Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật dựa trên PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt là Bacillus anthracis đang được quan tẩm.. anthracis Việt Nam được tách[r]
(1)NGHIÊN CỨU TRÌNH Tự CÁC GEN TIÊU BIỂU VÀ PHÁT TRIÉN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR MỚI CHẦN ĐOÁN
BACILLUS ANTHRACIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM
ThS Đinh Thị Thu Hằng, ThS Nguyên Thanh Việt T - , í ~ * ^ * I P A V n ỉ Ị Ị M A w 'jSm , / ì t u n y ta m A rt* i f is ỉiiti r Lsurvx* risjK* V /C Í I W u c m y
ThS Nguyễn Văn An (B M K V isinh y học, Bệnh viện Q u âtiy 1Ó3, Học viện Quân ý)
Hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thái sớ n BMK Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y TÓM TẮT
Nghiên cứu phát triển kỹ thuật dựa PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt Bacillus anthracis quan tẩm Trong cơng trình này, gen vrrA nhiễm sầc thể, gen độc lực pagA, cya, le f (plasmid pX01), capA, capB, capC (plasmid pX 02) từ chủng B anthracis Việt Nam tách dịng và giải trình tự hồn chỉnh Đã xác đính đột biến thêm nucleotide A gen vrrA, đột biến đồng nghĩa, đột biến sai nghĩa gen pagA đột biến đồng nghĩa gen cya Đặc biệt, đột biến sai nghĩa lần đấu tiên được phát gen capA chủng B anthracis Ba1 Cốc gen lại tương đồng 100% so với chủng tham chiếu B anthracis Vollum-USA Đồng thời, phản ứng PCR đa mồi chứa chứng nội thiết kế để phát hiện xác B anthracis Đày công bố đủ chi tiết nước trình tự gen tiêu biểu B anthracis phát triển cõng cụ hữu Ịch cho phép chẩn đoán nhanh B anthracis gây bệnh.
Từ khóa: Chứng nội tại, độc lực, PCR đa mồi, vi khuẩn than, Việt Nam, SUMMARY
COMPLETE SEQUENCE ANALYSIS OF THE TYPICAL GENES OF BACILLUS ANTHRACIS AND DEVELOPMENT OF A NOVEL MULTIPLEX PCR FOR VIRULENT BACILLUS ANTHRACIS DETECTION IN VIETNAM
Dinh Thi Thu Hang, Nguyen Thanh Viet Bio-medical and Pharmaceutical Applied Research Centre, Vietnam Military Medical University
Nguyen Van An, 103 Hospital, Vietnam Military Medical University Development o f PCR-based techniques for rapid and accurate identification o f bioterrorism agents, especially Bacillus anthracis is interest in recent years In this study, the entire sequences o f the vrrA gene (chromosome), pagA, cya, le f genes (virulence plasmid pX01) and capA, capB, capC genes (virulence plasmid pX 02) o f ten B anthracis strains Ba1-10 isolated in Northern Vietnam were cloned and analyzed One insertion mutation at nucleotide position 346 A in the vrrA gene (10 strains), one synonymous and two missense mutations in the pagA gene and one synonymous mutation in the cya gene (Ba3, 4) Interestingly, one missense mutation was first identified in the capA gene o f B anthracis strain Ba1 The remaining genes had 100% similarity in comparison to the B anthracis references In addition, a multiplex PCR assay with primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1, including recombinant internal amplification control was developed fo r detection o f virulent B anthracis strains This is the first report in Vietnam that investigates the full-length o f the vrrA gene and some typical genes on virvlence plasmids pX and pX as well as develops a useful molecular tool for rapid detection o f virvlent B anthracis in Vietnam.
Keywords: Bacillus anthracis, internal amplification control, multiplex PCR, virulent, Vietnam.
