Sulforaphane ngăn chặn sự biểu hiện của uPAR và sự xâm lấn tế bào thông qua tín hiệu AP-1 và NF-KB trên nhiều dòng tế bào ung thư dạ dày

thật sự thiết yếu trong việc nghiên cứu về vai trò của sulforaphane ỉàm giảm sự biểu hiện của uPAR Bên cạnh đó, tế bào ung thư dạ ơàỵ khi bị x ử lý bởi sulforaphane cũng cho thấy [r]

82,4% bệnh nhân có bất thường kết qúả đo ĐDTTK Bệnh sinh cùa tổn thương TKNB ĐTĐ bao gồm nhiều chế: rối loạn chuyển hóa đo đường huyết tăng cao sinh ẢGEs; tình trạng thiếu máu cục ni dưỡng sợi thần kinh; tự sửa chữa dây thằn kinh bị tơn thương khơng cịn trì [41 Như kiểm soát đường huyết ià yếu tố có liến quan đến bệnh TKNB ĐTĐ Kết nghiên cứu ghi nhận khỉ HbA1c 5:7,5% làm gia tăng nguy bất thường đo ĐDTTK ngoại biên lên 1,2 lần, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê

65 bệnh nhân ĐTĐ tip nghiên cứu ghi nhận có 70,8% bất thường kếì đo điện dẫn truyền thần kinh ngoại biên, đánh giá theo test sàng lọc chẩn đoán bệnh TKNB hiẹp hội ĐTĐ Vương Quốc Anh tỉ lệ bệnh TKNB 48% Điều cho thấy việc đo ĐDTTKNB quan trọng có ý nghĩa với việc tầm sốt biến chứng bệnh nhân ĐTĐ tip Qua nghiên cứu ghi nhận bệnh nhân ĐTĐ tip có bất thường ĐDTTKNB có nguy mắc bệnh TKNB theo tiêu chuẩn chẩn đoán cua hiệp hội ĐTĐ Vương quốc Anh năm 2001 gấp 5,33 lấn, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p=0,006 Qua đây, nhận thấy cần thiết đo ĐDTTKNB bẹnh nhân ĐTĐ tip 2, giúp phất sớm theo dõi điều trị biến chứng TKNB

KẾT LUẬN

- Bệnh nhân đái tháo ổường tip có thời gian tiềm kéo dài hơn, vận tốc dẫn truyền chậm biên độ điện thể thấp so với nhom chứng đo điện dẫn truyền dây thần kinh ngoại biên (p<0,05) 70,8% bệnh nhân đái tháo đường tip có bất thường kết qủả đo điện dẫn truyền than kinh, đó: 52,2% tỗn ỉhương sợi cảm giác lẫn vận động, 54,3% tổn thương thể hỗn hợp thối hóa sợi trục myelin, 54,3% tổn thương dây thần kinh ngoại biên chi chi dưởi

- Bệnh nhân ĐTĐ tip có bất thường kết đo điện dẫn truyền thẩn kinh ngoại biên có nguy bệnh thần kinh ngoại biên chẩn đoán theo test chẩn

đoán sàng iọc bệnh thần kinh cùa hiệp hội đái tháo đường Vương quồc Anh năm 2001 gấp 5,33 lần so với nhóm cỏ kết đo điện dẫn truyền thần kinh bình thường, với p=0,006

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguỳễn Hữu Cơng (2013), Chần đốn điện ứng dụng lâm sàng, Nhà xuất Đại học Quốc gia thành Ho Chí Minh, tr.91-95

2 Lê Quang Cường (1999), Nghiên cứu tổn thương thần kinh ngoại vi đai tháo đường bằnp ghi điện va tốc độ dẫn truyền thần kinh, Luận an Tien sĩ y học, Đại học Y Hà Nội

3 Nguyễn Mai Hoà (2008), “Khảo sát điện bệnh nhân Đái tháo đường mãn tính”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, Tập 12, phụ 1, tr.352-358

4 Nguyễn Thy Khue (2012), "Bẹnh thần kinh đái tháo đường”, Hội nghị nội tiếỉ toàn quốc lần Vi íại Huế

5 Nguyễn Duy Mạnh (2009), Nghiên cứu biểu tổn thương đa thần kinh bẹnh nhân đái thảo đường tip 2, Luận văn Thạc sĩ y học, Đại học Y Hà Nội

6 American Diabetes Association (2013), “Standards of Medical Care in Diabetes 2013”, Diabetes Care, 36(1), pp.11-66

7 D.Preston, Barbara E.Shapiro (2005), Electromyography and neuromuscular disorders: clinical- electrophysiologlc correlations, 2nd Ed, pp.03-230

8 Dyck P.J (1993), “The prevalence by staged severity of various types of diabetic neuropathy, retinopathy, and nephropathy in a study", Neurology, 43, pp 817-824

9 Hendriksen P.H, et at (1993), "Subclinical diabetic polyneuropathy: early detection of different nerve fibre types”, J Neurol - Neurosurg - Psychiatry, 56(5), pp.509- 514

10 Odenigbo, Oguejiofor (2008), “Screening for peripheral neuropathy in diabetic patients the benefits of the United Kingdom”, Tropical Journal of medical Research, 2(1), pp.345 - 431

11 World Health Organization (1999), “Diagnosis and classification of diabetes mellitus” Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Meliitus "and its Complication, pp.2-13

SULFORAPHANE NGĂN CHẶN s ự BIẾU HIỆN CỦA UPAR VÀ Sự XÂM LẤN TÉ BÀO THÔNG QUA TÍN HIỆU AP-1 VÀ NF-KB

TRÊN NHIỀU DÒNG TÉ BÀO UNG THƯ DẠ DÀY

Phạm Ngọc Khôi (Tiến sĩ, Bộ môn Mô Phôi - Di truyền, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, TP.HCM, Việt Nam) GS.TS Young Do Jung (Bộ mơn Hóa sinh, Khoa Y, Đại học Quốc Gia Chonnam, Gwangju, Hàn Quốc) TÓM TẤT

Đặt vấn đề: Sự biểu cùa urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) nghiên cứu và đảnh già trình viêm nhiễm, tái tạo mơ nhiều loại ung thư khác người.

Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu ành hưởng sulforaphane (1-isothiocyanato-4-[methylsulfinyl]-butane), thành phần isothiocyanate bơng cải xanh, lên biểu uPAR xâm lấn tế bào trên nhiều dòng tể bào ung thư dày khốc người.

nhau người, khảo sát biểu gene protein uPAR thí nghiệm kiềm tra s ự xâm lấn tế bào

ung thư đă sử dụng nghiên CƯU thử thuốc với sulforaphane đối chứng âm.

Kết quả: Sulforaphane ức chế biểu uPAR theo liều lượng kìm hãm hoạt hóa yếu tổ phiên

mă activator protein (AP)-1 nuclear factor-kappaB (NF-kB) Chất ức chế đặc biệt AP-1 (curcumin)

NF-kB (BAY1Ị-7082) tham gia vào kìm hăm hoạt hóa biểu uPARđã chứng minhAP-1 NF-kB

thật thiết yếu việc nghiên cứu vai trò sulforaphane ỉàm giảm biểu uPAR Bên cạnh đó, tế bào ung thư ơàỵ bị x lý sulforaphane cho thấy biêu ngăn chặn xâm lấn tế bào khi được so sảnh với khảng thể chổng uPAR.

Kết luận: Các kết chứng minh sulforaphane làm giàm biểu uPAR thơng qua con

đường tín hiệu nội bào AP-1 NF-kB kết dẫn tới ngăn chặn xâm lốn tế bào trvng điều in ung thư dạ

dày người.

T khóa: uPAR, ung thư dày.

SUMMARY

SULFORAPHANE PREVENTS DOWN-REGULATION OF UPAR VIA THE INHIBITION OFAP-1 AND NF-KB SIGNALING PATHWAYS IN HUMAN GASTRIC CANCER CELLS

Pham Ngoc Khoi (Department o f Histology - Embryology and Genetics, Pham Ngoc Thach University o f Medicine, HCMC, Vietnam) Young Do Jung (Department o f Biochemistry, Medical School, Chonnam National University, Gwangju, Korea) Background: Urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR) expression is elevated during inflammation, tissue remodeling and in many human cancers In this study, we investigated the effect of sulforaphane (1-isothiocyanato-4-[methylsulfinyl]-butane), a naturally occurring isothiocyanate in broccoli, on uPAR expression in many human gastric cancer cells.

Materials and method: Human gastric cancer cells culture, uPAR gene and protein expression, invasion assay are used fo r this study.

Results: Sulforaphane downregulated the uPAR expression and also inhibited the activation o f transcription

factor activator protein (AP)-1 and nuclear factor-kappaB (NF-kB) a specific inhibitor o f AP-1 (curcumin) andN

F-kB (BAY11-7082) decreased uPAR activity confirmed that AP-1 and NF-kB were essential for the suiforaphane

downregulated uPAR expression Taken together, the human gastric cancer cells treated with sulforaphane showed a remarkably inhibited invasiveness and this effect was partially abrogated by uPAR neutralizina antibodies.

