ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ NGUYỄN HỒNG ÂN CỐ ĐỊNH ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ NGÀNH : 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2009 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm 2009 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc Tp HCM, ngày tháng năm 2009 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Nguyễn Hồng Ân Giới tính: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 21-04-1983 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh Chun ngành: Cơng nghệ sinh học MSHV: 03106662 Khố (năm trúng tuyển): 2006 I- TÊN ĐỀ TÀI CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xác định số điều kiện dinh dưỡng thích hợp Acetobacter aceti lên men acid acetic - So sánh hiệu tạo acid acetic trình lên men theo mẻ chế độ lắc chế độ tĩnh - Tạo chế phẩm Acetobacter aceti cố định chất mang cellulose vi khuẩn điều kiện cố định tối ưu - Xác định chế độ tối ưu để bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định chất mang cellulose vi khuẩn - Ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định chất mang cellulose vi khuẩn hệ thống lên men acid acetic liên tục III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng chuyên ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG LỜI CÁM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Cô đồng hành em thời gian thực đề tài, lúc em gặp khó khăn Em vơ q trọng nhiệt tình hi sinh Cơ dành cho em để em hồn thành luận văn Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG tạo điều kiện cho em thực luận văn Em xin chân thành cám ơn Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học tận tình giúp đỡ, quan tâm dẫn tạo điều kiện tốt thời gian em thực luận văn Tôi xin gửi lời cám ơn đến tất bạn học viên Cao học khóa 2006, khóa 2007, bạn sinh viên trường Đại học Dân lập Kỹ thuật Công nghệ chia sẻ buồn vui tơi khóa học thời gian làm luận văn Đặc biệt cám ơn hai em Minh Mi chia cho anh lời khuyên kinh nghiệm quý báu Tôi xin cám ơn bạn thân đồng nghiệp bên cạnh tơi lúc tơi gặp khó khăn để động viên tinh thần cho tơi sớm hồn thành luận văn Con xin cảm ơn Bố Mẹ em Bi chỗ dựa vững để an tâm làm việc hồn thành luận văn Gia đình ln động lực lớn giúp phấn đấu sống Tp.HCM, ngày 01 tháng năm 2009 LÊ NGUYỄN HỒNG ÂN TÓM TẮT Acid acetic loại hóa chất cơng nghiệp ứng dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm, tổng hợp chất dẻo tơ sợi, chế biến mủ cao su, sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ…Để nâng cao nồng độ acid acetic, luận văn có sử dụng phương pháp cố định Acetobacter aceti lên chất mang cellulose vi khuẩn hệ thống lên men liên tục Các kết nghiên cứu đạt sau: − Điều kiện dinh dưỡng thích hợp lên men acid acetic Acetobacter aceti: nồng độ sulfate amon 0.2%, nồng độ ethanol 0.3% nồng độ acid acetic bổ sung ban đầu 0.5% − Trong thí nghiệm khảo sát lên men theo mẻ, chế độ lắc tạo nồng độ acid acetic cao nồng độ acid acetic tạo chế độ tĩnh Thời gian lên men để nồng độ acid acetic đạt giá trị cao (7.03%) ngày − Tạo chế phẩm Acetobacter aceti cố định cellulose vi khuẩn điều kiện tối ưu lắc 250 vòng/phút 35oC Chế phẩm Acetobacter aceti cố định cellulose vi khuẩn bảo quản nhiệt độ mát (5 – 10oC) giữ chất lượng, mật độ tế bào sống đạt 94.6% so với ban đầu − Khi tiến hành ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định cellulose vi khuẩn hệ thống lên men liên tục, xác định tốc độ pha loãng tối ưu cho hệ thống