ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ NGỌC ÁNH ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG TRITERPEN GLYCOSID TỔNG SỐ TRONG RAU ĐẮNG BIỂN (Bacopa monnieri) THU HÁI TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn hồn thành Khoa hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu hướng dẫn TS Nguyễn Thị Phương TS Nguyễn Thị Thanh Bình Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Phương TS Nguyễn Thị Thanh Bình, PGS TS Nguyễn Hữu Tùng người trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, ln động viên khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dược liệu, PGS.TS Phương Thiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu) toàn thể anh chị, bạn bè, cán bộ, nhân viên Khóa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt anh Nguyễn Đình Qn – người ln theo sát, hướng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô Khoa Y-Dược dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em suốt năm năm theo học trường Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ, động viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Cuối em xin kính chúc thầy ln mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc sống Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Ánh DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội nhà Hóa phân Chemists tích AOAC HPLC HPLCPDA High performance liquid chromatography High performance liquid chromatography photodiode array detetion Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lỏng hiệu cao ghép nối detector mảng iod R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối TLTK Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Cấu trúc số hợp chất saponin glycosid có aglycon jujubogenin Rau đắng biển Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 1.4 Cấu trúc số hợp chất saponin glycosid có aglycon pseudojujubogenin Rau đắng biển Cấu trúc số hợp chất cucurbitacin Một số phương pháp định lượng triterpen glycosid Rau đắng biển 15 Bảng 2.1 Danh sách mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập 19 Bảng 3.1 Chương trình gradient 28 Bảng 3.2 Thời gian lưu tương đối bacosid 29 Bảng 3.3 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống 30 Bảng 3.4 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích píc bacosid A3 32 Bảng 3.5 Kết đánh giá độ lặp lại 32 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ đúng phương pháp 33 Bảng 3.7 Hàm lượng tryterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) dược liệu Rau đắng biển thu hái Việt Nam 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Hình ảnh hoa Rau đắng biển Hình 1.2 Cấu trúc Luteolin Apigenin Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu cao 11 Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích Rau đắng biển 28 Hình 3.2 Vị trí píc bacosid Rau đắng biển 29 Hình 3.3 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc phương pháp 31 Hình 3.4 So sánh phổ UV bacosid A3 mẫu thử mẫu chuẩn 31 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Rau đắng biển 1.1.1 Vị trí, phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Một số tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan phương pháp HPLC 10 1.2.1 Nguyên tắc hoạt động 10 1.2.2 Cấu tạo HPLC 10 1.3 Những nghiên cứu định lượng hàm lượng triterpen glycosid tổng số Rau đắng biển 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 22 2.2.1 Chất chuẩn 22 2.2.2 Hóa chất 22 2.2.3 Thiết bị 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 23 2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng bacosid tổng số Rau đắng biển 23 2.3.3 Áp dụng số mẫu dược liệu Rau đắng biển 25 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ 27 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích quy trình xử lý mẫu 27 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 30 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống 30 3.2.2 Tính chọn lọc phương pháp 30 3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn 31 3.2.4 Độ lặp lại 32 