Chương Biểu gen tái tổ hợp Escherichia coli Vector biểu vector mang gen ngoại lai mong muốn cho phép thực phiên mã tạo dòng dịch mã mRNA chúng Escherichia coli Những vector dùng để biểu gen eukaryote E coli tăng hiệu suất sản phẩm gen prokaryote Mặc dù E coli vật chủ lý tưởng để biểu gen eukaryote chúng khơng có khả sửa đổi hậu dịch mã (post-translation modification) cho chuỗi polypeptide protein có cấu trúc phức tạp Tuy nhiên, số trường hợp người ta sử dụng vi khuẩn E coli cho protein có cấu trúc đơn giản Đối với protein có cấu trúc phức tạp, vật chủ thường sử dụng thể eukaryote (ví dụ: nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger…) chúng hậu dịch mã Để biểu tất gen ngoại lai E coli phải bắt đầu việc gắn đoạn gen ngoại lai vào vector biểu (thường plasmid) Vector phải có đủ cấu trúc cần thiết sau: - Trình tự khởi đầu chép (ori) để tạo nhiều tế bào vật chủ - Các trình tự mã hóa gen thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo trì vector tế bào - Một promoter kiểm sốt phiên mã (ví dụ: lac, trp tac) cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gen tạo dịng - Các trình tự kiểm sốt dịch mã trình tự liên kết ribosome bố trí thích hợp codon khởi đầu AUG - Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào hướng xác với promoter Chỉ cấu trúc đầy đủ thế, vector biểu mang gen ngoại lai biến nạp vào chủng E coli thích hợp Chương mơ tả phương pháp plasmid vector sử dụng để sản xuất protein dung hợp (fusion protein) protein nguyên thể (native protein) vi khuẩn Các protein dung hợp sản xuất với lượng lớn, dễ dàng tinh dùng để gây đáp ứng miễn dịch Các protein nguyên thể sản xuất vi khuẩn cách gắn promoter mạnh trình tự liên kết ribosome hiệu ngược hướng với gen tạo dịng (vùng 5’ khơng dịch mã) Thơng thường, protein biểu mức độ cao thể vùi khơng hịa tan I Sản xuất protein dung hợp Protein dung hợp Protein dung hợp (protein lai) mã hóa gen lai dung hợp in vitro hai đoạn gen khác Vì vậy, protein dung hợp mang trình tự amino acid hai protein khác biệt (Hình 7.1) Hình 7.1 Protein dung hợp Bao gồm gen tạo dòng (gen A) gen khác vi khuẩn (gen B), protein dung hợp có chứa phần protein vi khuẩn SD: đoạn Shine-Dalgarno Sự dung hợp gen thực cách gắn phần mã hóa gen tạo dòng gần đầu cuối 3’ gen vi khuẩn (ví dụ: gen lacZ) Protein dung hợp có ưu điểm sau: - Protein dung hợp thường sản xuất với hàm lượng lớn khởi đầu phiên mã dịch mã điều khiển trình tự tiêu chuẩn E coli - Dung hợp trình tự ngoại lai với gen E coli thường cho kết sản phẩm ổn định protein ngoại lai nguyên thể - Protein dung hợp có khối lượng phân tử lớn so với hầu hết protein E coli dễ dàng nhận biết điện di polyacrylamide gel protein Băng protein dung hợp cắt khỏi gel, đơng khơ (lyophilize) sau nghiền thành bột dùng kháng nguyên - Protein dung hợp tiết môi trường nhờ biểu vi khuẩn gen eukaryote gắn với trình tự mã hóa cho peptide tín hiệu (signal peptide), peptide tạo chuyển dịch protein qua màng Tuy nhiên, tượng xảy vài trường hợp Các hệ thống vector biểu gen