(2)có thêm liệu tương đối hồn chình số gen tiêu biểu chủng B anthracis phân iập Việt Nam Trên sở kếỉ phân tích trinh tự này, kết hợp với nghiên cứu giới để phát triển kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) tối ưu với ba gen đích nhiễm sắc thể, pX01, pX02 chứng nội tái tổ hợp (IC) xác định xác B anthracis gây bệnh tự nhiên Như vậy, cơng trình nghiên cứu có hai mục tiêu sau:
Phân tích trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (trên nhiễm sắc thể), gen độc lực pagẤ, cya, lef (plasmid pX01) capA, capẻ, capC (plasmid pX02) của chủng B anthracis phân lập Việt Nam.
Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tái tổ hợp xác định nhanh, xác B anthracis gây bệnh tự nhiên.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN cứ u V ậỉ liệu
Cac chủng vỉ khuẩn: Mười chủng vi khuẩn B anỉhracis phân lập từ bệnh nhân, gia súc chết bệnh than môi trường cung cấp Học viện Quân y Viện Y học Dự phòng Quân đội, Cục Quân y (Ba1-Ba10) Trong đó, có chủng B aníhracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 Ba4), chủng B anỉhracis có pX01 (Ba6), 6 chủng cịn lại B anthracis không độc Chủng B cereus Bc1 ổược sử dụng làm đổi chứng ắm
Cac cặp mồi đặc hiệu thiết kế để nhân toàn gen vrrA (chromosome), pagA, cya, ief (pX01) capẦ, capB, capc (pXÓ2) sử dụng phần mềm primer3pius Ba cặp mồi phát qen vrrA, pagA, capA phản ứng mPCR the chi tiết bảng 1
Chứng nội (internal amplification conirol-IC): Plasmid tái tồ hợp JET1.2-capA-IC1 thiết lập nghiên cứu trước nhóm tác giả [3] đăng ký sáng chế (Phụ lục 2) Plasmid thiết kế theo hướng sử dụng chung với cặp mồi chẩn đoán capAF1/R1 (Bảng 1)7
Bảng Các moi sử dụng phản ứng mPCR chứa IC
Gen đích Trình tự (5'-3’)
Kích thước
(bp) vrrA
(nhiễm sắc thể)
vrrAF1 :CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA vrrARI :CCTCGCGCACTTCT TTTTCT 222 pagA
(plasmid pX01)
pagAF1 :AAATGGAGCACGGCTTCTGA pagARI :AGCCTGTATCCACCCTCACT 751 capA
(plasmid pX02) PJET1.2-capA-ICI
capAFI :TGACG ATGACG ATGGTTGGT capARI:
GCTTCCTGTCTAGGACTCGG
610
1000
Phương pháp
Nghiên cứu thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mô tả, phân tích phịng thí nghiêm thực địa, sử dụng kỹ thuậí vi sinh kinh điển sinh tìọc phân tử
Các kỹ thuậỉ tóm tắt sau:
Tách dòng giải trinh tự: Chủng vi khuẩn than bấí hoạt đieu kiện 121°C/20 phút sau tách DNA tổng số theo quy trình nhà sản xuất (QIAamp DNA Mini Kit) Phản ứng PCR có độ xác cao thực máy PCR Eppendorf Mastercycíer pros (Đức) sử dụng hóa chat PCR High Fidelity (Thermo scientific) Sản phẩm PCR tinh kií GeneJet PCR purification dịng hóa vào vector pJET1.2/blunt (Thermo scientific) Các piasmid tái tổ hợp sau khỉ kiểm tra có chứa gen mong muốn giải trình tự theo nguyên lý Sanger máy ABI 3730XL, sử dụng phần mềm Bioeđit Genious R7 để xử lý, nối ghép tạo trinh tự toàn gen đích, so sánh phân tích trinh tự thu với trình tự tham chiếu Genbank