3.2.5 Độ đúng 33 3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) Rau đắng biển 34 CHƯƠNG BÀN LUẬN 36 4.1 Về thu thập mẫu dược liệu 36 4.2 Về xây dựng phương pháp định lượng 36 4.3 Về kết định lượng triterpen glycosid tổng số mẫu Rau đắng biển 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Rau đắng biển (Bacopa monnieri) loại thảo dược vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích thần kinh, trợ tim, nhiệt, giải độc, lợi tiểu, tiêu thũng, nhuận tràng [11, 13, 24, 26] Ngày nay, việc sử dung rau đắng biển loại thức ăn, rau đắng biển sử dụng vị thuốc thang thuốc sắc, dịch ép tươi, tán bột sau phơi khơ Ngồi ra, thị trường Việt Nam có số chế phẩm đông dược sản xuất từ vị thuốc như: Hoạt huyết bổ máu Đại Bắc, thông huyết Tuệ Linh, chế phẩm phối hợp Ginkgo Giloba 6000 mg Brahmi 3000 mg, … Các nghiên cứu nước cho thấy tác dụng bật rau đắng biển hệ thần kinh giúp cải thiện trí nhớ, tăng cường khả nhận thức, học hỏi nhờ vào hoạt chất triterpen glycosid với loại có rau đắng biển gồm: bacopasid I, bacosid A3, bacopasid II, bacopasid X Bacopasaponin C [13, 21, 23, 26] Hiện nay, nước ta việc đánh giá hàm lượng triterpen glycosid rau đắng biển chưa tiêu chuẩn hóa Hơn nữa, dược điển Việt Nam V chưa đề cập đến dược liệu rau đắng biển thành phần hóa học dược liệu Do đó, việc định lượng hàm lượng triterpen glycosid rau đắng biển cần thiết Theo Dược điển Mỹ (USP 40), chất chuẩn bacosid A3 sử dụng để xây dựng quy trình chiết xuất định lượng tổng loại triterpen glycosid chiếm hàm lượng chủ yếu Rau đắng biển [41] Vì vậy, tiến hành thực công việc “Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái Việt Nam phương pháp HPLC” với mục tiêu: - Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) phương pháp HPLC - Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) mẫu dược liệu Rau đắng biển thu thập số tỉnh Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Rau đắng biển 1.1.1 Vị trí, phân loại Vị trí phân loại lồi Bacopa monnieri hệ thống phân loại thực vật học: Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta); Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida); Bộ: Hoa Môi (Lamiales); Họ: Hoa Mõm Chó (Scrophulariaceae); Chi: Bacopa; Lồi: Monnieri (L.); [45] Rau đắng biển có tên khoa học Bacopa monnieri (L.) Pennell., thuộc họ Hoa mõm chó (Scrophulariaccae), chi Rau đắng biển (Bacopa), có tên khoa học đồng nghĩa khác Herpestis monnieri (L.) Rothm Ở Việt Nam, Rau đắng biển gọi rau Sam trắng, Sam trắng [1, 10] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Cây thảo, sống lâu năm, cao 10-20 cm Thân nhẵn, phần gốc mọc bò, bén rễ mấu, phần mọc đứng Thân có vị đắng Lá mọc đối, khơng cuống, hình trái xoan, mọng nước, dài 0,8-1,2 cm, rộng 3-5 mm, gốc thn, đầu tù, hai mặt nhẵn Lá có màu xanh đậm mặt, xanh nhạt mặt dưới, gân chính, gân phụ khơng rõ Hoa màu trắng, mọc đơn độc kẽ cuống dài Hoa khơng đều, lưỡng tính mẫu Cuống hoa dài 2,6-5,6 cm, khơng lơng, hai bắc hình dải, dài 0,6 cm, đỉnh cuống hoa Bao hoa: năm đài rời, khơng đều, đài sau to nhất, hình trứng, có năm gân chính, dài 0,8 cm, rộng 0,5 cm, hai đài trước hình trứng, mũi nhọn, gân chính, dài 0,7 cm, rộng 0,4 cm, hai đài bên nhỏ nhất, hình dải, gân, có lơng bìa, dài 0,6 cm, rộng 0,1 cm Năm đài khơng đều, cao 5-6 mm, năm cánh hoa có màu tím nhạt, dính thành ống Bốn nhị, bầu khơng lơng Quả nang hình trứng, nhẵn, có đài cịn lại, hạt nhỏ, có góc cạnh Hạt nhiều, nhỏ, mùa hoa tháng 4-9 [6, 8, 10] Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng 10,0 mg bacosid A3 vào bình định mức ml Thêm ml dung dịch methanol, lắc Bổ sung dung dịch đến vạch Tiến hành pha loãng thu dung dịch chuẩn bacosid A3 có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml Phương pháp đánh giá thẩm định theo tiêu chí AOAC về: độ thích hợp hệ thống (các giá trị RSD đề nhỏ 2%); độ lặp lại (RSD (%) nhỏ 1,5 %); độ thu hồi (đều nằm khoảng 92 – 105%); đường chuẩn khoảng tuyến tính (các giá trị R2 lớn 0,99) Áp dụng phương pháp 23 mẫu Rau đắng biển cho thấy cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) mẫu Rau đắng biển nằm khoảng từ 1,89 – 5,74% Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu Thanh hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) cao (5,74 ± 0,03) Đề xuất - Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (tính theo bacosid A3) thời điểm thu hái khác vùng khác 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Tiến Bân (Chủ Biên) (2003&2006), Danh lục loài thực vật Việt Nam, 3, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ Hà Nội Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học Bộ Y Tế (2012), Hóa phân tích, 2, Nhà xuất Y học Hà Nội Hồng Minh Châu (2002), Cơ sở hóa học phân tích, Nhà xuất Khoa học Kỹ Thuật Quách Thị Lê Hà (2011), Triển khai mơ hình đánh giá tác dụng thuốc chống trầm cảm tế bào thần kinh vỏ não phôi thai chuột cống nuôi cấy dòng tế bào NG 108-15 Viện Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ Nguyễn Thị Thu Hương (2006), "Tác dụng chống oxy hóa in vitro rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst, Scrophulariaceae)", Tạp chí dược liệu Đỗ Tất Lợi (2006), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Trần Trung Nghĩa, Nguyễn Văn Tài,Lê Hùng Tiến (2017), "Xây dựng phương pháp định lượng Bacoside rau đắng biển Bacopa monnieri (L.) Wettst HPLC tuyển chọn mẫu giống rau đắng biển có hàm lượng Bacoside cao", Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ 4(9), tr 86-92 10 Viện Dược Liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, 2, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Tài liệu Tiếng Anh 11 Aiyalu Rajasekaran, Nagulsamy Sarathikumar (2014), "Simultaneous Estimation of Luteolin and Apigenin in Methanol Leaf Extract of Bacopa monnieri Linn by HPLC", British Journal of Pharmaceutical Research 4(13), pp 1629-1637 12 Anju Varshney, Sunita Shailajan,Naresh Chandra (2011), "Estimation of flavonoid-luteolin in different plant parts of Bacopa monnieri (L.) Wettst by using HPTLC method", Analytical Chemistry: An Indian Journal 11(1) 13 Bhattacharya SK,Ghosal S (1998), "Anxiolytic activity of a standardized extract of Bacopa monniera: an experimental study", Phytomedicine, 5(2), pp 77-82 14 Bailey Kr,Crawley Jn (2001), "Methods of behavior analysis in neuroscience ", Chemical Rubber Company press, 2nd edition 15 Bhandari Pamita, Sendri Nitisha,Devidas Shinde Bhagatsing (2020), "Dammarane triterpenoid glycosides in Bacopa monnieri: A review on chemical diversity and bioactivity", Phytochemistry, 172, pp 112276 16 Bose KC, Bose NK (1931), "Observations on the actions and uses of Herpestis monniera", Journal of the Indian Medical Association, 1, pp 60 17 Chakravarty AK, Garai S, Masuda K, Nakane T,Kawahara N (2003), "Bacopasides III-V: three new triterpenoid glycosides from Bacopa monniera", Chem Pharm Bull (Tokyo), 51(2), pp 215-7 18 Chakravarty AK, Sarkar T, Masuda K, Shiojima K, Nakane T,Kawahara N (2001), "Bacopaside I and II: two pseudojujubogenin glycosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 58(4), pp 553-6 19 Chen Yun-Bo,Lai Shi-Long (2005), "Effects of drug serum in broken bushen yizhi formulas on cell model of Alzheimer disease", Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, pp 250-253 20 Chia-Chung Hou, Shwu-Jiuan Lin,Juei-Tang Cheng (2002), "Bacopaside III, Bacopasaponin G, and Bacopasides A, B, and C from Bacopa monniera", journal of Natural Products, 65(12), pp 1759-1763 21 Chillara Sivaramakrishna, Chillara Vrao,Golakoti Trimurtulu (2005), "Triterpenoid glycosides from Bacopa monnieri", Phytochemistry, 66(23), pp 2719-2728 22 Chopra RN, Nayar SL,Chopra IC (1956), Glossary of Indian Medicinal Plants, 32 23 Harvey D (2000), Modern analytical chemistry, McGraw-Hill New York 24 Jain P, Kulshreshtha DK (1993), "Bacoside A1, A minor saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 33(2), pp 449-451 25 Kumar N, Abichandani LG, Thawani V,Gharpure KJ (2016), "Efficacy of Standardized Extract of Bacopa monnieri (Bacognize(R)) on