dung hợp với gen lacZ Một số hệ thống vector phát triển để biểu gen dung hợp với gen lacZ Chẳng hạn, vector họ pUR có vị trí tạo dịng BamHI, SalI, PstI, XbaI, HindIII ClaI đầu 3’ gen lacZ (Hình 7.2) Bằng cách chọn lựa vector vị trí cắt hạn chế thích hợp người ta tiến hành dung hợp cho hầu hết gen tạo dòng Trong số trường hợp, dung hợp thực cách loại bỏ đầu tận lồi làm đầy đầu tận bị khuyết trước gắn Một hệ thống vector tương tự khác phát triển để sản xuất protein dung hợp, vector biểu pEX1-3 Promoter PR điều hòa cảm ứng kiểu promoter PL bacteriophage l Các vector pEX1-3 có vị trí tạo dịng mang điểm nhận biết EcoRI, SmaI, BamHI, SalI PstI nằm đầu 3’ gen lacZ Các codon kết thúc dịch mã tín hiệu kết thúc phiên mã đặt hướng (downstream) với vị trí tạo dịng (Hình 7.3) Hình 7.2 Các vector họ pUR Đây vector dung hợp với gen lacZ, có vị trí tạo dịng BamHI, SalI, PstI, XbaI, HindIII ClaI đầu 3’ gen lacZ Chèn đoạn DNA ngoại lai (cDNA) vào vị trí tạo dịng thích hợp cho phép sản xuất protein dung hợp b-galactosidase hoạt động với chuỗi peptide mã hóa DNA ngoại lai Các vector pUR278, pUR288 pUR289 chứa vị trí PstI gen Ampr Các vector pUR290, pUR291 pUR292 chứa vị trí PstI vùng tạo dịng vị trí PstI gen Ampr bị loại bỏ Sử dụng plasmid vector tiện lợi đoạn DNA ngoại lai quan tâm tạo dòng vị trí PstI phương pháp GC Hình 7.3 Vector pEX2 Plasmid vector dài khoảng 5,8 kb thiết kế để biểu đoạn DNA ngoại lai (cDNA) dung hợp đầu 3’ gen lacZ Phần tận amino gen lacZ thay số trình tự gen cro bacteriophage l gen lacI E coli Promoter PR bacteriophage l (dùng để biểu protein dung hợp) điều hòa gen ức chế cIts857 bacteriophage l Vùng tạo dòng diện đầu 3’ gen lacZ, codon kết thúc dịch mã (Stop) tín hiệu kết thúc phiên mã (Term) bacteriophage fd Xây dựng plasmid biểu phát protein dung hợp Gắn plasmid vector (pUR pEX) thích hợp với đoạn DNA ngoại lai để tạo dung hợp khung đọc Biến nạp vector vào E coli (chủng K12 71/18 JM 103 cho vector pUR, chủng M5219 cho vector pEX) Kiểm tra khuẩn lạc đơn mang đoạn DNA ngoại lai mong muốn cách tách chiết DNA (DNA miniprep) plasmid vector, sau cắt enzyme hạn chế thích hợp điện di kiểm tra agarose gel Sàng lọc khuẩn lạc sản xuất protein dung hợp Phương pháp sàng lọc khuẩn lạc để phát protein dung hợp tiến hành sau: Nuôi cấy qua đêm 37oC (một lượng nhỏ) từ 5-10 khuẩn lạc mơi trường LB có chứa ampicillin Sau đó, cảm ứng nuôi cấy cách bổ sung thêm isopropylthio-β-galactoside (IPTG) cho vector pUR tiếp tục nuôi 37oC, vector pEX chuyển ni cấy 37oC lên nhiệt độ 40oC tiếp tục ni cấy (có sục khí) Sau khoảng thời gian ni cấy khác (1, 2, giờ…), lấy mL dịch nuôi cấy ly tâm nhanh để thu tiểu thể, tái huyền phù chúng đệm 1´ SDS, biến tính 100oC phút, ly tâm 12.000 g phút nhiệt độ phòng Tiến hành điện di SDS polyacrylamide gel 6% Dùng dịch huyền phù tế bào mang vector làm đối chứng Protein dung hợp xuất băng dịch chuyển chậm băng β-galactosidase đối chứng Tách chiết protein dung hợp để sản xuất kháng thể Protein dung hợp tách chiết theo số cách: dùng dịch chiết urea, sắc ký lực aminophenylthiogalactoside, điện di SDS-polyacrylamide gel phối hợp cách Phương pháp đơn giản điện di SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), trình trình bày mục (nuôi cấy lượng lớn 200 mL) Nhuộm gel phát băng protein mới, sau cắt băng khỏi gel, đông khô khoảng ngày nghiền thành bột mịn Bột dùng tiêm vào thỏ để sản xuất kháng thể II Sản xuất protein nguyên thể Các protein nguyên thể sản xuất E coli cách sử dụng promoter điều hịa mạnh trình tự liên kết ribosome hiệu Để biểu gen prokaryote có trình tự liên kết ribosome mạnh cần cung cấp promoter đủ Trong đó, để biểu gen eukaryote (hoặc gen prokaryote với trình tự liên kết ribosome yếu) cần phải cung cấp promoter lẫn trình tự liên kết ribosome (Hình 7.4) Các mức độ biểu khác từ 1% 30% protein hòa tan tổng số (total soluble protein) tế bào Hình 7.4 Protein nguyên thể Gen tạo dòng (gen A) đặt sau promoter trình tự SD vi khuẩn mRNA mã hóa amino acid đặc hiệu đoạn chèn để tạo loại protein nguyên thể § Biểu gen prokaryote: Promoter Bước biểu protein eukaryote vi khuẩn chọn vector biểu mang promoter mạnh (strong promoter) prokaryote Promoter trình tự DNA hướng dẫn RNA polymerase liên kết với DNA khởi đầu tổng hợp RNA Các promoter khác có hiệu suất khác nhau, nói chung, promoter mạnh giúp mRNA khởi đầu tần số cao Các promoter khác mang hai đoạn bảo toàn cao, xác định khoảng 10 bp khoảng 35 bp nằm vùng ngược hướng (upstream) với điểm khởi đầu phiên mã (cịn gọi vùng 5’ khơng dịch mã-5’ untranslation region) Hai đoạn đánh giá quan trọng việc xác định cường độ promoter Các promoter thích hợp cho biểu gen ngoại lai E coli promoter mà hai cường độ khả điều hòa thể mạnh Nếu sản phẩm gen tạo dòng độc (toxin) tế bào E coli sau nhân đơi gen làm cho cường độ promoter yếu promoter khơng điều hịa Sự phiên mã mức độ cao gây trở ngại cho việc chép DNA plasmid dẫn đến tính khơng ổn định plasmid Phần giới thiệu vector biểu mang promoter PL bacteriophage l, promoter (lai) trp-lac promoter bacteriophage T7 Promoter PL bacteriophage l Promoter PL phage l (Hình 7.5) promoter mạnh, có khả điều hịa tốt dùng số vector biểu Ở nhiệt độ thấp (31oC), promoter PL trì trạng thái bị ức chế sản phẩm gen cI Sau hoạt tính gen ức chế bị phá hủy cách tăng nhiệt độ ni cấy promoter PL xúc tiến phiên mã phần lớn mRNA Một vài vector sử dụng promoter PL l như: pPLa 2311, pPLa pKC30 Hình 7.5 Vector pKC30 pKC30 plasmid có kích thước xấp xỉ 6,4 kb, mang promoter PL bacteriophage l vị trí nhận biết HpaI nằm vùng hướng (có 321 nucleotides) với vị trí khởi đầu phiên mã PL Plasmid dạng phân chia vector pBR322 chứa đoạn HindIII-BamHI có nguồn gốc từ bacteriophage l chèn vào vị trí HindIII BamHI vector Đoạn chèn cDNA mang tín hiệu promoter (PL), vị trí nhận biết sản phẩm gen N (nutL), thân gen N, tín hiệu kết thúc phiên mã phụ thuộc rho (tL) Vị trí nhận biết HpaI nằm với vùng mã hóa gen N Các trình tự DNA chèn vào vị trí HpaI điều chỉnh cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan bacteriophage mẫn cảm với nhiệt độ (cIts857) Các tế bào sinh trưởng đến pha log 30oC sau thay đổi tới 40oC để bất hoạt sản phẩm gen cI mở promoter PL Vector dùng để biểu protein cII bacteriophage l với mức độ khoảng 4% protein hòa tan tổng số tế bào Promoter trp-lac Sự biểu gen tạo dòng vi khuẩn E coli điều hòa promoter khác Chẳng hạn promoter tac (một dạng promoter lai promoter trp promoter lac) sử dụng thành công để sản xuất lượng lớn protein E coli (Hình 7.6) - Promoter trp điều hòa gen ức chế trp cảm ứng bổ sung 3-IAA (3-indolylacetic acid) vào môi trường, cách thiếu tryptophan - Promoter lac điều hòa gen ức chế lac cảm ứng bổ sung nhân tố cảm ứng IPTG cho nuôi cấy vi khuẩn - Cuối promoter lai trp-lac chứa đoạn trp-35 gắn với đoạn lac-10 operator lac Boer cs thiết kế năm 1982, promoter lai trp-lac điều hòa gen ức chế lac (lac repressor) Hình 7.6 Vector pKK177-3 pKK177-3 tac vector chứa vị trí tạo dịng gen ngoại lai hướng với promoter tac Cùng hướng với vị trí tạo dòng rrnB mang gen 5S E coli hai nhân tố kết thúc phiên mã T1 T2 Promoter bacteriophage T7 Một hệ thống biểu khác phát triển Tabor Richardson (1985), Studier Moffatt (1986) hệ thống bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter (Hình 7.7) Hệ thống thiết kế cho biểu có chọn lọc gen tạo dòng Chúng cho phép mức độ biểu cao vài gen không biểu hiệu hệ thống khác Hình 7.7 Vector pET-3 mang promoter (PФ10) bacteriophage T7 Ф10 yếu tố kết thúc phiên mã Ф (TФ) Yếu tố kết thúc phiên mã tạo thể phiên mã có sức đề kháng mạnh hoạt tính exonuclease Vector pET-3a dạng phân chia vector pET-3 vùng khởi đầu dịch mã (S10) bacteriophage T7 Ф10 (protein vỏ bacteriophage T7) có mang vị trí BamHI codon 11 chèn vào Vị trí NdeI (CATATG) đặt vùng khởi đầu dịch mã sử dụng để xây dựng plasmid biểu protein nguyên thể Hình 7.8 Vector pAS1 Vector pAS1 plasmid dài khoảng 5,8 kb mang promoter PL bacteriohage l vị trí cắt hạn chế BamHI định vị codon khởi đầu ATG gen cII bacteriophage l Plasmid có nguồn gốc từ pKC30, gen cII bacteriophage l chèn vào vị trí HpaI Gen cII sau cắt bỏ enzyme exonuclease lại codon khởi đầu ATG (G ATG nucleotide vị trí BamHI) Để biểu gen bị codon khởi đầu, pAS1 cắt BamHI sau xử lý với enzyme mung-bean nuclease nuclease S1 để loại bỏ đầu lồi (đầu tận sợi đơn) Gắn DNA đầu với đoạn DNA đầu bắt đầu với codon thứ hai gen biểu đặt gen khung với ATG Các gen chèn vào theo kiểu điều hòa cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào thể tiềm tan mẫn cảm nhiệt độ bacteriophage l (cIts857) Các tế bào sinh trưởng tới pha log muộn 30oC sau nâng lên 40oC để bất hoạt gen ức chế (repressor) mở promoter PL Gen chèn vào điều hòa hoạt động protein N nutL nutR để ngăn cản kết thúc tR Hiệu suất dịch mã mRNA chịu chi phối vài yếu tố: - Mức độ bổ sung chuỗi SD đầu 3’ 16S rRNA - Khoảng cách chuỗi SD codon AUG để chuỗi DNA eukaryote định vị - Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng liên kết ribosome Đưa codon ATG vào gen tạo dịng trì vị trí liên kết ribosome (RBS) vi khuẩn cách dùng vector pAS1 (Hình 7.8) Vector pAS1 mang promoter P L RBS gen cII bacteriophage l, codon khởi đầu ATG dung hợp trực tiếp với phần mã hóa đầu tận amino gen eukaryote muốn biểu Cách làm hạn chế việc tối ưu khoảng cách chuỗi SD vi khuẩn codon khởi đầu ATG gen eukaryote để có biểu hiệu gen Đoạn DNA có gắn promoter chuỗi SD sau biến nạp vào chủng E coli thích hợp Sàng lọc thể biến nạp để thu khuẩn lạc có mức độ phiên mã cao III Xác định mức độ biểu gen tạo dịng Nói chung có ba cách thường dùng để đánh giá mức độ biểu protein ngoại lai gen tạo dòng: - Điện di polyacrylamide gel để xác định protein có kích thước thích hợp sản xuất mức độ cao tế bào mang vector biểu Thông thường, protein quan tâm quan sát cách nhuộm gel với Coomassie Brilliant Blue thuốc nhuộm bạc Nếu không thấy có băng protein dùng thuốc nhuộm này, đánh dấu trao đổi chất với 100 µCi [35S]Met [35S]Cys mL dịch nuôi cấy phút Điện di SDS-polyacrylamide gel thực phóng xạ tự ghi cho phép phát protein quan tâm - Phân tích Western blot cách dùng kháng thể liên kết đặc hiệu với protein quan tâm thẩm tích lên màng nitrocellulose sau thực diện di SDS-PAGE (xem chương 2) - Nếu mức độ biểu thấp nên đặt gen lacZ hướng với gen biểu Như vậy, phiên mã dịch mã hạn chế biểu gen thay đổi hệ thống biểu kiểm sốt thay đổi hoạt tính β-galactosidase Western blot Phản ứng liên kết kháng ngun-kháng thể có tính đặc hiệu cao Vì vậy, áp dụng phản ứng để phát có mặt tinh protein Kháng thể (antibody) sản xuất đưa kháng nguyên vào thỏ tinh từ máu thỏ sau gây nhiễm Những kháng thể tạo cách kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies-do tế bào lympho khác tiết ra), chúng có khả nhận biết số kháng nguyên Ngược lại, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) tương tác với kháng nguyên định Hình 7.9 Sơ đồ kỹ thuật Western blot Kháng thể đánh dấu bằng enzyme (hoặc chất phát huỳnh quang) để phát protein đặc hiệu (thường thẩm tích lên màng nitrocellulose sau chạy điện di SDS-PAGE, cố định đó) thơng qua kỹ thuật Western blot (hoặc immunoblot) (Hình 7.9) Cơ chế phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể trình bày hình 7.10 Sau protein màng lai gắn với kháng thể thứ đặc hiệu tiếp đến kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme (alkaline phosphatase, horse-radish peroxidase…) phức hợp liên kết với chất để tạo màu Sự diện protein ngoại lai (sản phẩm dịch mã gen ngoại lai chuyển vào tế bào vật chủ) phát nhờ xuất màu phản ứng lai Hình 7.10 Sơ đồ mô tả liên kết protein (kháng nguyên) với kháng thể thứ đặc hiệu kháng thể thứ hai có đánh dấu enzyme Western blot Sự phân bố protein đặc hiệu tế bào tổ chức mơ phát kỹ thuật lai in situ (in situ hybridization) với nguyên tắc tương tự Western blot Ngoài ra, kháng thể sử dụng để tinh protein đặc hiệu kết tủa miễn dịch sắc ký lực (affinity chromatography) Kháng thể đánh dấu dùng để định lượng kháng nguyên kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay) gọi tắt ELISA ELISA ELISA kỹ thuật hóa sinh, dựa phản ứng liên