lên men liên tục 0.008 (1/h); hệ thống lên men liên tục hoạt động ổn định thời gian theo dõi, đạt nồng độ acid acetic 7.5%; không phát thấy tế bào rửa trôi chế phẩm Acetobacter aceti cố định cellulose vi khuẩn trình lên men liên tục ABSTRACT Acetic acid is an important industrial chemical It is widely used in the foodstuff industry, the synthesis of fibrous plastic and the manufacture of rubber latex, colourant, organic solven… In this thesis, with the aim of increasing the acetic acid concentration, the immobilization of Acetobacter aceti cells in the bacterial cellulose and the continuous fermentation system are applied The results are given as following: − The nutritional conditions suitable for Acetobacter aceti in the acetic acid fermentation include: the sulfate amon concentration of 0.2 percent, the ethanol concentration of 0.3 percent and the supplied acetic acid concentration of 0.5 percent − Each day of batch fermentation, the fermentation with shaking condition makes the acetic acid concentration higher than the acetic acid concentration made form the stable fermentation The fermentation time to get high acetic acid concentration (7.03%) is determined as days − The product of Acetobacter aceti cells immobilizated in bacterial cellulose carrier is optimally created in the shaking condition of 250 rpm and at 35oC Its preservation at the cool temprature (5 – 10oC) still remains the quality, the density of live cells is 94.6% in comparision with the initial product − The product of Acetobacter aceti cells immobilizated in bacterial cellulose carrier is applied in the continuous fermentation system The optimal speed of dilution is determined as 0.008(1/h) The continuous fermentation system works stably in observation time and gets the acetic acid concentration of 7.5 percent Acetobacter aceti cells in bacterial cellulose carrier may not be wash-out in the continuous fermentation process i MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU - CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 1.1 Đặc điểm acid acetic 1.2 Tác nhân vi sinh vật 1.3 Bản chất sinh hóa q trình lên men acetic -10 1.4 Các điều kiện ảnh hưởng đến trình lên men acetic 11 1.5 Các phương pháp sản xuất acid acetic -13 1.6 Cố định tế bào vi sinh vật 17 1.7 Hệ thống lên men 28 1.8 Các nghiên cứu tế bào vi sinh vật cố định sản xuất acid acetic 33 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Vật liệu hóa chất -40 2.2 Phương pháp nghiên cứu 42 2.2.1 Khảo sát số đặc điểm sinh học giống 42 2.2.2 Khảo sát số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến lên men acid acetic Acetobacter aceti 44 2.2.3 Khảo sát khả tạo acid acetic điều kiện lên men theo mẻ -44 2.2.4 Khảo sát điều kiện tối ưu để tạo chế phẩm Acetobacter aceti cố định lên chất mang BC -44 2.2.5 Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định BC 45 2.2.6 Ứng dụng chế phẩm A aceti cố định hệ thống lên men liên tục 45 2.2.7 Các phương pháp phân tích 46 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN -50 3.1 Khảo sát số đặc điểm sinh học Acetobacter aceti 51 3.2 Khảo sát số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến lên men acid acetic Acetobacter aceti 56 ii 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ sulfate amon -56 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol 58 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid acetic ban đầu 60 3.3 Khảo sát khả tạo acid acetic