Cognitive Functions of Medical Students: A Six-Week, Randomized Placebo-Controlled Trial", Evid Based Complement Alternat Med, 2016, pp 4103423 26 Nanteetip Limpeanchob, Somkiet Jaipan (2008), "Neuroprotective effect of Bacopa monnieri on beta-amyloid-induced cell death in primary cortical culture", Journal of Ethnopharmacology, 120(1), pp 112-117 27 Nimisha Pulikkal Sukumaran,Augustine Amalraj (2019), "Neuropharmacological and cognitive effects of Bacopa monnieri (L.) Wettst – A review on its mechanistic aspects", Complementary Therapies in Medicine, 44, pp 68-82 28 Pamita Bhandari, Neeraj Kumar,Bikram Singh (2007), "Cucurbitacins from Bacopa monnieri", Phytochemistry, 68(9), pp 1248-1254 29 Ramawat Kg, Mérillon Jm (2008), Bioactive Molecules and Medicinal Plants, Springer 30 Saraswati Garai, Shashi B Mahato (1996), "Bacopasaponin D-A pseudojujubogenin glycoside from Bacopa monniera", Phytochemistry, 43(2), pp 447-449 31 Shashi B Mahato,Saraswati Garai (2000), "Bacopasaponins E and F: two jujubogenin bisdesmosides from Bacopa monniera", Phytochemistry, 53(6), pp 711-714 32 Stough C, Lloyd J, Clarke J, Downey L, Hutchison C,Rodgers (2001), "The chronic effects of an extract of Bacopa monniera (Brahmi) on cognitive function in healthy human subjects", Psychopharmacology, 156, pp 481-484 33 Steven Roodenrys,Dianne Booth Msc (2002), "Chronic Effects of Brahmi (Bacopa monnieri) on Human Memory", Neuropsychopharmacology, 27, pp 279-281 34 Subha Rastogi, Dinesh K Kulshreshtha (1998), "Bacoside A2-A triterpenoid saponin from Bacopa monnieri", Indian Journal of Chemistry, 38B, pp 353356 35 Subha Rastogi, Raghwendra Pal, Dinesh K (1994), "Bacoside A3, A triterpenoid saponin from Bacopa monniera", Phytochemistry, 36(1), pp 133137 36 The British Pharmacopoeia Commission Secretariat of the Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (Mhra) (2016), British Pharmacopoeia, The Stationery Office 37 The United States Pharmacopeial Concention (2015), The United State Pharmacopeia 38 NF 33 Second Supplement, Rockville, Maryland: United States Pharmacoperial Convention 38 The United States Pharmacopeial Convention (2018), The United State Pharmacopeia 40 NF 35 Second Supplement, Rockville, Maryland : United States Pharmacopeial Convention 39 Tripathi YB, Chaurasia S, Tripathi E, Upadhyay A, Dubey GP (1996), "Bacopa monniera Linn as an antioxidant: mechanism of action", Indian J Exp Biol, 34(6), pp 523-6 40 Watoo Phrompittayarat, Sakchai Wittaya-Areekul, Kanchalee Jetiyanon (2007), "Determinationof Saponin Glycosides in Bacopa monnieri by Reversed Phase High PerformanceLiquid Chromatography ", Thai Pharmaceutical and Health Science Journal, 2(1), pp 26-32 41 Yun Zhou, Yun-Heng Shen, Chuan Zhang, Juan Su (2007), "Triterpene Saponins from Bacopa monnieri and Their Antidepressant Effects in Two Mice Models", Journal of Natural Products, 70(4), pp 652-655 Webside 42 https://doctors24h.vn/cay-rau-dang.html 43 https://www.thuocbietduoc.com.vn/thuoc-goc-2718/rau-dang-bien.aspx 44 https://duocthu.com/hplc-dung-de-lam-gi/hplc-2/#prettyPhoto 45 https://plants.usda.gov/core/profile?symbol=XAST PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ CÁC MẪU DƯỢC LIỆU RAU ĐẮNG BIỂN RDB-1 RDB-2 RDB-3a RDB-3b RDB-4a RDB-4b RDB-5a RDB-5b RDB-6a RDB-6b RDB-7a RDB-8a RDB-8b RDB-9a RDB-9b RDB-10a RDB-10b RDB-10c RDB-10d RDB-11a ... glycosid chiếm hàm lượng chủ yếu Rau đắng biển [41] Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực cơng việc ? ?Đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số Rau đắng biển (Bacopa monnieri) thu hái Việt Nam phương... phương pháp đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo bacosid A3) Rau đắng biển Áp dụng phương pháp xây dựng, tiến hành đánh giá hàm lượng triterpen glycosid tổng số (Tính theo... thu cho thấy hàm lượng triterpen glycosid tổng (tính theo bacosid A3) mẫu Rau đắng biển nằm khoảng từ 1,89 – 5,74% Trong đó, mẫu Rau đắng biển thu Thanh Hóa cho hàm lượng triterpen glycosid tổng