Multiplex PCR chứa chứng nội tại: Từ kết giải trình tự, phản ứng FCR đa mồi chứa chứng nội ổược thiết kế đề phát xác chủng B anthracis gây bệnh tự nhiên Chứng nội bồ suríg vào mẫu trình tách chiết DNA với nồng độ khác để xác định lượng tối thiểu vừa đủ phát Các thử nghiệm tiến hành song song với mẫu không chứa IC để so sánh mẫu đối chửng âm (nước deion) để kiểm soát ngoại nhiễm nhiễm chéo
Phản ứng mPCR có thành phần sau: 1X Dream Taq Buffer; 2t0U Dream Taq Polymerases; dNTPs 0,25 mM ioại; 0,6-0,64 (aM mồi xuôi, mồi ngược loại, khoảng 10 ng DNA khn, điều chỉnh H20 đủ thể tích 25 Ị i l (Thermo scientific) Chu trinh mPCR thiết kế: Biền tính 94oC/4 phút, !à 30 chu kỳ (940C/45 giây; 56oC/40 giây; 72oC/40 giây), sau hồn thành keo dài chuỗi 72° 6
phút Sản phẩm mPCR điện dí kiểm tra gel agarose 1,5% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide chụp ảnh ánh sáng u v (UVP Eppendorf)
Công trình thực Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học Bộ môn Khoa Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y từ tháng 05/2014 đến tháng 02/2015
KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u
1 Nghiên cứu trình tự gen đặc trưng gen
độc lực B anthracis
Gen vrrA (chromosome): Kết phân tích tồn gen vrrA 10 chủng B anthracis nghiên cứu cho thấy gen vrrA giống hoàn tồn trình tự nucleotide chủng B arìthracis tương đồng từ 99-100% so vởi chủng tham chiếu So với chủng B anthracis Vollum-USA, trình tự gen vrrA chủng phân lập Việt Nam sai khác nucleotide (thêm nucleotide A vị trí 346)
(3)Ames Ancestor, BFV Trong đó, gen ief có trình tự giống tương đồng 100% so vởỉ chủng tham chiếu
Gen capA, capB, capC (pX02): Trên pX02, đột biến sai nghĩa hoàn toàn (A->G)1048 xác định gen capA chủng B anthràcis Ba1 làm thay đồi amino acid lysine íhành aiamic Đây !à đột biến
trước chưa tìm thấy nghiên cứu giới khẳng định đay ià đột biến mới, phát chủng Việt Nam (Ba1) (Hình 1) Hai gen cịn lại capB, capC cổ tính bảo tồn cao, khong xảy đột biến điềm chùng nghiên cứu
1 1 Í -.0 1 0
í - I - I I I I - • • • • ! • • • • ! - • • • ! ■ ■ ' • < I i - i i : * - : C P 0 S S V o l l u m T M W T A T T C A RGM JGGJ.TCA C C M LÃ S C C aÕ T T Ã C C A G TC C A T T G C A T Ằ A A 7J.T C G TG T G T f.T C G T C M T T W C A A W kC R ? A C M J C C W G G G TG C TC TATG
A A E B Ũ 0 4 H H R U S A B C 7 CDC Ể KZ- K N A B r 0 A Á Ẽ S 0 0 A u s t r a l i a « N Z C P 0 7 B F V O S A J B I C 0 0 C a r b o s a p C P 0 8 H Y 0 c NZ ABDH02000062 T s t a n k o v s « ~ K M S Z im b a b w o G H C ~ Ũ I A 2 HC~ 0 3 A m e s A n c e s t o r + T B o l V i e t n a m .<5 B&3 V i e t n a m B a V i e t n a m * lOXO 10' 10 ! 110 _I I i I I - Ì -I I « > I I I I I I I - - I i C P 0 6 V o l l o t t T A iO ^ ÌA IT T C Ã A G A C G G A T C A C C A A A A C C a G ĨĨA C O A G T C C X T T C C A T A A A A A T C O T C T C T A T C G T C A A T T S A C A a A A G Ís T A C A T C C A A C G C T C C T C T A T C
i , I E ~ p K !■ V -i L' Ì- - K >f R V V R s i , ~ K r> f a is > f - « A A E R 0 0 4 K K A Ư A ! i s !> K i- V ý: I i> K R V < Si i ỉ T T K Í ! !•' K Vi
HC_012S77 coc 684
L ~ V E -X - K V t >> ! i - u> s w R V V R •; i T K D •; £ K Ĩ , w N Z K S S A B r 0 -
- K •• ~ V K '■ V r '• !, 15 K :: R V a T X a : * K t I A A E S 0 0 A u s t r a l i a «
Ĩ ■} s ;; !' K ?■ V V Ũ I o K s B V ■/ p c- - T K 'ã> ' K - ~ ô
N Z C Ẽ 0 7 B F V Ư S A - " r o K s p K Ĩ V :■ E > o K i: R V V H Q T K !j K K ■; Si J P I G 0 0 Z C i r b o s a p , -
L r K c :: !• K f- •; c T - K X- s V P- ’2 L T K & T n K a A ;i
C P 0 8 H Y O O l .G - V í Q K s !■ K t> V s ft i I’r K t ỉ K V T « (,1 r, V K r ¥ K -V s z A B D N 0 0 T o l a n k o v s “ L X' £ •: s r K ;■ V T n <\ o K R V R c- T K D ■' r i K ft V N Z _ K N ii B b a b w a G
V T V- r :: e ?; r V i! h i c K R 1> V R Í •- 1’ K y K A n K C 0 A Z -
- ; i I 15 ÍỈ p K f- V r s T o K ! í s V ' ỉ s Q - ~ K ■ s K •: V N C 0 3 J U u b s A n c a s t o r , - ^ - -
B a l V i e t n a m y ' ' * p ' I ' * ’ ’ B o V l « t n u m V
Ỉ : i z ■:> E r r ỈT r V T A — D ĨC R V V B c- T K ữ K v i A K Ba4 V i e t n a m ( i V < !■ y :• V ■ ! ì K •- H V V Fi i ■( K i t ■■■ K s Í >■
Hình So sánh trình tự nucleotide amino acid cùa gen capA Ờ chủng B anthracis Ba1, Ba3, Ba4 VỚỈ12 chủng B anthracis thạm chiếu Genbank (đoạn nucleotide có xẩy đột biến điểm) Các chủng tham chiếu ký hiệu theo thứ tự mã số, tên chủng/phân lập, nguồn gốc chủng, dấu chấm biểu thị nucleotide giống nhau, có đọt biển se đưọ-c
biểu thị nucleotide.
Như vậy, qua phân tích trình tự tồn gen vrrA (nhiễm sac thể), pagA, cya, lef (pXÒ1), capA, capB, capC (pX02) cho thấy: Sự sai khác trình tự nucleotide gen đích chủng nghiên cứu chùng tham chiểu không nhiều Trinh tự đầy đủ gen phân ịập đăng ký Genbank với mã sổ: KP2131Ò2, KP213103, KP213104, KP213105-7, KP759885-7, KP759888-93 (Phụ lục -1 )
2 Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR đa mồi
chửa chứng nội tái tổ hợp xác định B anthracis
Để xác định B anthracis có độc lực, cần chl chủng vi khuẩn than có chứa đồng thời 2
plasmid độc íực pX01 pX02 Phản ứng mPCR thiềt kế với cặp mồi ià vrrAF1/R1, pagAF1/R1 capAF1/R1 để xác đính có mặt cùa gen tương ứng đặc trưng cho B anthracis Sản phẩm mPCR khuếch đại đồng thời gen đích B anthracis cỏ kích thước 222, 751 610 bp xảc định gen tương ứng vrrA, pagA capA với sển phẩm khuếch đại plasmid IC (sử dụng chung
cặp mồi capAF1/R1, cho sản phầm có kích thước 1kb) dề dàng phân biệt tren điển di (Hình 2)
IC 1000 bp
pagA 751 bp capA 610 bp
vrrA 222 bp
Hình Xác định B anthracỉs gây bệnh tự nhiên bằng mPCR chứa chứng nội
M: Marker 100 bp (Thermo scientific), ĐC {-): Đối chứng âm; ĐC(+): Đối chưng dượng sử dụng plasmid chứa cac
(4)BÀN LUẬN