điều kiện lên men theo mẻ -63 3.4 Khảo sát điều kiện tối ưu để cố định chủng A aceti lên chất mang BC 65 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng chế độ lắc đến mật độ tế bào hấp phụ lên chất mang BC theo thời gian 65 3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến mật độ tế bào hấp phụ lên chất mang BC theo thời gian 67 3.5 Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định 69 3.6 Ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định chất mang BC hệ thống lên men liên tục 71 3.6.1 Xác định tốc độ pha lỗng tối ưu cho q trình lên men -73 3.6.2 Kiểm tra tính ổn định hệ thống lên men liên tục -76 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ -79 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Vi khuẩn Acetobacter aceti kính hiển vi điện tử .9 Hình 1.2 Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic 10 Hình 1.3 Hình chụp kính hiển vi điện tử quét màng BC 20 Hình 1.4 Các liên kết hydro cellulose 20 Hình 1.5 Lớp màng BC hình thành điều kiện ni cấy tĩnh .21 Hình 1.6 Các hạt BC hình thành điều kiện ni cấy lắc .22 Hình 1.7 Phương pháp cố định vi sinh vật bề mặt chất mang 25 Hình 1.8 Phương pháp cố định vi sinh vật lòng chất mang 26 Hình 1.9 Fermenter làm việc liên tục 29 Hình 3.1 Khuẩn lạc A aceti sau ngày ni cấy mơi trường thạch đĩa 51 Hình 3.2 A aceti sau ngày nuôi cấy môi trường thạch đứng 51 Hình 3.3 Hình dạng cách xếp tế bào A aceti kính hiển vi 52 Hình 3.4 Phản ứng dương tính thử với FeCl3 52 Hình 3.5 Bình nhân giống khảo sát đường cong sinh trưởng 54 Hình 3.6 Đường cong sinh trưởng chủng Acetobacter aceti 55 Hình 3.7 Bình lên men tĩnh 63 Hình 3.8 Bình ni cấy cho thí nghiệm cố định tế bào 65 Hình 3.9 Hệ thống lên men acid acetic liên tục .71 Hình 3.10 Cấu tạo bình lên men 72 iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại vi khuẩn acetic theo Frateur Bảng 1.2 Các chủng vi sinh vật tổng hợp BC 23 Bảng 3.1 Tương quan mật độ tế bào (CFU/ml)và OD540 53 Bảng 3.2 Mật độ tế bào sau ngày nhân giống .54 Bảng 3.3 Kết khảo ảnh hưởng nồng độ sulfate amon 56 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol 59 Bảng 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid acetic ban đầu 61 Bảng 3.6 Kết lên men theo mẻ chế độ tĩnh lắc 63 Bảng 3.7 Biến thiên mật độ tế bào chế độ lắc theo thời gian .66 Bảng 3.8 Biến thiên mật độ tế bào chế độ nhiệt độ theo thời gian .67 Bảng 3.9 Chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản .69 Bảng 3.10 Tỉ lệ % tế bào sống so với chế phẩm ban đầu theo thời gian bảo quản .69 Bảng 3.11 Các thông số lên men ban đầu 73 Bảng 3.12 Lượng chế phẩm cho vào bình lên men 75 Bảng 3.13 Biến động pH trình lên men .75 Bảng 3.14 Biến động nồng độ acid acetic trình lên men 76 Bảng 3.15 Nồng độ acid acetic pH với tốc độ pha loãng 0.008(1/h) .77 Bảng 3.16 Biến động lượng acid acetic qua bình hệ thống tốc độ pha loãng 0.008(1/h) .77 Bảng 3.17 Bảng so sánh hiệu lên men thí nghiệm lên men theo mẻ lên men liên tục .78 iv Intermediates in the Shikimate Pathway, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol 67, No 10, p 2124-2131, 2003 [30] Paolo Giudici, Solieri Lisa, Luciana De Vero, Vinegars and Acetic Acid Bacteria, Firma Effe s.n.c, Reggio Emilia – Italy, 2005 [31] Peter F Stanbury, Allan Whitaker, Stephen J Hall, Principles of Fermnetation Technology, British Library, 1995 [32] R.Tammali, G Reddy, Fermentation of cellulose to acetic acid by Clostridium lentocellum SG6: induction of sporulation and effect of buffering agent on acetic acid production, Applied Microbiology, p 304-308, 2003 [33] Roy A.Periana et al, Methane to acetic acid in one step, The newsmagazine of the chemical world, Vol 81, Number 32, 2003 [34] S.