Conclusion: These results suggested that sulforaphane downregulated uPAR expression via AP-1 and NF-kB

signaling pathways and, in turn, inhibited the cell invasiveness in human gastric cancer cells. Keyw ords: uPAR, human gastric cancer.

ĐẶT VÁN ĐẺ VÀ MỤC TIÊU

Urokinase-type plasminogen activator (uPA) thụ thể nó, uPA receptor (uPAR), tạo thành hệ thống phân giải protein phức tạp có íiên quan đến xâm lấn di tế bào ung thư uPA serine protease với khả chuyển đổi plasminogen thành dạng piasmỉn hoạt động Chat ngoại bào [23 Trong ung thư, biểu uPAR mức cao có ý nghĩa quan trọng làm trì việc xâm lấn di nhiều dịng íế bào ung thư gia tăng coi íà tiên lượng xau trị bệnh ung thư [4, 5] Những nghiên cứu gần cho thấy chế độ dinh dưỡng giàu bơng cải xanh có liên quan với việc giảm thiểu nguy tiến triển cùa nhiều bệnh ung íhư khác người mà nguyên nhân tỉm thấy íà hợp chất sulforaphane (1-isothiocyanato-4-[methylsulfinyl]- butane), íhành phần isoỉhiocyanate bơng cải xanh với khả kháng ung thư mạnh [6] V) nghiên cứu tiến hành đánh giá ảnh hưởng cùa sulforaphane lên biểu uPAR xâm lấn tế bào nhiều dòng tế bao uncj thư dày khác ở người, qua cần íhiễt cho việc tìm hiểu hạn chế tăng sinh di

căn cùa tế bào ung thư dày người

ĐÓI TƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u

Hóa chất

Sulforaphane (1-isothiocyanato-4-[methylsulfinyi]- butane), phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) hóa chất cần thiếỉ sử dụng nghiên cứu cung cấp từ hãng Sigma-Aldrich (Missouri, Hoa Kỳ) Kháng thể kháng igG dùng thử nghiệm xâm ỉấn tế bào cung cấp từ hãng Ceiĩ Signaling Technology (Beverly! MA, Hoa Kỳ)

Nuôi tế bào ung th dày

Các dòng tế bào ung thư dày người íấy từ American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, Hoa Kỳ) ngân hàng tế bào Trường Đại học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc) nuôi cay môi trường Duibecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) có bổ sung thêm 10% fetal bovine serum (FBS) 1% peniciiiin-streptomycin nhiệt độ 37oC tròng tủ cáy với 5% C

Reverse transcriptlon-polym erase chain reaction (RT-PCR)

cho nghiên cứu bao gồm: GAPDH sense, 5‘-TTG TTG CCA TCA ATG ACC CC-3'; GAPDH antisensẽ, TGA CAA AGT GGT CGT TGA GG-3' (836bp) (GAPDH sử dụng chứng nội phản ứng PCR nghiên cứu này); uPAR sense, 5’-CAC GAT CGT GCG CTT GTG GG-3’, uPAR antisense, 5’-TGT TCT TCA GGG CTG CGG CA-3’ (285bp)

Realtime PCR

Primer uPAR 18S (chứng nội tại) sử dụng nghiên cứu đừợc lấy từ Qiageri {Valencia, CA, Hoa Kỳ), sử dụng SYBR Premix Ex Taq (Takara Biochemicais) bời iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) theo yêu cầu nhà sản xuất

Western blot

Kháng kháng thể uPAR p-actin (chứng nội tại) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) sư dụng nghiên cứu với ỉỷ lệ 1:1000 phát dựa vào kit ECL (Amersham, Franklin Lakes, NJ, Hoa Kỳ)

Đo hoạt động gene báo cáo uPAR, AP-1 và NF-KB

Tế băo ung thư AGS chuyển vector mang Ịjg gene bâo câo pGL3-uPAR, pGL3-AP-1 vă PGL3-NF-KB phương phâp sử dụng Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Câc promoter năy sử dụng nhằm đo lường hoạt động uPẢR, AP-1 vă NF-kB iuciferase tế bằ xử lý với sulforaphane.,

Sự xâm iấn tế bào phương pháp Matrigei

Thí nghiệm đo xâm lấn te bào ung thì? dày AGS thực kit BIOCOATTM matrigel invasion chambers (Becton-Dickinson, Bedford, MA, Hoa Kỳ) bỗ sung thêm 10% fetal bovine serum