Việc phân tích trình tự gen đặc írưng gen độc lực chủng B anthracis phân lập Việt Nam quan trọng Đây cơng bố đay đủ nước trình tự nucleotide gen vrrA gen đặc trưng hai plasmid độc lực pX01, pX02 Kết cho thấy, sai khác trình tự nucleotide gen đích chủng nghiên cứu chủng tham chiếu không nhiều Mức tương đồng cao phản ánh tính đa dạng di truyền thấp cùa chủng B anthracis Một phần kết công bố cơng trình nghiên cửu gần nhóm tác giả [2], Đột biến xảy lý giải B anthracis có khả hỉnh thành bào tử, tồn írong đất qua nhiều thập kỷ Do đó, hội để tích lũy đột biến DNA bị hạn chế, dẫn đến biến đổi dí truyền tương đối íỉ [7] Từ đó, việc thiết kế kỹ thuật PCR chẩn đoán B anthracis thư nghiệm dựa írên chủng phân lập nước hồn tồn chần đoán với chùng từ khu vực khác giới Đột biến (A->G)1Q48 xác định gen capA chủng B ànthracỉs Ba1 co íhề có ý nghĩa đa dạng di truyền gen capA, nên đưực quan tâm nghiên cứu, lựa chọn chủng cho nhiều mục đích khác
Đến nay, cơng bố phương pháp chẩn đốn phân tư đề cập đen chứng nội IC [6,8] Chứng nội ià cần thiết gần bắt buọc phàn ứng chẩn đoán dựa PCR Một số cơng trình nghiên cứu IC thường ià bổ sung giài đoạn phản ứng khuếch đại nên khơng kiểm sốt q trỉnh tách chiết acid nucleic [10,12] Trong cơng trình này, để kiểm sốt tồn cơng đoạn xềí nghiệm, lị bổ sung vào mấu trinh tách chiết với iượng tối thiểu phat nhằm loại bổ tối đa anh hưởng đến hiệu ỉẩch chiết mPCR Nồng độ ỈC sử dụng ià 5x104copies/phản ứng (chi tiết trinh tối ưu mPCR chứa IC công bố báo gần cùa nhóm nghiên cưu [4]) Sản phẩm IC xuấỉ tất mẫu điện di, điều chứng tổ trinh tách chiết mPCR đảm bảo, theo kết xác định đáng tin cậy (Hình 2)
Có nhiều phương pháp từ đơn giàn đến phức tạp sử dụng để phát B anthracis Nuôi cấy, định danh môi trường thạch máu địi hỏi nghiêm ngặt vấn đề an tồn sỉnh học Một số phương pháp mien dịch phát kháng nguyên độc tố B anthracis có ứng dụng hạn chế đọ nhạy độ đặc hiệu thấp Phản ứng mPỊR cơng trình thực đơn giản cho phép xác định nhanh, xác B anthracis gây bệnh tự nhiên Điểm đặc biệt chỗ, mPCR có chứa ba cặp mồi dùng đề khuếch đại đồng thời bốn sản phẩm gom ba gen đích vrrA, pagA, capẠ B anthracis gen IC Phản ứng khắc phục tượng đương tính gia trường hợp chủng B anỉhracis không đay đủ độc lực, giúp giam giá thành thời gian chẩn đoán so với việc phai thực phản ứng đơn Mặt khác, IC tái ỉồ hợp bổ sung vào mẫu trình tách chiết ADN khuếch đại đồng thời phản ứng
mPCR tối ưu cho phép xác minh kếí chẩn đốn, loại bỏ tượng am tính giả
KẾT LUẬN_VA KIẾN NGHỊ
Kết luận: Trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (nhiễm sắc thể), gen độc lực pagA, ief, cya (plasmid pX01) capA, capB, cape (plasmid pX02) 10 Chung B anthracis Việt Nam có sài khác khơng nhiều so vởi thể giới Một đột biến (A-»G)1048 xác định gen capA chủng B anihracis Ba1 Đòng thời, phát triển thành công kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tái íổ hợp xác định nhanh, xác B anthracis gẩy bệnh tự nhiên
Kiến nghị: Đánh giá khả phát kỹ thuật mPCR chứa IC xác định B anthracis thực địa chế tạo kit mPCR đa mồi chẩn đốn xác B anthracis
Lời cảm ơn: Công trinh hồn thành nhờ tài trợ kinh phí cùa Chương trình CNSH phục vụ An ninh, Quốc Bộ Quốc phịng chủ quan thơng qua nhiệm vụ “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than dịch hạch” Mã số: 2013.75.58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn Xuân Thanh Nghiến cứu đặc điểm di truyền phan tư mội số yếu tố độc lực cùa chủng Baciiỉus anthracis lưu hành khu vực mien núi phía Bắc Việt Nam Hội nghị khoa học Công nghệ Sinh họctọàn quốc 2013 2013 pp 594-8
2 Đinh Thị Thù Hằng, Sơn Nguyễn Thái Nghiên cứu tồn trình tự gen pagA số chủng Bacillus anthracis phân lập miền Bắc Việt Nam Tạp chí Y Dược học Quân 2015 40(3), pp 135-143
3 Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng Tuyên c s Thiết kể chửng nội tái tổ hợp phản ứng multiplex PCR chần đốn Bacillus anthracis Tạp chí Y Dược học Quân 2015.40(6), pp 17-26
4 Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thối Sơn, Minh Nghiêm Ngọc, Phát triền phản ứng multiplex PCR chứa chứng nội ỉái tổ hợp xác định đồng thời vi khuẩn Bacillus anthracis Yersinia pesíis Tạp chí Y học Dự phịng 2015 XXV(8 (168)), pp 239-246 _
5 Candela, I , Mock M., and Fouet A CapE, a 47- amino-acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis poiygiutamate capsule synthesis J Bacterioi 2005 187(22), pp 7765-72
6 Eíỉerbrok, H., Nattermann H.t Oze! M., et a! Rapid and sensitive identification of pathogenic and apathogenic Bacillus anthracis by real-time PCR FEMS Microbiol Lett 2002 214(1), pp 51-9
7 Hugh-Jones, M and Blackburn J The ecology of Bacillus anthracis Mol Aspects Med 2009 30(6), pp 356-67
8 Kiee, s R., Ozel M., Appel B., et a! Characterization of Bacillus anthracis-like bacteria isolated from wild great apes from Cote d'Ivoire and Cameroon J Bacteriol 2006 188(15), pp 5333-44
9 Letant, s E., Murphy G A., Alfaro T M., et a! Rapid-viabiiity PCR method for detection of live, virulent Baciiius anthracis in environmental samples Appl Environ Microbiol 2011 77(18), pp 6570-8 _
(5)Yersinia pesiis in sputum by real-time PCR J Clin Microbiol 2003 41 (10) pp .4873-5 _
11 Lovchik, J A., Drysdale M., Koehler T M , et aỉ Expression of either lethal toxin or edema toxin by Bacillus anthracis is sufficient for virulence in a rabbit model of inhalational anthrax Infect Immun 2012 80(7), pp 2414-25
12 Ngan, G J „ Ng L M., Lin R I , et a! Development of a novel multiplex PCR for the detection and differentiation of Salmonella enterica serovars Typhi and Paratyphi A Res Microbiol 2010.161(4), pp 243-8
PHỤ LỤC
Phụ lục gồm:
Phụ lục Các báo công bố liên quan đến cơng trình
Đinh Thị Thu Hằng Nguyễn Thái Sơn Nghiên cứu tồn trình tự gen pagA ỉren số chủng Bacilius anthracis phân íập miền Bắc Việt Nam Tạp chí Y Dược học Quân 2015.40(3), pp 135-143
Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng Tuyên CS Thiết kế chửng nội tái tổ hợp phản ứng multiplex PCR chẩn đoan Bacillus anthràcis Tạp chí Y Dược học Quân 2015.40(6), pp 17-26
Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc Minh Phát triền phàn ưng multiplex PCR chứa chửng nội tải tổ hợp xác định thời vi khuẩn Bacillus a n i u i a ^ i S V O t o r s i n i c a p c ? d ik > i <?ụ C m I Ỵ I t y i s U Ự f J i i U n y 2015 XXV(8 (168)), pp 239-246
