Đang tải... (xem toàn văn)
Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGÔ QUANG HƢỞNG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƢƠNG) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGÔ QUANG HƢỞNG ThS. PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** STUDYING GENETIC DEVERSITY OF Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei POPULATION, DESTRUCTIVE FUNGAL PATHOGEN OF Hevea brasiliensis Muell. Arg. AT LAI KHE (BEN CAT – BINH DUONG), WAS CARRIED OUT BY USING RFLP – PCR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. BUI CACH TUYEN NGO QUANG HUONG MSc. PHAN THANH DUNG Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS. Bùi Cách Tuyến - hiệu trưởng trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. ThS. Phan Thành Dũng - trưởng Bộ môn bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu cao su Việt Nam. Đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. - Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . - KS. Nguyễn Ngọc Mai, KS. Vũ Thị Quỳnh Chi cùng tập thể cô chú, anh chị làm việc tại Bộ môn bảo vệ thực vật - Viện nghiên cứu cao su Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên và ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. - ThS. Nguyễn Văn Cường cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm phân tích thí nghiệm hoá sinh - Đại học Nông Lâm TP. HCM đã giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt khóa luận . Tập thể các bạn sinh viên lớp Công nghệ sinh học 28 - Trường ĐH. Nông Lâm TP. HCM đã luôn ở bên tôi những lúc khó khăn, cùng tôi chia sẽ vui buồn trong quá trình học và quá trình thực hiện khóa luận. Và đặc biệt con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dƣỡng dục con nên ngƣời, để Con đƣợc nhƣ ngày hôm nay. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006. Sinh viên Ngô Quang Hưởng. TÓM TẮT NGÔ QUANG HƢỞNG, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến ThS. Phan Thành Dũng Thời gian thực hiện từ tháng 2/2006 đến tháng 8/2006, tại Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam, Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá – Sinh, trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Vấn đề bảo vệ thực vật luôn nhận được sự quan tâm rất lớn của toàn xã hội. Đối với một nước sản xuất cao su thiên nhiên như Việt Nam, những nghiên cứu về vi sinh vật, côn trùng, sâu hại trên cây cao su là vô cùng cấp thiết. Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola gây ra là một bệnh mới và vô cùng nguy hiểm. Nó gây ra những thiệt hại rất lớn về kinh tế. Để tạo những tiền đề cho các nghiên cứu về loại bệnh này, chúng tôi sử dụng phương pháp RFLP – PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương. Nôi dung nghiên cứu: - Phân lập và tách đơn bào tử các dòng nấm Corynespora cassiicola. - Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng ITS bằng 2 primer ITS A và ITS B. - Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR thu được. Các kết quả đạt được: - Phân lập được 65 dòng nấm và tách đơn bào tử 24 dòng nấm C. cassiicolai trên các dòng vô tính cao su khác nhau. - Dùng PCR khuếch đại được vùng gene nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, với kích thước là 540 bp. - Phân cắt sản phẩm PCR với 7 loại enzyme cắt là Hae III, Sau3A I, EcoR I, Nde II, Cfo I, Rsa I, Alu I. Kết quả là không tìm thấy băng đa hình khi cắt bằng 7 loại enzyme trên. Việc sử dụng kỹ thuật RFLP – PCR để phân tích đa dạng di truyền nấm C. cassiicola chưa cho kết quả như mong muốn. Không tìm thấy bất cứ sự khác biệt nào khi phân cắt bằng 7 loại enzyme trên. Do đó, cần có những nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự để có những kết luận chính xác về mức độ đa dạng di truyền của quần thể nấm này. MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt . iv Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt x Danh sách các bảng xi Danh sách các hình . xii 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu . 2 1.2.1. Mục đích . 2 1.2.2. Yêu cầu . 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1. Giới thiệu về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg . 3 2.1.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg trên thế giới và tại Việt Nam . 3 2.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ, lượng mưa, tốc độ gió đến sự phát triển của cây cao su . 4 2.1.3. Tình hình bệnh hại trên cây cao su 5 2.2. Giới thiệu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 6 2.2.1. Lịch sử phát hiện nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt. ) Wei . 6 2.2.2. Đặc điểm phân loại học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 6 2.2.3. Hình thái học và đặc tính sinh học của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 7 2.2.4. Phạm vi ký chủ, phạm vi phân bố và triệu chứng của bệnh rụng lá Corynespora 8 2.2.5. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora ở các nước trồng nhiều cao su trên thế giới . 9 2.3. Giới thiệu về phản ứng PCR (polymerase chain reaction) 10 2.3.1. Sơ lược về kỹ thuật PCR 10 2.3.2. Thành phần phản ứng PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng PCR . 10 2.3.3.1. DNA mẫu . 10 2.3.3.2. Primer và nhiệt độ lai . 11 2.3.3.3. Enzyme . 12 2.3.3.4. Mg2+ . 12 2.3.3.5. dNTPs . 12 2.3.3.6. Số lượng chu kỳ . 12 2.3.3.7. Nhiệt độ và pH . 13 2.3.3.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR 13 2.3.4. Các bước thực hiện một phản ứng PCR . 13 2.3.5. Ưu và nhược điểm của phản ứng PCR . 14 2.3.6. Ứng dụng của kỹ thuật PCR . 14 2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP 15 2.4.1. Sơ lược về enzyme cắt giới hạn . 15 2.4.1.1. Giới thiệu chung . 15 2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn 15 2.4.1.3. Các loại RE 16 2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE . 17 2.4.2. Sơ lược về phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction) . 17 2.4.2.1. Giới thiệu chung . 17 2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP 17 2.4.2.3. Sơ lược về kỹ thuật RFLP – PCR 18 2.6. Giới thiệu về vùng ITS . 19 2.7. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nước và ngoài nước . 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 22 3.1.1. Thời gian . 