TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA-VŨNG TÀU KHOA CÔNG NGHỆ KỸ THUẬT – NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH CHẤT MÀU TỰ NHIÊN TỪ HOA ĐẬU BIẾC (CLITORIA TERNATEAN) VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN MỘT SỐ THỰC PHẨM Chủ nhiệm: TS Nguyễn Thị Tuyết Phối hợp: ThS Trần Thị Duyên BÀ RỊA-VŨNG TÀU - NĂM 2020 THÔNG TIN CHUNG CỦA ĐỀ TÀI Tên đề tài : Nghiên cứu quy trình chiết tách chất màu tự nhiên từ hoa đậu biếc (Clitoria ternatean) ứng dụng chế biến số thực phẩm Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Thị Tuyết Danh sách cán tham gia chính: STT Nội dung chính: Nội dung nghiên cứu đề tài bao gồm: Xây dựng quy trình trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc Khảo sát ảnh hưởng pH đến màu độ bền màu anthocyanin Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi đến khả trích ly anthocyanin Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến khả trích ly anthocyanin Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly anthocyanin  Nghiên cứu tính kháng khuẩn ứng dụng chất màu tự nhiên anthocyanin vào số thực phẩm      Kết đạt được: Đề tài tiến hành khảo sát số yếu tố tối ưu q trình trích ly chất màu tự nhiên anthocyanin từ hoa đậu biếc Tiến hành trích ly với tỉ lệ nguyên o liệu dung môi (hoa đậu biếc: etanol) 1:10, nhiệt độ 60 C thời gian 2h Khảo sát ứng dụng bột hoa đậu biếc vào số loại thực phẩm tính kháng khuẩn bột vi khuẩn lactic nấm men:  Bột ứng dụng vào thực phẩm có màu xanh biếc bắt mắt  Bột khơng có tính kháng khuẩn nên sử dụng thực phẩm có chứa vi khuẩn lactic nấm men Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2018 – 7/2020 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký ghi rõ họ tên) ii MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT……………………………………………………….v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG ix LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hoa đậu biếc 1.1.1 Tên khoa học mô tả 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Công dụng 1.1.4 Thành phần hóa học hoa đậu biếc 1.2 Tổng quan chất màu thực phẩm 1.2.1 Tầm quan trọng chất màu chế biến thực phẩm 1.2.2 Vai trò chất màu thực phẩm 1.2.3 Phân loại chất màu thực phẩm 1.3 Giới thiệu chất màu anthocyanin 11 1.3.1 Khái niệm vế chất màu anthocyanin 11 1.3.2 Cấu trúc hóa học Anthocyanin 11 1.3.3 Tính chất vật lý hóa học anthocyanin 14 1.3.4 Khái niệm chất màu pyranoanthocyanin .19 1.3.5 Chức sinh học ứng dụng anthocyanin 20 1.4 Tổng quan phương pháp chiết 22 1.4.1 Các khái niệm trình chiết 22 1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình chiết 23 1.4.3 Các phương pháp chiết 25 1.4.4 Vài kỹ thuật chiết đại dùng để chiết xuất chất màu tự nhiên 25 1.5 Tình hình nghiên cứu, khai thác sử dụng anthocyanin tự nhiên .28 1.5.1 Tình hình giới 28 1.5.2 Tình hình nước 29 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.1 Thời gian địa điểm nghiêm cứu 31 i 2.1.2 Nguyên 2.2 Bố trí thí nghiệm 2.2.1 Quy trìn 2.2.2 Khảo sá màu từ hoa đậu biếc 2.2.3 Khảo sá anthocyanin 2.2.4 Khảo sá biếc 2.2.5 Khảo sá trích ly ………… 2.2.6 Khảo sá anthocyanin từ hoa đậu biếc 2.2.7 Khảo sá anthocyanin từ hoa đậu biếc 2.2.8 Khảo sá anthocyanin 2.2.9 Khảo sá anthocyanin từ hoa đậu biếc 2.2.10 Khảo sá hoa đậu biếc sau sấy phun 2.2.11 Nghiên loại thực phẩm 2.2.12 Khảo sá vi sinh vật dùng chế biến thực phẩm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương 2.3.2 Phương 2.3.3 Phương 2.3.4 Phương 2.3.5 Phương ii 2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin phương pháp vi sai 51 2.3.7 Phương pháp xác định hiệu xuất chiết 52 2.3.8 Phương pháp thống kê xử lý số liệu 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 Ảnh hưởng yếu tố trích ly 53 3.1.1 Ảnh hưởng hệ dung mơi đến khả trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc 53 3.1.2 Ảnh hưởng nồng độ dung mơi đến khả trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc 55 3.1.3 Ảnh hưởng pH đến màu anthocyanin từ hoa đậu biếc .56 3.1.4 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả trích ly 57 3.1.