-F Lu, F.-L Lee, H.-K Chen, A thermotolerant and high acetic acidproducing bacterium Acetobacter sp I14-2, Journal of Applied Microbiology, p 55-62, 1999 [35] S T Cowan, J G Holt, J Liston, R G E Murray, C F, Niven, A W Ravin & R Y Stanier, Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, The Williams & Wilkins Company/Baltimore, 1974 [36] Shakhashiri, Chemical of the week – Acetic Acid and Acetic Anhydride, General Chemistry, 2008 [37] Springer Netherlands, Ethanol and acetic acid tolerance in free and immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter aceti, Biomedical and Life Sciences, 2004 INTERNET [38] www.vinachem.com.vn [39] www.quangninhtrade.gov.vn [40] www.sinhhocvietnam.com [41] www.hoachatvietnam.com [42] www.aromadictionary.com/articles/volatileacidity_article.html [43] www.vinegarman.com/zoo_largevinegarbacteria.shtml v PHỤ LỤC vi PHỤ LỤC 1 Một số ứng dụng quan trọng acid acetic Acid acetic loại acid hữu ứng dụng rộng rãi đời sống sản xuất công nghiệp Những ứng dụng quan trọng acid acetic bao gồm: 1.1 Ứng dụng chế biến mủ cao su Trong sản xuất mủ cao su, người ta lo ngại tượng đông đặc mủ trước đưa chế biến Để chống đông mủ cao su, người ta thường dùng NH3 % Lượng NH3 sử dụng tùy theo loại mủ đem sơ chế Mủ đổ xơng khói, người ta sử dụng lượng NH3 0,6 – g/l mủ Mủ đánh đơng khơng pha lỗng, người ta thường sử dụng lượng NH3 0,3 – 0,6 g/l Khi đổ mủ vào xô thùng chứa, người ta thường dùng NH3 để chống đơng Theo đó, mủ pha lỗng với nước đến độ cao su thơ (DRC) khoảng 14 %, pH 4.7 Tuy nhiên, tùy theo hệ thống máy cán, người ta thay đổi pH độ cao su thơ cho thích hợp Sau pha loãng khuấy trộn mủ với NH3, người ta cho thêm vào dung dịch acid acetic 2,5 % với lượng 3,5 – 10 kg/tấn dung dịch mủ cao su; cho acid vào người khuấy liên tục 1.2 Ứng dụng acid acetic công nghệ thực phẩm Với hàm lượng acid acetic từ – 10 %, người ta gọi dung dịch dầu ăn Dầu ăn sử dụng công nghệ thực phẩm để chế biến đồ hộp rau quả, gia vị bữa ăn gia đình Lượng dầu ăn sử dụng cơng nghệ thực phẩm lớn Do đó, việc sản xuất dầu ăn khơng mang tính chất thủ cơng mà trở thành ngành sản xuất theo quy mô công nghiệp nhiều nước giới 1.3 Ứng dụng acid acetic công nghiệp khác Acid acetic cịn sử dụng rộng rãi nhiều ngành cơng nghiệp công nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ, tổng hợp chất dẻo tơ sợi Những ngành địi hỏi lượng acid acetic nhiều có chất lượng cao dung dịch acid acetic dùng công nghiệp thực phẩm công nghiệp chế biến mủ cao su [8] vii Một số nguyên nhân làm giảm chất lượng lên men acid acetic Quá trình lên men acid acetic trình nhạy cảm với yếu tố hóa học, lý học yếu tố sinh học 2.1 Giấm bị đục giảm độ chua Trong sản xuất giấm, thường xảy hai q trình oxy hóa: - Q trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH - Q trình oxy hóa CH3COOH thành CO2 H2O Q trình oxy hóa C2H5OH thành CH3COOH q trình có lợi cho sản xuất Q trình oxy hóa CH3COOH thành CO2 H2O q trình có hại cho sản xuất Q trình oxy hóa xảy hai hướng: oxy hóa học oxy hóa sinh học Oxy hóa sinh học chuyển CH3COOH thành CO2 H2O xảy nấm men Comdida mycoderma, Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti gây Các giống vi sinh vật có khả tạo màng nhầy làm cho giấm đục