kết kháng nguyên-kháng thể, dùng chủ yếu miễn dịch học để phát có mặt kháng thể kháng nguyên mẫu Tương tự kỹ thuật Western blot, ELISA người thường dùng hai loại kháng thể Một kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên protein (kháng thể thứ nhất) Một kháng thể khác, phản ứng với phức hợp kháng thể-kháng nguyên, kết hợp với enzyme (kháng thể thứ hai) Kháng thể thứ hai nhờ có liên kết với enzyme (như tên kỹ thuật xét nghiệm) nên bắt màu với chất để tạo tín hiệu (Hình 7.11) Hình 7.11 Sơ đồ kỹ thuật ELISA Do ELISA thực để đánh giá có mặt kháng nguyên kháng thể mẫu phương pháp quang phổ (đo độ hấp thụ quang), cơng cụ hữu ích để xác định nồng độ (định lượng) kháng nguyên kháng thể IV Tăng mức độ biểu gen tạo dòng Các mức độ biểu gen ngoại lai E coli thường kiểm tra thử nghiệm chức xét nghiệm miễn dịch khác Tuy nhiên, cố đạt đến mức tối đa biểu sản phẩm gen phân tích phức tạp Để khắc phục khó khăn sản phẩm gen eukaryote không dung hợp biểu người ta sử dụng phương pháp cho DNA ngoại lai dung hợp với đoạn tương ứng gen lacZ cho phép gen ngoại lai chép lại dịch mã cách hiệu Plasmid dùng phương pháp pLG mang gen lacZ mã hóa đầu tận carboxyl có hoạt tính b-galactosidase Tuy nhiên, b-galactosidase chưa tổng hợp thiếu promoter trình tự SD plasmid Do đó, promoter di động (portable promoter) gắn phía trước gen dung hợp điều chỉnh biểu mức độ cao protein dung hợp có hoạt tính b-galactosidase Các plasmid có đoạn promoter đặt tối ưu nhận biết cách biến nạp vi khuẩn Lac- thu hoạt tính b-galactosidase đĩa thị lactose (lactose indicator) Các plasmid sau dùng để tái cấu trúc gen eukaryote khơng hợp mà biểu mức độ cao Mức độ biểu thấp gen tạo dịng RNA khơng ổn định, kết thúc chưa hoàn chỉnh, dịch mã khơng hiệu quả, protein khơng ổn định V Tinh protein Thể vùi phương pháp hòa tan thể vùi 1.1 Thể vùi Protein có mức độ biểu cao E coli thường tạo hạt nhỏ khơng hịa tan tế bào chất (thể vùi), quan sát kính hiển ngược pha tách khỏi dịch tan tế bào sống phương pháp ly tâm Các tế bào biểu mức độ cao protein ngoại lai cô lại ly tâm phá vỡ kỹ thuật học, siêu âm, dùng lysozyme kết hợp với chất tẩy Các thể vùi (inclusion) tạo tiểu thể ly tâm rửa với Triston X-100 EDTA urea Để thu chất hòa tan, protein hoạt động, thể vùi rửa phải hòa tan sau phải tái cuộn xoắn Mỗi protein cần phương pháp hòa tan khác thường xác định theo kinh nghiệm Các điều kiện khác (ví dụ: guanidine HCl [5-8 M], urea [6-8 M], SDS, alkaline pH, acetonitrile/propanol) sử dụng để hòa tan thể vùi Trong nhiều trường hợp, cần pha lỗng đơn giản dịch chiết hịa tan đệm thích hợp đủ Nếu protein chứa cầu nối disulfide, người ta cần phải tiến hành oxy hóa khử glutathione Một đơi cần bổ sung đồng dung môi (co-solvent) PEG, chất tẩy rửa Triton X-100, Tween 20 Zwittergent 3-16 Sau hịa tan thành cơng, thử nghiệm phương pháp tái cuộn xoắn khác bao gồm pha loãng thẩm tách Hiệu suất tạo protein hoạt động protein có liên kết disulfite giống protein gốc phụ thuộc vào nồng độ, độ tinh kích thước chuỗi polypeptide; độ pH cường lực ion dung môi; tỷ lệ tái cuộn xoắn chúng Các nhân tố khác bao gồm số lượng liên kết disulfite chất protein Trong số trường hợp, protein hịa tan khó tái cuộn xoắn người ta thấy việc bổ sung chaperonins giúp ích cho q trình Chaperonins protein cần để đảm bảo cuộn xoắn xác in vivo protein, với khả thuận lợi chaperonin tái tổ hợp chúng dùng để xúc tác cho q trình tái cuộn xoắn xác in vitro protein Nguyên nhân tạo thành thể vùi chưa biết đầy đủ, khơng phải tất protein biểu mức độ cao tạo thành thể vùi Tế bào vật chủ thể vai trị quan trọng Cấu trúc xác protein tái tổ hợp ảnh hưởng tạo thành thể vùi Một nghiên cứu thực với g-interferon người tái tổ hợp cho thấy vài thay đổi amino acid ảnh hưởng đến chuyển hóa biểu protein hịa tan khơng hịa tan E coli 1.2 Phương pháp hòa tan thể vùi 1.2.1 Làm tan tế bào Ly tâm thu tiểu thể tế bào E coli, tái huyền phù tiểu thể phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) lysozyme, đặt nhiệt độ phòng (RT) khoảng 20 phút (thỉnh thoảng khuấy) Sau đó, bổ sung deoxycholic acid, đặt 37oC khuấy dịch tan trở nên sền sệt, bổ sung DNase I để 30 phút RT 1.2.2 Tinh rửa thể vùi - Phương pháp Ly tâm dịch tan thu bước trên, tái huyền phù tiểu thể Triston X-100 EDTA, giữ RT phút Ly tâm 15 phút lấy tiểu thể tái huyền phù nước Trộn dung dịch với đệm 2´ SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định protein quan tâm có tiểu thể khơng - Phương pháp Ly tâm dịch tan, tái huyền phù tiểu thể nước Sau đó, ly tâm lại tái huyền phù tiểu thể Tris.HCl có bổ sung urea Ly tâm tái huyền phù tiểu thể nước Trộn dung dịch với đệm 2´ SDS gel-loading dye phân tích điện di polyacrylamide gel để xác định điều kiện rửa thích hợp cho protein 1.2.3 Hịa tan thể vùi Treo tiểu thể rửa đệm dung ly chứa PMSF urea, để RT Bổ sung dung dịch có KH2PO4, EDTA NaCl để 30 phút RT, trì pH 10,7 KOH Điều chỉnh pH tới 8,0 HCl để 30 RT Ly tâm thu tiểu thể tái huyền phù đệm 1´ SDS gel-loading dye Phân tích điện di để xác định mức độ hịa tan Các đuôi lực Khái niệm đuôi lực xuất thiết kế di truyền với mục đích giúp cho tinh protein enzyme hiệu Gen protein quan tâm dung hợp với chuỗi DNA mã hóa cho số trình tự amino acid đơn giản hóa q trình tinh protein, cách biến đổi tính chất kiểu dự đốn Một trường hợp dung hợp di truyền số gốc arginine với C-terminus urogastrone Gen sản xuất protein liên kết mạnh với khuôn trao đổi ion cho cation Đi polyarginine sau loại bỏ cách dùng enzyme bất động carboxypeptidase A Hình 7.12 Tinh protein đích sắc ký lực Cho hỗn hợp protein tái tổ hợp qua cột sắc ký có chứa phối tử liên kết đặc hiệu với protein mang đuôi lực (ví dụ: His, Histidine GST, glutathioneS-transferase) Các chất bẩn rửa trôi khỏi cột, protein liên kết cột sau rửa giải dạng tinh Đi lực có nhiều ưu điểm tinh protein Trong IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography), His liên kết chọn lọc cao với Ni2+ kim loại chuyển tiếp khác bất động phối tử, protein có gắn lực rửa giải chọn lọc imidazole Protein gắn đuôi GST liên