng pipette loại 0,5 – 10 µl nạp mẫu vào giếng (10 µl/giếng) Tiến hành chạy điện di hiệu điện 100 V, cƣờng độ dòng điện 15 mA, thời gian 120 phút điện di vạch màu dịch nạp mẫu cách đáy gel khoảng 0,5 – 1cm Sau điện di, tháo gel khỏi khuôn, rửa gel nƣớc phút (cẩn thận tránh làm đứt gel) Nhuộm gel thời gian 30 – 45 phút Sau nhuộm xong, rửa gel với nƣớc phút Tiến hành giải nhuộm cách ngâm gel dung dịch giải nhuộm gel trở nên suốt 25 không màu Sau giải nhuộm xong, protein đƣợc phát nhờ vạch màu xanh lam gel suốt 3.3.4 Thí nghiệm khảo sát chọn điều kiện điện di Điều kiện điện di ảnh hƣởng lớn đến kết điện di Nếu điều kiện điện di khơng phù hợp với protein làm băng protein bị cong, protein bị biến tính hoạt động trở lại enzyme Đồng thời làm cho băng protein khơng phân tách rõ ràng Trong thí nghiệm tiến hành khảo sát điều kiện điện di cho phù hợp với protein lúa nhằm chọn điều kiện điện di thích hợp Bố trí thí nghiệm khác (bảng 3.3) Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát điều kiện điện di Điều kiện điện di Thí nghiệm Gel gom Gel phân tách 200 V, 13 mA, 20 phút 200 V, 18 mA, 100 phút 100 V, 20 mA, 10 phút 100 V, 20 mA, 80 phút 100 V, 15 mA, 20 phút 100 V, 15 mA, 100 phút Mẫu sử dụng thí nghiệm mẫu protein ly trích theo quy trình tốt quy tình khảo sát Chỉ tiêu theo dõi: hình dạng băng protein phân tách băng gel 3.3.5 Khảo sát nồng độ gel Nồng độ gel ảnh hƣởng lớn đến độ phân tách băng protein gel Vì nồng độ gel cao kích thƣớc lỗ gel nhỏ lại cản trở di chuyển của protein có kích thƣớc lớn Nói cách khác với nồng độ gel cho phép phân tách protein khoảng trọng lƣợng phân tử xác định Để thấy đƣợc cách rõ ràng băng protein lúa gel, cần khảo sát nồng độ gel phân tách cho phù hợp với protein tổng số đƣợc ly trích từ lúa Phải lựa chọn nồng độ gel cho băng protein gel đƣợc phân tách rõ ràng 26 Tiến hành thử nghiệm cách đổ miếng gel có nồng độ gel phân tách khác thử nghiệm mẫu protein Nồng độ gel gom đƣợc giữ nguyên 4% T, nồng độ gel phân tách đƣợc thay đổi 12% T, 13% T, 14% T Ta tiến hành chạy điện di điều kiện với hiệu điện ổn định 100 V, cƣờng độ dòng điện 15 mA, thời gian điện di 120 phút, nhuộm gel 0,2% CBB (w/v) nhiệt độ phòng 250C 3.3.6 Điện di mẫu protein để kiểm tra phản ứng lúa thuốc sinh học kích kháng Thí nghiệm 1: Tiến hành điện di tất mẫu protein ly trích đƣợc từ tất mẫu lúa so sánh qua lại 12 nghiệm thức mẫu protein lúa Cách tiến hành Chuẩn bị đổ miếng gel có nồng độ gel phân tách 12%, nồng độ gel gom 4% Chuẩn bị sẵn tất mẫu protein ly trích 12 nghiệm thức Dùng micropipette nạp mẫu vào giếng với tỉ lệ l dịch nạp mẫu l mẫu Trƣớc nạp mẫu vào giếng, hỗn hợp mẫu dịch nạp mẫu đƣợc gia nhiệt 950C thời gian phút Tiến hành điện di tất miếng gel hiệu điện 100 V, cƣờng độ dòng điện 15 mA, thời gian 120 phút Sau điện di xong, cẩn thận lấy gel khỏi khuôn Nhuộm gel dung dịch nhuộm CBB 0,2% (w/v) thời gian 30 phút Sau nhuộm