Phụ lục 2, Đăng ký sáng chế Cục Sở hữu Trí tuệ Việt Nam Phiếu kết phân tích cua Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin vồ Sinh phẩm y tế
Phụ lục -17 Trinh tự gen giải trình tự chủng B anthracis phân lập Việt Nam đăng ký Genbank
Phụ lục 18 Giấy xác nhận ứng dụng kết đề tài (Phụ íục có minh chứng kèm íheo Báo cáo toàn văn đầy đu)
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỊNH DANH LOÀI MỘT SỐ CHỦNG NẤM MEN VÀ XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐÈ KHÁNG VỚI THUỐC KHÁNG NÁM BẰNG PHƯƠNG PHAP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH
Ths Ngô Thị Minh Châu, TS.Tôn Nữ Phương Anh, CN Đ ỗ Thị Bích Thảo
Bộ mơn Ký Sinh Trùng - Đại học Y Dược Huế, Việt Nam
TS Antoneila Santona, TS Siĩvana Sana, GS.Piero Cappucineỉli
Khoa Vi sinh lâm sàng thực nghiệm - Đại học Sasarí, Cộng hịa Ý
TĨM TẮT
Nấm men tác nhàn gây bệnh quan trọng người, đặc biệt bệnh nấm Candida sp bệnh phò biến Nghiên cứu tiến hành irên 121 chung nấm men phân lập Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế Bệnh viện Trung ương Huế.
Mục tiêu: Định danh loài so chủng nấm men phân lập từ câc bệnh nhàn chẩn đốn nhiễm nấm nơng nấm sâu vả xác định tỷ lệ đề kháng với số thuốc kháng nấm Phương pháp nghiên cứu: Chúng âp dụng kỹ thuật khối phổ MALD! - TOF (Maldi Tof Mass: Matrix-assisted laser desorption/ionization Mass Spectrometry), kết hợp với kỹ thuật PCR giải trình tự gen để định danh loài vi nấm Kháng nấm đồ thụ-c hiền phương pháp khuếch tán đ a thạch Kết quả: Có 121 chủng nấm phân lập được,
C.albicans 43,80% lồi c non albicans khàc gồm: C.ỉrópicalis 17,35%, c.parapsilosis 12,41%, c.glabrata
7,44%, c.orthopsilosis 4,96%, c.metapsilosis 0,83%, c.krusei 3,30%, c.guilliermondii 3,30%, c.famata 1,65%, c.norvegensis 0,83%, c.mesorvgosa 0,83% Ngoài chúng tơi phân lập số lồi nấm men khác như: Geotríchum capitatum 1,65%, Tríchosporon asahii 1,65% Đânh giá nhạy cảm loài vi nấm Candida sp có tần xuất phân lập cao nghiên cứu ghi nhận 100% nhạy càm với amphotericin B nystatin Tỷ lệ đề khàng C non albicans yà c albicans với fluconazole itraconazole 40,74%, 3,77% 5,66%, 50% Kết ghi nhận 20,37% c non albicans 18,86% c albicans đề kháng với 5- fluorocystocine Tỷ lệ đề kháng với caspofungin c non albicans c albicans lần iưọt 7,41% 13,2% Kết luận: Giống Candida sp chiếm ƯU với loài c albicans có tỷ lệ cao Một số lồi Candida non albicans biếm gặp phân lập nghiên cứu này: c orthopsilosis, c.metapsilosis, c.norvegensis, c.mesorugosa Ngoài cắc loài nấm men khác định danh gồm Geotríchum capitatum Trichosporort asahii Tất lồi Candida sp nhạy càm tot với amphotericin B nystàtin, có tỷ lệ đáng kề c non albicans đề kháng với kháng nấm thuộc nhóm azole.
Từ khóa: Nấm men, Candida sp, kỹ thuật khối phổ MALDI - TOF, khống nấm đồ, đề kháng.
SUMMARY
APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUE TO IDENTIFY YEASTS SPECIES AND EVALUATION
ANTIFUNGAL SUSCEPTIBỈL YTI TESTING BY DISK DIFFUSION METHOD ' _ _ _ _