tạo cặn Người ta khắc phục tình trạng cách cho lên men lại trước lên men phải vệ sinh thiết bị lên men thật trùng Pasteur nhiệt độ 60 – 70oC, cho thêm vào giấm K2S2O5 với liều lượng – 15 g/100 lít giấm kết hợp với trùng Pasteur để tăng độ bền giấm 2.2 Hiện tượng lươn giấm Lươn giấm có tên khoa học Angiullula aceti Chúng thuộc loại động vật giun trịn, nhỏ, có màu hồng Con đực tuổi trưởng thành có kích thước mm, tuổi trưởng thành có kích thước – mm Nếu nồng độ giấm < 6%, lươn giấm dễ phát triển Nồng độ giấm cao khoảng > 9%, chúng bị ức chế phát triển Lươn giấm thường sử dụng vi khuẩn acetic nguồn dinh dưỡng Tuy nhiên, chúng có khả sử dụng C2H5OH, CH3COOH, đường, chất hữu chứa nitơ để phát triển Chúng thường không gây độc cho người mà gây đục giấm làm giảm hiệu suất lên men viii Để phòng ngừa lươn giấm phát triển, người ta thường cho vào giấm thành phẩm – % NaCl (muối ăn) Sau – ngày lươn giấm chết, người ta đem lọc đưa nhiệt độ lên đến 40 – 50oC, sau lọc giấm để loại bỏ lươn giấm 2.3 Bọ giấm Trong sản xuất giấm, người ta thường thấy hai loại bọ giấm: - Loại to, màu trắng, có kích thước 0,8 – 1,5 mm - Loại nhỏ, màu nâu, có kích thước 0,3 – 0,4 mm Người ta thường dùng dầu khoáng bơi vào nơi hay có bọ giấm Trong trường hợp có nhiều bọ giấm thiết bị lên men, người ta phải dùng nóng để tiêu diệt chúng 2.4 Ruồi giấm Ở sở sản xuất giấm, người ta thường thấy có nhiều ruồi giấm Ruồi giấm thường phát triển phần trên, phần thiết bị lên men Chúng làm giảm acid acetic, sinh ấu trùng ăn vi khuẩn lactic thường vật trung gian lây nhiễm vi sinh vật gây hại giấm Do đó, cần phải hạn chế xuất ruồi giấm cách che kín cửa, đậy kín phần hở thiết bị lên men vệ sinh đất khu sản xuất [7, 8] Các yếu tố ảnh hưởng đến vi sinh vật cố định 3.1 Yếu tố chất mang Khi bị giới hạn phạm vi môi trường xác định, xảy nhiều kiểu tương tác khác chất mang polymer lên môi trường vi mô bao xung quanh phân tử enzyme cố định Kiểu thứ coi “hiệu ứng phân phối”, polymer nhờ vào tính chất lý hóa học đặc trưng kéo tới (hoặc đẩy khỏi) bề mặt chất, sản phẩm phản ứng phân tử khác, làm tăng (hay giảm) nồng độ chúng môi trường vi mô sát enzyme Như vậy, sử dụng polymer polyion làm chất mang khơng có ion nằm dung dịch phân hệ mà nồng độ ion môi trường vi mô xung quanh enzyme khác với ix nồng độ chúng phase dung dịch tự Điều làm cho động học enzyme trở nên phức tạp Kiểu thứ hai thân chất mang polymer ngăn cản khuếch tán tự phân tử theo hướng tới enzyme khỏi enzyme, từ ảnh hưởng đến hiệu xúc tác enzyme Ngồi ra, tính chất lý học chất mang tính kỵ nước, tính háo nước, tính hịa tan, tính bền học…đều bị ảnh hưởng định đến khả cố định Bản chất hóa học chất mang ảnh hưởng đáng kể đến khả hấp phụ lên chất mang 3.2 Yếu tố khuếch tán chất, sản phẩm phân tử khác Tốc độ khuếch tán chất, sản phẩm chất khác phụ thuộc vào yếu tố: kích thước lỗ gel chất mang polymer; trọng lượng phân tử chất; chênh lệch nồng độ vùng môi trường vi mô xung quanh vi sinh vật dung dịch tự Những giới hạn khuếch tán thể hai dạng hàng rào khuếch tán bên bên Hàng rào khuếch tán bên ngồi xuất có tồn lớp mỏng dung môi không pha trộn bao xung quanh hạt polymer Các chất khuếch tán vào lớp nhờ kết hợp khuếch tán phân tử thụ động đối lưu Độ dày lớp phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn dung môi xung quanh hạt chứa tế bào cố định Việc gia tăng tốc độ pha trộn làm giảm hàng rào khuếch tán bên ngồi Vì vậy, quy trình cơng nghệ nào, tốc độ khuấy đảo đóng vai trò quan