xong, cẩn thận lấy gel ra, rửa gel nƣớc ngâm gel dung dịch giải nhuộm xuất băng protein gel hay gel trở nên suốt Nếu có protein mẫu xuất băng màu lam gel Thí nghiệm 2: Điện di kiểm tra kết mẫu protein đƣợc ly trích từ lô II Thực điện di miếng gel theo điều kiện giống thí nghiệm Gel 1: nạp mẫu từ X1 – X9 hình 4.11 Gel 2: nạp mẫu từ X4 – X12 hình 4.12 Thí nghiệm 3: Điện di kiểm tra kết mẫu protein đƣợc ly trích từ lơ III Tiến hành nhƣ thí nghiệm mẫu Y1 – Y12 27 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thử nghiệm quy trình ly trích protein Giai đoạn tách chiết protein tổng số giai đoạn dễ thực nhƣng đơn giản Giai đoạn quan trọng yếu tố hàng đầu định thành cơng thí nghiệm Có nhiều phƣơng pháp ly trích protein khác nhƣng mục đích cuối phƣơng pháp thu đƣợc lƣợng protein có độ tinh khiết cao phục vụ cho nghiên cứu Muốn vậy, việc có đƣợc phƣơng pháp ly trích kinh nghiệm thao tác đóng vai trị quan trọng Việc tách chiết phải đảm bảo cho protein không bị biến tính, đứt gãy thất Tiến hành khảo sát quy trình ly trích để chọn quy trình tối ƣu việc ly trích protein tổng số từ lúa Đối với quy trình có sử dụng SDS tiến hành ly trích thử nghiệm mẫu lúa Kết (hình 4.1a) cho thấy, mẫu protein ly trích đƣợc sau tiến hành điện di SDS- PAGE cho băng protein, băng protein mờ Điều mẫu protein tổng số ly trích đƣợc theo quy trình cịn lẫn nhiều tạp lipid, polysaccharide nên điện di băng không phân tách đƣợc rõ ràng Hoặc protein bị biến tính q trình ly trích, đặc biệt bảo quản mẫu 40C protein enzyme hoạt động đƣợc nhiệt độ phân hủy protein mẫu Quá trình nghiền mẫu lúa với dịch ly trích nên thực nhanh, dịch ly trích có 2- mercaptoethanol có khả cắt đứt cầu nối (S – S) protein làm protein biến tính Khi protein biến tính tiếp tục nghiền có khả làm đứt gãy protein Bƣớc tủa protein nên thực nhiệt độ âm sâu giúp tủa tối đa protein làm giảm tối thiểu lƣợng protein bị biến tính enzyme nội bào gây Các muối giúp hòa tan protein dung dịch cần đƣợc giữ pH 8.0, pH protein ổn định 28 (a) (b) (c) Hình 4.1 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích quy trình (a) Mẫu protein ly trích theo quy trình (b) Mẫu protein ly trích theo quy trình (c) Mẫu protein ly trích theo quy trình Để khảo sát quy trình ly trích có sử dụng phenol, tiến hành ly trích thử nghiệm mẫu lúa Tất mẫu đƣợc ly trích quy trình cho kết khơng tốt (hình 4.1b) Mỗi mẫu cho từ – băng protein gel, băng không phân tách rõ Để giải thích cho kết chúng tơi cho phenol có khả phá hủy hợp chất polysaccharide có khả phá hủy protein Khi thực bƣớc nên tiến hành nhanh, tránh đến mức tối đa phân hủy protein phenol gây Trong quy trình có số ƣu điểm: (i) EDTA đƣợc sử dụng dịch ly trích với mục đích quan trọng ngăn cản hoạt động emzyme nội bào cách tham gia gắn ion Mg++, Ca++ Vì enzyme nội bào muốn hoạt động mạnh phải gắn với cation hóa trị II đặc biệt với Mg++ (ii) Amonium acetate đƣợc sử dụng bƣớc tủa