22 3.1.2. Địa điểm 22 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu . 22 3.2. Nội dung nghiên cứu 22 3.3. Vật liệu và phương pháp 22 3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối 22 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 22 3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu . 23 3.3.1.3. Phương pháp phân lập nấm 23 3.3.1.4. Phương pháp tách đơn bào tử . 23 3.3.1.5. Phương pháp nhân sinh khối 24 3.3.2. Phương pháp tách chiết DNA của nấm . 24 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm . 24 3.3.2.2. Phương pháp tách chiết DNA 24 3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di 25 3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích . 25 3.3.2. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR . 26 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm . 26 3.3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR . 26 3.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di . 27 3.3.3. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei . 28 3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 28 3.3.3.2. Thực hiện phân tích RFLP 28 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số dòng vô tính cao su . 29 4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora . 29 4.1.2. Kết quả phân lập 32 4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử . 32 4.1.4. Kết quả nhân sinh khối 35 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm . 36 4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR 37 4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola 40 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ . 46 5.1. Kết luận 46 5.2. Đề nghị . 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 7. PHỤ LỤC . 52 [...]... để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 42 dòng nấm C cassiicola khác nhau và đã phân thành 5 chủng nấm khác nhau và đã xếp chúng vào 3 nhóm di truyền Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa hình của các dòng nấm Năm 2003, Safiah Atan và Noor Hisham Hamid đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 9 dòng nấm. .. thực hiện đề tài: Phân tích đa dạng di truyền quần thể nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell Arg) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dƣơng) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR” 1.2 Mục đích yêu cầu - Phân lập thành công các dòng nấm gây bệnh trên các dòng vô tính cây cao su khác nhau - Đánh giá được sự sai khác về mặt di truyền của một số dòng nấm Corynespora... Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM 3.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá của các dòng vô tính cao su có triệu chứng bệnh rụng lá Corynespora 3.2 Nội dung nghiên cứu 1 Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola 2 Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS 3 Phân tích đa dạng di truyền của nấm C cassiicola bằng kỹ thuật RFLP – PCR 3.3 Vật liệu và phƣơng pháp 3.3.1 Phân. .. nghiên cứu bằng RAPD Kết quả phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR cho thấy không có sự sai khác đáng kể nào trong 9 dòng nấm được nghiên cứu Năm 1998, Silva và cộng sự đã dùng kỹ thuật RAPD và phân tích RFLP trên vùng ITS của 32 dòng nấm Ông không tìm thấy sự đa hình nào khi nghiên cứu bằng kỹ thuật RFLP –PCR, còn với kỹ thuật RAPD đã phân 32 dòng nấm này thành 7 nhóm di truyền PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG... sự đa dạng di truyền của nhiều loài nấm (Carbone và Kohn, 1993; Hallenberg và cộng sự, 1996; Hirata và Takamatsu, 1996) Năm 1996, Edel và cộng sự tiến hành phân tích RFLP trên vùng ITS và đã tìm ra một vài sự khác biệt trên nấm Fusarium oxysporum Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều kỹ thuật như PCR, RFLP, DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga và cộng sự, 1997) Đối với các loài nấm, ... sự, 1998) Hiện nay, ở Việt Nam những nghiên cứu về nấm C cassiicola là chưa nhiều Ngoài những nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh còn có các nghiên cứu về khả năng kháng bệnh này của một số dòng vô tính cao su Vũ Thị Quỳnh Chi (2005) đã sử dụng các enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III, Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền trên 7 dòng nấm C cassiicola (RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5,... translation hay random priming… Khi kỹ thuật PCR ra đời việc tạo mẫu dò đơn giản hơn nhiều, đồng thời có thể sản xuất một số lượng lớn mẫu dò - Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA - Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền - Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh Kỹ thuật PCR rất nhạy, do đó với một hay nhiều cặp primer ta có thể xác định được sinh vật gây bệnh thông qua các đặc trưng về hệ gene của chúng (Nguyễn Văn Uyển,... thấy sự đa hình nào khi cắt bằng các enzyme giới hạn trên Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về loại nấm này Đa số các nghiên cứu đều tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh… của chúng Kết quả các nghiên cứu này đã chứng minh đây là một loài nấm nguy hiểm, có khả năng bùng phát trên di n rộng Ngoài khả năng sinh độc tố, nấm này còn có khả năng tổng hợp enzyme phân. .. như các nấm khác, bào tử nấm Corynespora có khả năng tồn tại lâu trong vết bệnh cũng như trong đất mà vẫn giữ được khả năng gây bệnh Hình 2.1: Hình dạng bào tử nấm C cassiicola (Nguồn: http://www-ang.kfunigraz.ac.at) Đây là loại nấm sinh độc tố cassiicoline gây rụng lá rất nhanh Nấm Corynespora cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới của lá qua lớp biểu bì và khí khổng Trái với ngoài tự nhiên, nấm này... ta phân loại chủ yếu dựa trên những đặc điểm về hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả thường có độ tin cậy không cao Với việc phát triển các kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử trên vùng ITS, người ta có thể phân loại các dòng nấm một cách rất chính xác Năm 1996, Boysen và cộng sự đã sử dụng PCR trên vùng ITS1, ITS2 của nấm Rhizoctonia solani để phân . RFLP – PCR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola tại Lai Khê, Bến Cát, tỉnh Bình Dương. Nôi dung nghiên cứu: - Phân lập và. NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH
