Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh tswv (Tomato spotted wilt virus) trên cây ớt bằng kỹ thuật elisa và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật rt - pcr
i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Bùi Cách Tuyến tận tình hƣớng dẫn tạo điều kiện cho em thực khóa luận Em xin cảm ơn thầy Bùi Minh Trí tận tình bảo hỗ trợ cho em suốt thời gian thực khóa luận Con cảm ơn Ba, Mẹ ln dành tình thƣơng cho con; dạy dỗ, động viên con; chỗ dựa vững tinh thần vật chất cho suốt thời gian qua Em xin cảm ơn Anh, Chị Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh hết lịng giúp đỡ, đóng góp nhiều kinh nghiệm q báu cho em hồn thành tốt khóa luận Em chân thành cảm ơn anh Cƣờng- Viện Cây Ăn Quả miền Nam, anh Dũng- Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tiền Giang, anh Vinh- Trạm BVTV Tân Phú- Định Quán cung cấp tài liệu tạo điều kiện thuận lợi cho em thu thập mẫu thí nghiệm Cuối cùng, em xin cảm ơn Thầy, Cơ Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học tận tình dạy bảo, dìu dắt em suốt quãng đƣờng sinh viên Cảm ơn bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 ln bên cạnh mình, đóng góp, động viên học tập nhƣ sống TP HCM, Tháng năm 2005 Nguyễn Thị Thùy Dƣơng iii TĨM TẮT NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2005 “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Bùi Cách Tuyến Đề tài đƣợc tiến hành hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh- Bộ Mơn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Thời gian thực từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 Nội dung thực hiện: - Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng đu đủ hai tỉnh điều tra - Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đốn đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm vịng hai tỉnh - Thiết lập quy trình RT-PCR để phát PRSV với đối tƣợng thí nghiệm mẫu dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA Kết đạt đƣợc theo phƣơng pháp DAS ELISA - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng địa điểm Xã Mỹ Hiệp 92,68 % Xã Bình Thạnh 77,42 % Xã Phú Tân 47,37 % Xã Phú Lộc 47,37 % Xã Phú An 16,00 % - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vịng theo giống Da bơng (Db) 86,54 % Mã Lai (Ml) 80,00 % Địa phƣơng (Đp) 34,92 % - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi - tháng (chƣa trái) - tháng - 11 tháng Trên 1năm iv 70,00 % 85,71 % 12,50 % 36,11 % Kết đạt đƣợc theo phƣơng pháp RT-PCR - Cặp mồi không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein PRSV-P song khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn - Cặp mồi P4-M30 P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein PRSV-P Kết giải trình tự số mẫu - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 619 bp - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 410 bp - Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 412 bp So sánh trình tự vừa giả đƣợc với trình tự coat protein genome PRSV-P Genebank, thấy có tƣơng đồng cao Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14M31 P7-M30 đợc khuếch đậi từ gen coat protein PRSV-P Nhƣ vậy, xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán PRSV đu đủ phƣơng pháp RT-PCR với cặp mồi P14-M31 hay P7-M30 v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT .iv MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG xi DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ xii PHẦN I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích .2 1.3 Yêu cầu 1.4 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc đu đủ (Carica papaya L ) 2.1.1 Phân loại học 2.1.2 Nguồn gốc, phân bố .4 2.1.3 Đặc điểm thực vật học 2.1.4 Nhu cầu sinh thái 2.1.5 Ý nghĩa kinh tế giá trị dinh dƣỡng đu đủ 2.1.5.1 Giá trị dinh dƣỡng 2.1.5.2 Ứng dụng thực tiễn 2.1.6 Tình hình sản xuất 2.1.7 Sâu bệnh 2.1.7.1 Các lồi trùng gây hại 10 2.1.7.2 Các bệnh phổ biến đu đủ 10 2.2 Sơ lƣợc Papaya ringspot virus tác hại đu đủ 11 vi 2.2.1 Khái niệm chung bệnh virus hại thực vật 11 2.2.2 Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) 15 2.2.3 Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV 20 2.2.3.1 Phƣơng pháp quan sát triệu chứng 20 2.2.3.2 Phƣơng pháp thị 20 2.2.3.3 Phƣơng pháp chẩn đoán hiển vi điện tử .21 2.2.3.4 Phƣơng pháp huyết học .21 2.2.3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử .22 2.2.3.6 Các phƣơng pháp khác 22 2.2.4 Sơ lƣợc phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay 22 2.2.5 Sơ lƣợc kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) 24 PHẦN III .27 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu 27 3.3 Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng đu đủ (Papaya Ringspot Desease) 28 3.3.1 Dụng cụ thiết bị .28 3.3.2 Hóa chất .29 3.3.3 Quy trình thực 31 3.3.3.1 Phƣơng pháp ELISA .31 3.3.3.2 Phƣơng pháp RT-PCR 35 PHẦN IV .39 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .39 4.1 Hiện trạng canh tác đu đủ nơi lấy mẫu .39 4.2 Kết thu đƣợc từ thí nghiệm với kit DAS- ELISA 40 4.2.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra 40 4.2.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống 42 4.2.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi .43 4.3 Kết thí nghiệm PCR .44 4.4 Kết giải trình tự số mẫu 53 vii PHẦN V 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56 5.1 Kết luận .56 5.2 Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .58 PHỤ LỤC 61 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid CP gene: Coating protein gene DAS ELISA: Direct double antibody sandwich DMSO: Dimethylsulforxide DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease dNTP: Deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EIA: Enzyme immunoassay ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EtBt: Ethidium bromide FDA: Food and Drug Administration MMLV: Moloney murine leukemia virus mRNA: Messenger RNA OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction p-NPP: p- nitrophenyl phosphate PRSV: Papaya ringspot virus PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20 RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra violet ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây đu đủ Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus 12 Hình 2.3 Các dạng thể vùi virus tồn mơ 16 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh 17 Hình 2.5 Đối chiếu bệnh (bên trái) khỏe (bên phải) 18 Hình 2.6 Triệu chứng cuống 18 Hình 2.7 Myzus persicae (trái) Aphis gossypii (phải) .19 Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA 24 Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất chu kì nhiệt chuẩn 44 b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn chu kì nhiệt 44 Hình 4.2 Kết chạy PCR với cặp mồi 45 Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi xuôi 46 Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi ngƣợc 47 Hình 4.5 Kết chạy PCR với cặp mồi P7-M30 50 Hình 4.6 Kết chạy PCR với cặp mồi P14-M31 51 Hình 4.7 Kết chạy PCR với cặp mồi P7-M30 52 x ... Nai Đồng Tháp - Chẩn đoán nhanh đánh giá tình hình nhiễm bệnh kit ELISA - Xây dựng quy trình RT- PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vịng đu đủ - Phân tích trình tự gene số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu... Chí Minh, tháng năm 2005 “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS -ELISA VÀ RT- PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP” Giáo viên hƣớng dẫn:... vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu đu đủ (Carica papaya L.) đƣợc lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp - Phạm vi nghiên cứu Chẩn đốn đánh giá tình hình nhiễm bệnh phƣơng pháp DAS-ELISA