protein với mục đích đệm làm tăng khả tủa protein Sau tiến hành thử nghiệm quy trình ly trích trên, mẫu protein thu đƣợc quy trình khơng tốt khơng đủ điều kiện tiến hành điện di Do đó, sau 29 rút số kinh nghiệm chúng tơi thí nghiệm cải tiến quy trình có sử dụng SDS để ly trích mẫu lúa Kết ly trích mẫu đạt đƣợc tốt (hình 4.1c) Mẫu protein sau điện di SDS- PAGE có phân tách băng rõ ràng, bị tạp (smear mờ) Kết tốt đạt đƣợc quy trình so với quy trình trƣớc tổng hợp nhiều yếu tố: (i) nghiền mẫu với nitơ lỏng mô mềm tế bào dễ dàng tách rời hơn; với tác động 2mercaptoethanol màng tế bào bị phá vỡ phóng thích protein; (ii) việc sử dụng EDTA quy trình ngăn cản enzyme nội bào hoạt động dịch ly trích (iii) muối dịch ly trích kết hợp với Tris- HCl pH 8,0 giữ ổn định protein hòa tan dung dịch; (iv) tủa protein acetone -200C ngăn cản enzyme nội bào hoạt động Từ kết ly trích quy trình cải tiến, nhận thấy mẫu protein đƣợc ly trích theo quy trình đủ điều kiện để tiến hành điện di Thực ly trích tất mẫu lúa cịn lại theo quy trình để làm thí nghiệm Sau số điểm cần lƣu ý tiến hành ly trích protein tổng số lúa rút từ thực nghiệm: Dụng cụ cần khử trùng cẩn thận phòng ngừa tạp nhiễm Mang bao tay để bảo vệ khử trùng cồn 70% cẩn thận tránh tạp nhiễm Mẫu sau lấy khỏi tủ -200C phải đƣợc cắt ngâm nitơ lỏng Thao tác nhẹ nhàng nghiền mẫu lúa thật nhuyễn thành bột mịn Bƣớc tủa protein acetone nên thực nhiệt độ âm sâu Nếu có sử dụng phenol ly trích nên thao tác nhanh, tránh phân hủy protein Khi trữ mẫu nên trữ nhiệt độ dƣới -700C Nhƣng tốt sử dụng sau ly trích 4.2 Kết thí nghiệm khảo sát chọn điều kiện điện di Kết điện di điều kiện thí nghiệm (hình 4.2a) cho thấy băng protein bị cong, méo Hiện tƣợng thời gian điện di lâu 120 phút hiệu điện 200 V làm nhiệt độ mơi trƣờng điện di tăng Do chúng tơi tiến hành thí nghiệm tăng Ampe lên 20 mA giảm hiệu điện xuống 100 V Kết 30 đạt đƣợc thí nghiệm phân tách băng protein không rõ ràng, điều trình điện di xảy nhanh băng protein chƣa thể phân tách Rút kinh nghiệm từ thí nghiệm chúng tơi tiến hành thí nghiệm Trong thí nghiệm chúng tơi tiến hành giảm Ampe xuống 15 mA giữ hiệu điện 100 V Kết (hình 4.2c) cho thấy băng protein phân tách rõ ràng khơng bị cong, méo Từ kết chúng lựa chọn điều kiện điện di theo thí nghiệm để tiến hành thí nghiệm sau (a) (c) (b) Hình 4.2 Kết khảo sát điều kiện điện di phù hợp với protein lúa (a) Kết điện di với điều kiện thí nghiệm (b) Kết điện di với điều kiện thí nghiệm (c) Kết điện di với điều kiện thí nghiệm 4.3 Kết thí nghiệm khảo sát chọn nồng độ gel Các miếng gel đƣợc chạy điện di với hiệu điện ổn định 100V, 15mA, thời gian 120 phút Kết điện di (hình 4.3) cho thấy mức độ phân tách mẫu protein gel 12% T, 13% T, 14% T giống Thể rõ mẫu Y6, Y7 Y8 gel 13% T gel 12% T đƣợc phân tách rõ Mẫu protein Y5 gel 13% T thấy băng khơng phải ảnh hƣởng nồng độ gel Hiện tƣợng protein mẫu (ít 0,1 µg) không đủ để ăn màu Coomassie Brilliant Blue Hàm lƣợng protein q trình bảo quản mẫu khơng tốt, ly trích mẫu khơng đạt gia nhiệt biến tính trƣớc nạp 31 mẫu protein bi đứt gãy Những mẫu Y6, Y8 gel 12% T X4, X5 gel 14% T ăn màu CBB đậm hàm lƣợng protein mẫu nhiều µg Ngồi ta cịn thấy nồng độ gel 14% T, khoảng cách phân tách băng hẹp so với khoảng cách phân tách băng gel 13% T, khoảng cách gel 12% T rộng Nhƣ vậy, điều kiện hiệu điện ổn định cƣờng độ dịng điện khơng đổi, nồng độ gel cao khoảng thời gian chạy điện di phải nhiều, phân tách băng protein tốt rõ Từ kết chứng tỏ nồng độ gel từ 12% T – 14% T không ảnh hƣởng nhiều đến kết điện di Do chúng tơi định sử dụng gel 12% T để tiến hành điện di cho thí nghiệm sau nhằm tiết kiệm kinh phí a) b) c) Hình 4.3 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein khảo sát nồng độ gel a) Là hình điện di protein lúa gel có nồng độ 12% T b) Là hình điện di protein lúa gel có nồng độ 13% T c) Là hình điện di protein lúa gel có nồng độ 14% T 32 4.4 Đánh giá phản ứng lúa thuốc sinh học 4.4.1 Kết điện di tất mẫu protein 12 nghiệm thức Hình 4.4 Kết điện di so sánh mẫu protein nghiệm thức (nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 6) Hình 4.5 Kết điện di so sánh mẫu protein nghiệm thức (nghiệm thức 4, 5, 6, 7, 10 11) Hình 4.6 Kết điện di so sánh mẫu protein nghiệm thức (nghiệm thức 5, 8, 9, 10 12) 33 Từ kết điện di SDS- PAGE tất mẫu protein 12 nghiệm thức (hình 4.4, hình 4.5, hình 4.6) so sánh hình chúng tơi nhận thấy tất mẫu protein cho dải băng đồng hình Khơng có khác biệt dải băng đồng hình Có thể thuốc chƣa kịp tác động lên sinh trƣởng phát triển lúa thời gian tác đơng cịn (sau 72 giờ), thời điểm xử lý thuốc sớm (giai đoạn lúa lá) nên hệ protein lúa chƣa có biến đổi Ngồi với điều kiện trồng lúa dƣới ánh sáng đèn neon, phòng gây số hạn chế sinh trƣởng phát triển dẫn đến lúa hấp thu đƣợc thuốc Cũng không loại trừ khả phƣơng pháp SDS- PAGE chƣa đủ nhạy để phát khác biệt 4.4.2 Kết điện di mẫu protein lúa lô II Tiến hành điện di 12 mẫu protein lô 2, kết (hình 4.7) khơng tìm thấy khác biệt băng protein mẫu protein lúa đƣợc xử lý thuốc theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Các mẫu protein ly trích đƣợc lơ lúa cho kết dải băng protein đồng hình Điều xảy thời gian tác dụng thuốc không đủ, lúa chƣa kịp phản ứng với thuốc nên hệ protein lúa chƣa có thay đổi đáng kể Tuy nhiên có xảy thay đổi nhỏ hệ protein lúa khó để phát hiện: lƣợng protein khác biệt quan tâm q trình ly trích khơng nhận đƣợc, lƣợng protein q khơng thể phát nhuộm CBB Ngồi khơng loại trừ khả với phƣơng pháp SDS- PAGE chƣa đủ nhạy để phát khác biệt Hình 4.7 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lơ II Thực điện di nồng độ gel 12% T, hiệu điện ổn định 100V cường độ dòng điện 15 mA, thời gian điện di 120 phút 34 4.4.3 Kết điện di mẫu protein lúa lơ III Hình 3.8 Kết điện di SDS– PAGE mẫu protein ly trích từ lơ III 4.8 Thực điện di di nồng độ gel 12%điệnhiệuổn định 100V, cường 100V Thực điện nồng độ gel 12% T, hiệu T, điện ổn định độ cường dòng điện 15 mA, thời gian điện di 120 phút 120 phút độ dòng điện 15 mA, thời gian điện di Kết thu đƣợc hình 4.8 khơng cho khác biệt dù thí nghiệm ta tác dụng thuốc với liều lƣợng gấp đôi so với hƣớng dẫn nhà sản xuất Từ kết ta giải thích thời gian tác dụng thuốc chƣa đủ ảnh hƣởng lên sinh lý mạ Do thời gian ta tác dụng thuốc lấy mẫu ngắn, vòng 72 đồng hồ Ngoài với điều kiện trồng lúa phịng nhƣ khả hấp thụ thuốc khó xảy nhanh chóng sinh lý khơng bình thƣờng 35 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Trong đề tài chúng tơi hồn thành đƣợc số nội dung: Thiết lập đƣợc quy trình ly trích protein lúa Thiết lập đƣợc phƣơng pháp điện di SDS- PAGE mẫu protein lúa Ở điều kiện trồng lúa phòng với ánh sáng đèn neon, xử lý thuốc sinh học AMINO 15SL lên lúa thời gian từ – 72 chƣa tìm thấy khác biệt protein tổng số phân tích kỹ thuật SDS- PAGE 5.2 Đề nghị Tiếp tục thử nghiệm chế phẩm sinh học nhƣng tăng thời gian tác dụng thuốc tăng liều lƣợng thuốc Mở rộng thử nghiệm thuốc lúa đƣợc trồng nhà lƣới điều kiện thí nghiệm ngồi đồng ruộng để khẳng định rõ hiệu thuốc Tiếp tục nghiên cứu hệ protein lúa phƣơng pháp phân tích proteomics khác nhƣ điện di chiều, sắc kí 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Biện Tuấn An, 2006 Khảo sát hệ vi khuẩn methylobacterium sp lúa (oryza sativa L.) Tây Ninh Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Bùi Huy Đáp, 1999 Một số vấn đề lúa, NXB Nông Nghiệp Chu Lý Hải Anh, 2006 Khảo sát ảnh hưởng vi khuẩn methylobacterium sp lên phát sinh quan lúa (ozyra sativa L.) nuôi cấy in vitro Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Cơng nghệ Sinh học, Đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Lê Minh Triết, 2003 Bài Giảng Môn Học Cây Lúa Khoa Nông Học, Đại Học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương Pháp Cơ Bản Trong Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học Nhà xuất Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Thắng, 2004 Tài liệu hướng dẫn thực tập: Công Nghệ Enzyme Protein Viện Sinh Học Nhiệt Đới, TP Hồ Chí Minh Võ Tịng Xuân, Trần Thanh Bé, Nguyễn Ngọc Đệ, Dƣơng Ngọc Thành Đỗ Văn Xê, 1986 Trồng lúa suất cao Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh 83 trang TIẾNG NƢỚC NGOÀI Allen R C., Saravis C A and Maurer H R., 1984 Gel electrophoresis and Isoelectrics Focusing of protein: Selected Techniques De Gruyter, Berlin Davis B J., 1964 Disc electrophoresis II Method and appication to human serum proteins Ann N Y Acad Sci 121, 404 – 427 10 David E Garfin, Jay A Glasel and Murray P Deutscher, 1995 Introduction to Biophysical Methods for Protein and Nucleic Acid Research Electrophoretic Method pp 53 – 109 37 11 Department of health and ageing office of the gene technology regulator, 2005 The biology and ecology of rice (O sativa) in Australia 12 Hurkman and Tanaka, 1986 “Phenol extraction followed by methanolic ammonium acetate precipitation – an effective protocol for sample preparation from protein-poor, recalcitrant tissues such as plants” Plant Physiology, Vol 81, pp 802-806 13 IRRI, 2002 IRRI rice almanac, Third edition, Manila, Philippine, IRRI p 253 14 Laemmli U K., 1970 Cleavage of structural proteins during the asembly of the head of bacterio- phage T4 Nature London 227, 680 – 685 15 Nazrul Islam, Lonsdale M., Upadhyaya N.M., Higgins T J., Hirano H and Akhurst R., 2004 Protein extraction from mature rice leaves for twodimensional gel electrophoresis and its application in proteome analysis Proteomics, Vol 4, pp 1903-1908 16 Ornstein L., 1964 Disc electrophoresis I Background and theory Ann N Y Acad Sci 121, 321 – 349 17 Sambrook and Russell Molecular cloning-A laboratory manual Volume 2, 3rd edition, 2001 Cold spring harbor laboratory press, New York 18 Samuel S.M.Sun, 1994 Methods in plant molecular biology and agricultural biotechnology: a laboratory training manual Asian Vegetable Research and Development Center Shanhua, Tainan, Taiwan (ROC) 94 p 19 Scott A Young, Ailan Cuo, James A Cuikema, Frank F White, Jan E Leach, 1995 Department of Plant Pathology, Throckmorton Hall (S.A.Y., F.F.W., J.E.L.), and Division of Biological Sciences (J.A.G.), Kansas State University, Manhattan, Kansas 66506-5502; and Waksman Institute, Rutgers University, Piscataway, New Jersey 08855 (A.G.) 20 Woolley P., 1987 Thermal instability of electrophoresis gel Electrophoresis 8, 339 – 345 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bảng pha gel theo nồng độ khác Phần trăm gel 4% 5% 6% 7% 8% 9% 10% 11% 12% 13% 14% 15% 16% 17% Nƣớc khử ion (ml) 6.1 5.7 5.4 5.1 4.7 4.4 4.1 3.7 3.4 3.1 2.7 2.4 2.1 1.7 30% acrylamide/ bis (29:1) (ml) 1.3 1.7 2.0 2.3 2.7 3.0 3.3 3.7 4.0 4.3 4.7 5.0 5.3 5.7 *Đệm điện di (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10% w/v SDS (ml) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 * Đệm gel phân tách: 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 Đệm gel gom: 0,5 M Tris-HCL, pH 6,8 Phụ lục 2: Khoảng phân tách protein theo nồng độ gel polyacrylamide Acrylamide (%) Khoảng phân tách protein (kDa) 15 12 – 43 10 16 – 68 7,5 36 – 94 5,0 57 – 212 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐIỆN DI PROTEIN SDS? ?? PAGE VÀ ỨNG DỤNG ĐÁNH GIÁ PHẢN ỨNG CỦA CÂY LÚA ĐỐI VỚI... SDS? ?? PAGE áp dụng protein lúa Quy trình trải qua giai đoạn: Chuẩn bị mẫu lúa Ly trích protein lúa Điện di SDS? ?? PAGE mẫu protein ly trích đƣợc từ lúa Tóm lại, đề tài thiết lập đƣợc quy trình SDS? ??... ứng dụng sinh học phân tử Trong phạm vi cho phép chúng tơi thực đề tài: ? ?Thiết lập quy trình điện di protein SDS- PAGE ứng dụng đánh giá phản ứng lúa thuốc sinh học kích kháng” 1.2 Mục đích Thiết