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc 59 3.1.6 Ảnh hưởng thời gian đến khả trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc 60 3.1.7 Ảnh hưởng phương pháp chiết đến khả trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc 62 3.1.8 Ảnh hưởng số lần chiết đến khả trích ly anthocyanin từ hoa đậu biếc 63 3.1.9 Ảnh hưởng hàm lượng maltodextrin đến chất lượng bột màu hoa đậu biếc 64 3.2 Định tính anthocyanin 65 3.3 Nghiên cứu ứng dụng bột màu sấy phun hoa đậu biếc vào số loại thực phẩm 66 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng bột cao boa đậu biếc đến số loại vi sinh vật dùng chế biến thực phẩm 71 3.5 Quy trình hồn thiện cho trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc………………………………………………………………………… 73 3.6 Kết đánh giá chất lượng sản phẩm 74 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 4.1 Kết luận 75 iii 4.2 Kiến nghị 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC 80 Phụ lục Kết xử lý ANOVA cho thí nghiệm 80 Phụ lục Một số thiết bị sử dụng làm đồ án 86 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MHA: Mueller Hinton Agar - Môi trường thạch Mueller Hinton DMSO: Dimethyl sulfoxit, hợp chất hữu lưu huỳnh với công thức (CH3)2SO TSB: Tryptone Soy Broth - Môi trường dinh dưỡng TSB v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây hoa đậu biếc Hình 1.2 Hoa đậu biếc Hình 1.3 Cấu trúc aglucon anthocyanin 12 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử anthocyanidin thường gặp tự nhiên 13 Hình 1.5 Ví dụ cấu trúc anthocyanin phức tạp (delphinidin 3,7,3’,5’-tetra-(6-O-p-coumaroyl-β-glucosid)) 13 Hình 1.6 Sự thay đổi cấu trúc phân tử màu sắc anthocyanin theo pH .15 Hình 1.7 Sự tổ hợp màu liên phân tử delphinidin 3-glucosid rutin tạo thành dạng phức: phức kẹp (A) phức song song (B) 18 Hình 1.8 Sự tổ hợp màu nội phân tử antyhocyanin acyl hóa 19 Hình 1.9 Cấu trúc phân tử số pyranoanthocyanin 20 Hình 1.10 Sơ đồ thiết bị chiết SFE 27 Hình 1.11 Sơ đồ thiết bị chiết ASE 27 Hình 1.12 Một số dạng sản phẩm anthocyanin thương mại 29 Hình 2.1 Quy trình chiết tách màu anthocyanin từ hoa đậu biếc 32 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm chọn dung mơi thích hợp 34 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm chọn nồng độ dung mơi thích hợp .35 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm chọn pH thích hợp 36 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ ngun liệu/dung mơi thích hợp 38 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ chiết thích hợp 39 Hình 2.7 Bố trí thí nghiệm chọn thời gian chiết thích hợp 41 Hình 2.8 Bố trí thí nghiệm chọn phương pháp chiết thích hợp 42 Hình 2.9 Bố trí thí nghiệm chọn số lần chiết thích hợp 43 o Hình 3.1 Mẫu nước chiết nhiệt độ 60 C 53 o Hình 3.2 Mẫu nước chiết nhiệt độ 60 C sau 12h 53 Hình 3.3 Mẫu nước chiết nhiệt độ thường 53 Hình 3.4 Mẫu nước chiết nhiệt độ thường sau 12h 53 o Hình 3.5 Mẫu cồn chiết nhiệt độ 60 C 54 o Hình 3.6 Mẫu cồn chiết nhiệt độ 60 C sau 12h 54 Hình 3.7 Mẫu cồn chiết nhiệt độ thường 54 vi Hình 3.8 Mẫu cồn chiết nhiệt độ thường sau 12h 54 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hiệu suất chiết anthocyanin 55 Hình 3.10 Màu sắc anthocyanin hoa đậu biếc môi trường pH từ 1-14 56 Hình 3.11 Dãy đổi màu anthocyanin pH(ph = 5÷9) 57 Hình 3.12 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến hiệu suất chiết anthocyanin 58 Hình 3.13 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất chiết anthocyanin 59 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất chiết anthocyanin 61 Hình 3.15 Ảnh hưởng phương pháp chiết đến hiệu suất chiết anthocyanin 62 Hình 3.16 Ảnh hưởng số lần chiết đến hiệu suất chiết anthocyanin .63 Hình 3.17 Màu loại bột với khối lượng maltodextrin tương ứng 64 Hình 3.18 Định tính mẫu bột màu 65 Hình 3.19 Định tính dung dịch chiết 65 Hình 3.20 Ứng dụng mẫu bột chứa 20g maltodextrin 66 Hình 3.21 Ứng