Xử lý thống kê

Số liệu hiển thị thống kê dạng trung binh ±SD thí nghiệm lặp lại nhầt ba lần riêng biệt cho thí nghiệm Sự khác biệt cùa tập hợp liệu xác đỉnh kiểm định Student’s t- test Sự khác biệt mô tả với p < 0,05

KẾT QUẢ

Sự ảnh hưởng cùa sulforaphane lên biểu hiện uPAR dòng ỉế bào ung thư dày AGS

Dòng tế bào ung thư dày AGS ủ với sulforaphane (0-50 ụM) vòng giờ, sau xử iý vớỉ phosbol 12-myristate 13-acetate (PMA) chat gây độc cho tế bào ung thư vòng ở nồng độ 100 nM Sau ủ, RT-PCR (hình 1A), realtime PCR (hình 1B) western blot (hlnh 1C) kiểm tra cho thấy sulforaphane ức chế hoàn toàn biểu gene protein uPAR theo liều lượng sử dụng sulforaphane Bên cạnh đó, tế bào AGS đứợc chuyển với vector mang Ịjg gene báo cáo pGL3- uPAR sau ủ tiếp tục với sulforaphane (0- 50 ịjM) vòng giờ, đưực xử lý với PMA (100 nM) vòng cách xử lý thuốc trinh bày tren Sau ủ, gene báo cáo kiểm tra kit đo phát quang sinh học cho thấy

sulforaphane ức chế hoàn toàn biểu cùa uPAR luciferase (hình 1D) Thí nghiệm lặp lại !ần với ±SD

A.

T" I" i

10 30 50

uPAR

G A P D H

PMA ( í 00 nM) Sulforaphane (|iM )

+ + + PM A (iO O uM ) 10 30 50 Suiforaphane (jiM)

uPAR

p-acíin

c. 10 50

PMA(lOOnM) Sulforapiiaiie (ụM)

Hỉnh 1: Sự ảnh hường sulforaphane lên biểu hiện của uPAR ỉrên dong tế bào ung thu’ dày AGS.

Sự ảnh hưởng suiforaphane iên biều hiện cúa uPAR dòng tế bao ung thu’ dày khác người

A AGS MKN2? SNƯ63S Ml

B.

P M A (iO O n M ) ± Sulforophani (30 jiM ) TN ĨK Tc bốo ung ih ir tlữ d&y

^ m ế ệ Ệ m m ề ề uPAR

+ +

+ PMA(IOOnM)

c. ACS MKN2S SNU638 BDC-i

Tếbiouữgứnrdadá)-Hình 2: Sự ảnh hưởng sulforaphane lên biểu hiện của uPAR nhiều dòng tế bào ung thư dày khác

nhau

Sulforaphane ngăn chặn biểu cùa uPAR thơng qua cịn đường hoạt hóa tín hiệu của yếu tố phiên mã AP-1 tế bào ung thu’ dày AGS

Bằng việc kiểm tra hoạt độ AP-1 luciferase (hình 3A) hay sử dụng chẳt ức chế hoạt động AP-1 cúrcumin (hình 3B), mtAP-1 À P -i decoy oligodeoxynucleotides [5] (hình 3C) lên biểu uPAR xử lý với sulforaphane, nghiên cứu hình chứng minh yếu tố phiên mã AP- có liên quan mật thiết đến ức chế biằu uPAR cùa sulforaphane chuỗi truyền tín hiệu nội bào Thí nghiệm lặp lại lần với ±SD

20

G A P D H PM A (100 nM ) C u rcu m iiì OiM )

0

1

m.m.■ ■

+ + + P M A Í I O O n M ) m t A l M ( n e ) A P - í l e c o y < M g'j

c

-Hình 3: Sulforaphane ngăn chặn biễu cùa uPAR thơng qua đường hoạt hóa tín hiệu yếu ỉố phiên

mã AP-1 tế bào ung thu’ dày AGS

Sulforaphane ngăn chặn biểu cùa uPAR thơng qua đu>ờng hoạt hóa tín hiệu của

yếu tố phiên mã NF-kB tế bào ung thu> dày

AGS

Bằng việc kiềm tra hoạt độ NF-kB luciferase (h)nh 4A) hay sử dụng chất ức chế hoạt động cua NF-KB BAY11-7082 (hình 4B), mtNF-KB dominant negative mutant cùa NF-KB-inducting kinase (NIK), i-KBa, I-kBP [5] (hình 4C) lên biều uPAR xư ly với sulforaphane, nghlển cứu hình chứng minh yếu tố phiên mã NF-kB có liên quan mật thiết đến ức chể biễu uPAR sulforaphane chuỗi truyền tín hiệu nội bào tương tự yểu tố phiên mã AP-1 thí nghiệm hình Thí nghiệm lặp iạị lần vởi ±SD