trọng 3.3 Vi sinh vật Thành phần hóa học, cấu tạo màng tế bào, kích thước, hình dạng…của lồi vi sinh vật khác ảnh hưởng khác đến việc lựa chọn kỹ thuật cố định tế bào vào chất mang Ngồi ra, chất hay hình dạng lồi vi sinh vật định kiểu liên kết độ bền kiểu liên kết hình thành tế bào vi sinh vật chất mang x Trạng thái sinh lý hoạt tính lồi vi sinh vật sử dụng thay đổi ảnh hưởng đến liên kết độ bền liên kết [12] Chất mang kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật 4.1 Yêu cầu chất mang Chất mang đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến khả cố định vi sinh vật Một chất mang lý tưởng cần có tính chất sau: Chất mang phải rẻ tiền Chất mang phải có tính chất lý bền vững, ổn định Chất mang phải bền vững, không tan môi trường phản ứng Chất mang không làm khơng ức chế hoạt tính enzyme vi sinh vật Chất mang không gây phản ứng hấp phụ khơng đặc biệt Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với công vi sinh vật Chất mang phải phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học Chất mang phải chọn lọc cho việc cố định vi sinh vật dễ dàng Chất mang sử dụng nhiều lần Chất mang phải an tồn cho mơi trường sống Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất chất mang vừa tăng khả cố định vi sinh vật, vừa tăng khả tiếp xúc chất với enzyme Nhờ làm tăng hoạt tính enzyme số lần tái sử dụng Chất mang có cấu trúc siêu lỗ, lỗ xốp, dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng… [13] 4.2 Chất mang polymer sinh học 4.2.1 Ưu điểm Polymer sinh học có độ tương thích sinh học cao tế bào, làm tăng tính ổn định tế bào cố định chất mang: cố định tế bào Bacillus subtilis xi alginate-Ca tạo lượng alkaline protease nhiều cố định tế bào polyacrylamide, polyacrylamide gây độc cho tế bào Polymer sinh học sau sử dụng thu hồi cách hịa tan dung dịch chống tạo gel: gel alginate-Ca hịa tan cách ngâm hạt dung dịch citrate EDTA Polymer sinh học phân hủy sinh học nhờ vi sinh vật Polymer sinh học không gây ô nhiễm môi trường 4.2.2 Nhược điểm Polymer sinh học có tính chất lý bền vững khơng ổn định Polymer sinh học có độ trương nở thấp Ví dụ tinh bột có độ trương nở thiếu nhóm chức có khả liên kết với nước Polymer sinh học gây phản ứng miễn dịch với thể sử dụng thuốc đưa vào thể người động vật 4.2.3 Phân loại chất mang polymer sinh học Cellulose: Được sử dụng rộng rãi để làm chất mang cố định tế bào Cellulose thành phần cấu tạo chủ yếu vật liệu rơm, bã mía, dăm bào, trấu, mùn cưa…Đây loại nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm Việt Nam Các cellulose loại homopolymer β-D-glucose Các gốc β-Dglucose nối kết với qua liên kết β-D-1,4-glucan Mức độ polymer hóa cellulose thay đổi nhiều, trung bình 3000 Tùy theo loại thực vật mà phân tử cellulose có khối lượng phân tử khác nhiều từ 5000 đến 2.500.000 Nhờ phương pháp phân tích tia Rơnghen, người ta biết cellulose có cấu tạo hệ sợi Các sợi liên kết thành bó nhỏ gọi microfibrin có cấu trúc khơng đồng Chúng có phần đặc (phần kết tinh) phần xốp bền vững (phần vơ định hình) Cellulose hợp chất tự nhiên bền vững Nó khơng tan nước mà bị phồng lên hấp thụ nước Cellulose bị phân hủy đốt nóng với acid hay kiềm nồng độ cao Cellulose bị phân hủy nhiệt độ xii thường hay nhiệt độ 40 – 45oC nhờ enzyme phân hủy cellulose gọi cellulase Các dẫn xuất cellulose CM-cellulose, DAEA-cellulose… có tính chất lý tốt, giá rẻ lại không đồng nên sử dụng dạng sợi hay dạng vi hạt Collagen chất mang thích hợp cho trình cố định tế bào