kết với glutathione phối tử, rửa giải với dung dịch glutathione Các protein có dung hợp GST mang hoạt tính enzyme tinh điều kiện tự nhiên Ngược lại, protein gắn đuôi His tinh điều kiện tự nhiên biến tính Hình 7.13 Phân tích SDS-PAGE nhuộm Coomassie Blue sản phẩm protein sau tinh sắc ký lực 1: Chuẩn khối lượng phân tử protein 2: Protein hòa tan tổng số 3: Protein dung hợp (protein đích GST) rửa giải khỏi cột glutathione sepharose 4: Protein dung hợp cắt PresCission Protease cho băng GST protein đích 5: Protein đích tinh sau cho qua IMAC Khó khăn chủ yếu dung hợp lực để tinh protein phải loại bỏ thành công đuôi lực tác nhân sử dụng Vấn đề giải phần biến nạp di truyền điểm đặc hiệu cao cho protease cho cắt bỏ liên kết acid không bền chỗ nối protein tái tổ hợp đuôi lực Nhiều phương pháp phân cắt gợi ý Sử dụng protease đặc hiệu thích hợp cả, ứng dụng điều kiện “nhẹ nhàng”, chủ yếu thrombin, enterokinase Factor Xa Tất protein hoạt động 37oC phân cắt vị trí bên protein quan tâm, tính đặc hiệu từ nhiễm bẩn protease Cuối cùng, bước sắc ký yêu cầu để loại bỏ đuôi lực phân cắt protease Trong phát triển gần lĩnh vực này, người ta sử dụng dạng tái tổ hợp protease 3C từ rhinovirus người Protease có kích thước nhỏ (20 kDa) có tính đặc hiệu hạn chế Nó biểu protein tái tổ hợp dung hợp với glutathione-S-transferase Điều có vài ưu điểm, thân protease tinh sắc ký lực glutathione-Sepharose Nếu protein đích biểu dung hợp với glutathione-S-transferase tinh cột glutathione-Sepharose Sau xử lý với protease, protein đích phân tách khỏi đuôi glutathione-S-transferase protease cách chuyển qua cột glutathione-Sepharose thứ hai Một cách khác, phản ứng phân cắt đặt cột glutathione-Sepharose thứ cách bổ sung protease vào đệm cột, tránh cần thiết cho cột thứ hai Protease có sẵn dạng thương mại tên PreCission Protease Amersham Pharmacia Biotech sản xuất (Hình 7.12 7.13) Tài liệu tham khảo/đọc thêm Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol and 5th ed John Wiley & Sons, Inc USA Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, USA 4 Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook Humana Press Inc New Jersey, USA Rosenberg IM 1996 Protein Analysis and Purification-Benchtop Techniques Birkhäuser, Boston, USA Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany Walker JM 2002 The Protein Protocols Handbook 2nd ed Humana Press Inc Totowa, New Jersey, USA  ... Protein dung hợp Bao gồm gen tạo dòng (gen A) gen khác vi khuẩn (gen B), protein dung hợp có chứa phần protein vi khuẩn SD: đoạn Shine-Dalgarno Sự dung hợp gen thực cách gắn phần mã hóa gen tạo dịng... qua màng Tuy nhiên, tượng xảy vài trường hợp Các hệ thống vector biểu gen dung hợp với gen lacZ Một số hệ thống vector phát triển để biểu gen dung hợp với gen lacZ Chẳng hạn, vector họ pUR có vị... thiết kế để biểu đoạn DNA ngoại lai (cDNA) dung hợp đầu 3’ gen lacZ Phần tận amino gen lacZ thay số trình tự gen cro bacteriophage l gen lacI E coli Promoter PR bacteriophage l (dùng để biểu protein