P M A ( i O O n M ) S u l f o r n p h o u e ( | i M )

1 uPAR

GAPDH

B. 10 20

PMA (100 nM ) BAYI1-7Ó82 (jjM )

Hình 4: Sulforaphane ngăn chặn biều cùa uPAR thơng qua đường hoạt hóa tín hiệu cùa yếu ỉố phiên

Sulforaphane ngăn chặn s ự xâm lấn ỉế bào ung th dày AGS thông qua việc ngăn chặn biều ÚPAR

Khi tế bào ung thư dày xử lý với suiforaphane cho thấy giảm rõ rệt xâm lấn tế bào chụp kính hiển vi (hình 5A) xử lý số liệu thông qua cách đếm tể bào xâm lấn chu vi quy ước sẵn kit (hinh 5B) so sánh khả ức chế xâm lấn tế bào sulforaphane (0-50 ụM) với kháng thể kháng !gG (50 Mg/mL) kháng thể kháng uPAR (50 pg/mL) Thí nghiệm lặp !ạị lần với ±SD tương tự thí nghiệm

B

* * + PMA(lOOnM) Igũ (íị ỊigímL) AnÚ-uPAR(50ng/mL| 10 30 $0 Sulíịraphaắ (ỊiM)

Hình 5: Sulforaphane ngăn chặn xâm lẩn tế bào ung thư dày AGS thông qua việc ngăn chặn bỉều

của uPAR BÀN LUẬN

Rất nhiều hợp chất thiên nhiên với khả chống ung thư ngăn chặn phát triền khoi u tiến triển bệnh ùng thư thông qua nhiều chế tế bào phân tử khác bao gom tăng sinh, xâm lấn di tế bào Thơng qua nghiên cứu cơng bố trước cùa nhiều tác giả giới [1, 3], thấy tiềm hợp chất sulforaphane, thành phần có bơng cải xanh, hợp chất sinh học có nguồn

gốc thực vật đặc biệt với hoạt tính chống ung thư Với kết đạt nghiên cứu này, chúng tơi phát sulforaphane có khả gây ức chế biểu cua uPAR mà kết dẫn đen hạn chế xâm lấn tế bào nhiều dòng ung thư dày khác người

KÉT LUẬN

Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên, vai trị sulforaphane việc kiểm sốt ức chế biểu cua uPAR nhiều dòng tế bào ung thư dày

ờ người phát Nghiên cứu kết luận AP-1 NF-kB hai yếu tố phiên mã chuỗi kích hoạt truyền tin nội bào tham gia trực tiếp vào trinh su!foraphanè ức chế bleu uPAR Để tim hiểu chuỗi truyền tin tế bào sử dụng chất ức chế hoạt động AP-1 (curcumỉn, mtAP-1 AP-1 decoy) NF-kB (BAY11-7082, mtNF-KB dominant negative mutant NiK, l-KBa, I-kBỊ3) cho kết AP-1 NF-kB tham gia trực tiếp vào việc điều hòa giảm biểu uPAR dân đến giảm rõ rệt xâm ỉấn tế bào nhiều đòng tế bào ung thư dày khác người

KIẾN NGHỊ

Chính tìm hiểu chế kháng ung thư hợp chấỉ suiforaphane íhơng qua ức chế biểu uPAR nghiên cứu cỏ thể dẫn đển phát việc nghiên cứu phương pháp điều trị bệnh ung thư nói chung ung thư dày nói riêng Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để íàm sáng tỏ chế sinh bệnh kháng bệnh khoa học nghiên cứu ung thư sau

TÀI LIỆU THAM KHÁO

1 BAỎ Y., et (2015) Benefits and risks of the hormetic effects of dietary isothiocyanates on cancer prevention PLoS One 9: e114764

2 CHO, J.Y., et al (1997) High level of urokinase- type plasminogen activator is a new prognostic marker in patients with gastric carcinoma Cancer, 79:878-883

3 DANIEL M., et al (2015) Epigenetic linkage of aging, cancer and nutrition J Exp Biol 218: 59-70

4 PETERSEN, L.C., et al (1988) One-chain urokinase-type plasminogen activator from human sarcoma cells is a proenzyme with little or no intrinsic activity J Biol Chem., 263:11189-11195

5 PHAM N.K (2012) Nicotine stimulates urokinase- type plasminogen activator receptor expression and ceil invasiveness through mitogen-activated protein kinase and reactive oxygen species signaling in ECV304 endothelial cells Toxicol Appl Pharmacol., 259: 248-256