điều kiện “nhẹ nhàng” Collagen protein sợi mô liên kết thể động vật Bản chất protein định khả gắn khơng qua liên kết hóa trị Collagen ưa nước, dung dịch nước nở mạnh cải biến thay đổi tương quan tỷ lệ gốc kỵ nước ưa nước Chính tính chất làm trở thành chất mang thuận tiện trình cố định Gel agar thu nhận từ rong biển đóng vai trị làm chất mang q trình cố định sử dụng thực tế độ bền học gel thấp Ngồi cịn phải thêm giai đoạn đun dịch huyền phù chứa tế bào trước tạo gel K-carrageenan: loại polymer tự nhiên K-carrageenan có ý nghĩa cả, đảm bảo tạo thành dạng bao bọc mềm Carrageenan polysaccharide chiết xuất từ tảo biển đỏ Nó bị tan chảy đốt nóng đơng lại làm lạnh Tuy nhiên, vật liệu có nhược điểm gel khơng ổn định mơi trường có phosphate Gel alginate: Có nguồn gốc từ rong biển, gel alginate-Ca hay alginate-Al sử dụng rộng rãi cho mục đích cố định Cấu trúc gel quy định tạo thành liên kết ion mạch đa điện ly Về mặt chất, mạch β-D-mannoic acid hay α-D-gulonic acid Alginate bền mặt học Sự có mặt tác nhân tạo phức có ảnh hưởng xấu đến chức hoạt động gel algiante-Ca chúng phá cấu trúc gel liên kết với ion Canxi Nhưng loại gel lại bền với áp suất thủy tĩnh xiii Chitin chitosan: có đặc tính ưu việt mà polymer khác khơng có Đó là: tự hủy, dễ tương thích, khơng độc hại có tính hấp thụ cao Chitosan có đặc tính lý học, sinh học khả tạo gel, khả kháng khuẩn Hiện có xu hướng chung sử dụng vật liệu polymer tự nhiên ghép (copolymer) với polymer tổng hợp để cải thiện tính lý 4.2.4 Chất mang polymer tổng hợp Các loại polymer hữu tổng hợp như: polyacrylamide, polyester, polyvinylacetate, polyacrylic, polyvinylalcohol…có ưu điểm: bền, tính chất lý tốt, hồn tồn trơ với cơng vi sinh vật, độ trương tốt đặc biệt điều chỉnh với kích thước chất mang để nâng cao hiệu q trình cố định Bên cạnh có nhược điểm như: giá thành cao, tương hợp sinh học kém, bền nên khó phân hủy tự nhiên, gây nhiễm mơi trường 4.2.5 Chất mang vô tự nhiên Zeolit: aluminosilicate có cấu trúc tinh thể theo khơng gian ba chiều, hình thành cửa sổ lỗ xốp có kích thước cỡ phân tử Cấu trúc lỗ xốp bao gồm khoang lớn bên khoang nhỏ bên hình thành từ bát diện cụt Ngồi cịn có than hoạt tính, cát, silicate… 4.2.6 Chất mang vô tổng hợp Người ta thường sử dụng aluminium oxide, silicum oxide, sợi thủy tinh…Đây dạng oxide có cấu trúc lỗ có khả hấp phụ tốt Nhược điểm vật liệu tan mơi trường kiềm có pH > 7.5 [12, 13] xiv 4.3 Một số phương pháp cố định vi sinh vật khác 4.3.1 Phương pháp cố định trình lạnh sâu Sự cố định trình lạnh sâu cho phép tạo hệ sợi có hoạt tính sinh học cao Gel lạnh sâu có nhiều cấu trúc lỗ to Kích thước hình dạng chúng điều chỉnh cách thay đổi chế độ làm việc trình tạo cấu trúc lạnh sâu thay đổi nồng độ chất tạo gel dung dịch ban đầu Gel lạnh sâu có độ lỗ cao nên chúng vật liệu có triển vọng làm chất mang tế bào vi sinh vật cố định Người ta tạo gel lạnh sâu cách trộn lẫn thành phần tạo gel cần thiết cho lạnh đến nhiệt độ âm Sau dịch lỏng chuyển sang trạng thái rắn giữ trạng thái thời gian định, sau làm tan Chất tạo gel lạnh sâu phổ biến để cố định tế bào vi sinh vật (vi khuẩn bào tử nấm) rượu polyvinyl 4.3.2 Phương pháp cố định liên hợp Trong lên men cồn, người ta hỗn hợp Saccharomyces diastaticus, Schwanniomyces castellii Endomycopis fibuligera Reilly Scott làm vài thử nghiệm với việc kết hợp ni tảo vi sinh vật hiếu khí cách bẫy vỏ capsule để giải vấn đề oxy Wikstrom liên kết Chlorella vulgaris với Providencia sp agarose để lên men tạo ketoisocaproic acid từ 1-leucine 4.3.3 Phương pháp cố định nhờ photometer (quang polymer) Đây phương pháp cố định có triển vọng dựa vào photometer urethane Photometer oligomer mà phân tử có chứa nhóm chức có khả tham gia vào làm dài khâu mạch để tạo thành polymer có trọng lượng phân tử cao Các gel khâu nối nhờ ánh sáng thông thường tạo thành cách chiếu sáng cận tử ngoại theo đợt ngắn lên hỗn hợp dịch lỏng photopolymer có chứa nhóm chức nhạy cảm với ánh sáng với có mặt chất mẫn cảm dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật Còn gel polyurethane tạo thành cách trộn photopolymer urethane tan nước với dịch huyền phù chứa vi sinh vật xv PHỤ LỤC Kết mật độ tế bào sau ngày nhân giống (Thí nghiện khảo sát đường cong sinh trưởng) Thời gian (ngày) OD OD*2 log(CFU/ml) CFU/ml 0.008 0.160 6.131 1.35 x 106 0.096 0.192 6.332 2.12 x 106 0.105 0.210 6.444 2.78 x 106 0.115 0.230 6.570 3.72 x 106 0.116 0.232 6.582 3.82 x 106 0.113 0.226 6.545 3.51 x 106 Dịch lên men pha loãng lần Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid acetic ban đầu Nồng độ acid acetic ban đầu khảo sát (%) Nồng độ acid tổng (%) OD log(tế bào/ml) Mật độ tế bào (tế bào/ml) 0.25 5.0 0.235 6.600 3.98 x 106 0.5 5.2 0.239 6.626 4.22 x 106 0.75 4.8 0.221 6.513 3.26 x 106 4.5 0.211 6.451 2.82 x 106 1.25 3.9 0.128 5.930 0.85 x 106 1.5 3.6 0.087 5.674 0.47 x 106 xvi Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol Nồng độ ethanol khảo sát (% v/v) Nồng độ acid tổng (%) OD log(tế bào/ml) Mật độ tế bào (tế bào/ml) 5.02 0.240 6.632 4.29 x 106 4.98 0.228 6.557 3.61 x 106 4.95 0.201 6.388 2.44 x 106 10 4.65 0.119 5.874 0.75 x 106 Kết khảo ảnh hưởng nồng độ sulfate amon Nồng độ sulfate amon khảo sát (% w/v) Nồng độ acid tổng (%) OD log(tế bào/ml) Mật độ tế bào (tế bào/ml) 0.1 4.79 0.216 6.482 3.03 x 106 0.2 4.85 0.228 6.557 3.61 x 106 0.4 4.41 0.233 6.588 3.87 x 106 0.6 4.22 0.238 6.620 4.17 x 106 0.8 4.01 0.241 6.663 4.60 x 106 xvii PHỤ LỤC Dịch lên men acid acetic sau q trình lên men liên tục LÝ LỊCH TRÍCH NGANG I THÔNG TIN CÁ NHÂN − Họ tên: LÊ NGUYỄN HỒNG ÂN − Phái: Nam − Ngày sinh: 21/04/1983 − Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh − Địa liên lạc: 453/77B25 Lê Văn Sỹ, phường 12, quận 3, TP HCM − Điện thoại: 0902978210 − Cơ quan cơng tác: Phịng Tài ngun Mơi trường - Ủy ban nhân dân quận Bình Tân − Điện thoại: 08 37526827 II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO − Từ năm 2001 đến năm 2005: Sinh viên trường Đại học dân lập Văn Lang TP HCM − Hệ đào tạo: Chính qui năm − Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học − Từ năm 2006 đến nay: Học viên cao học trường Đại học Bách Khoa TP HCM − Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học − Mã số học viên: 03106662 III Q TRÌNH CƠNG TÁC − Từ năm 2008 đến nay: Cơng tác Phịng Tài ngun Mơi trường - Ủy ban nhân dân quận Bình Tân ... tài “CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC? ?? nhằm mục đích tạo chế phẩm vi khuẩn cố định ứng dụng lên men acid acetic hệ thống lên men. .. Xác định chế độ tối ưu để bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định chất mang cellulose vi khuẩn - Ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định chất mang cellulose vi khuẩn hệ thống lên men acid. .. acid acetic Tất vi khuẩn có khả lên men tạo acid acetic gọi chung vi khuẩn acetic Các vi khuẩn acetic xếp vào hai giống : Acetobacter, Gluconobacter Trong đó, Acetobacter tác nhân trình lên men acetic,