dụng mẫu bột chứa 25g maltodextrin 66 Hình 3.22 Ứng dụng mẫu bột chứa 30g maltodextrin 67 Hình 3.23 Sản phẩm chứa 2g bột rau câu 67 Hình 3.24 Sản phẩm chứa 4g bột rau câu 67 Hình 3.25 Sản phẩm chứa 6g bột rau câu 68 Hình 3.26 Sản phẩm chứa 40g nếp 68 Hình 3.27 Sản phẩm chứa 50g nếp 68 Hình 3.28 Sản phẩm chứa 60g nếp 69 Hình 3.29 Sản phẩm chứa 40g bột bánh bò 69 Hình 3.30 Sản phẩm chứa 50g bột bánh bị 69 Hình 3.31 Bánh bao sau tạo hình 70 Hình 3.32 Bánh bao chứa 0,8g bột màu 70 Hình 3.33 Bánh bao chứa 1g bột màu 70 Hình 3.34 Bánh bao chứa 1,2g bột màu 70 Hình 3.35 Mơi trường lỏng vi khuẩn Lactic 71 Hình 3.36 Mơi trường hansen nấm men 71 Hình 3.37 Khả kháng nấm men bột màu 72 Hình 3.38 Khả kháng nấm men cao chiết 72 vii Hình 3.39 Khả kháng lactic bột màu 72 Hình 3.40 Khả kháng lactic cao chiết 72 Hình 3.41 Quy trình hồn thiện trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc 73 viii Dựa vào kết từ hình 3.37 ÷ 3.40 ta thấy, nấm men lactic phát triển mạnh, khơng có vịng kháng khuẩn đĩa thạch Do đó, bột màu khơng kháng nấm men vi khuẩn Lactic Nên bột sử dụng sản phẩm chứa hai vi sinh vật 3.5 Quy trình hồn thiện cho trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc Hoa đậu biếc Xử lý Ngâm chiết Thu bã lần Lọc Thu dịch chiết thô cô đặc Bổ sung 5% maltodextrin Sấy phun Bột màu anthocyanin Hình 3.41 Quy trình hồn thiện trích ly chất màu anthocyanin từ hoa đậu biếc 73 3.6 Kết đánh giá chất lượng sản phẩm Sau khảo sát tất thí nghiệm chọn thơng số thích hợp em thực quy trình đề xuất đánh giá chất lượng sản phẩm Hiệu xuất thu sau chiết theo quy trình hồn thiện đạt 10% (tính theo khối lượng cao) Việc tiến hành đánh giá xếp loại chất lượng sản phẩm bột màu phương pháp cảm quan theo TCVN3215-79 Kết trình bày sau: Bảng 3.8 Kết đánh giá chất lượng bột màu anthocyanin từ hoa đậu biếc Chỉ tiêu chất lượng Màu sắc Mùi Vị Trạng thái (độ mịn, tơi, khô) Tổng Dựa vào kết bảng 3.8 ta có, điểm chung 15.04=15 vào điểm trung bình chưa có trọng lượng tiêu (cột – điểm trung bình) tiến hành đối chiếu so sánh với mục 4.8 TCVN 3215 – 79 ta có mẫu bột hoa đậu biếc đạt loại trung bình tiêu cảm quan 74 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Sau q trình khảo sát trích ly để thu nhận bột màu anthocyanin với hàm lượng cao từ hoa đậu biếc (Clitoria ternatean), thu kết sau:  Điều kiện thích hợp cho q trình trích ly là:  Dung môi sử dụng: etanol  Nồng độ dung mơi: etanol 70 o  Phương pháp trích ly: ngâm chiết  Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/10 o  Nhiệt độ trích ly: 60 C  Thời gian trích ly: 2h  Số lần trích ly: lần  Điều kiện thích hợp cho q trình sấy phun là:  Bổ sung 5% maltodextrin o  Nhiệt độ đầu vào: 160 C o  Nhiệt độ đầu ra: 70 C  Tốc độ vòi phun: 350ml/giờ  Gió: 0.40m /phút  Áp suất: 15 - 16 ×10 kPa  Độ ẩm bột màu: - 5%  Anthocyanin ứng dụng để tạo màu xanh biếc cho số thực phẩm như: rau câu, xôi, bánh bao, bánh bị Và sử dụng anthocyanin thực phẩm chứa vi khuẩn Lactic men vi sinh  Anthocyanin hoa đậu biếc không ảnh hưởng đến số loại vi sinh vật dùng chế biến thực phẩm 4.2 Kiến nghị Quá trình nghiên cứu thực quy mơ phịng thí nghiệm với kiến thức thời gian cịn hạn chế Do đó, xin đưa số kiến nghị sau: 75  Nghiên cứu sâu trình chiết tách anthocyanin từ hoa đậu biếc từ tìm phương pháp bảo quản phù hợp  Nghiên cứu tiêu để đưa anthocyanin vào danh mục chất màu thực phẩm theo tiêu Việt Nam  Đánh giá hoạt tính sinh học anthocyanin từ hoa đậu biếc  Định danh số hợp chất khác hoa đậu biếc để đánh giá khả dược liệu hoa  Nghiên cứu phân lập hợp chất anthocyanin phương pháp sắc ký cột để xác định thành phần chất có hợp chất màu anthocyanin  Nghiên cứu độc tính anthocyanin 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt [1] Huỳnh Thị Kim Cúc, Phạm Châu Huỳnh (2013) Xác định hàm lượng anthocyanin số nguyên liệu rau phương pháp pH vi sai, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ, Trường Đại học Đà Nẵng [2] Huỳnh Thị Thanh (2011) Anthocyanin nguyên liệu chứa anthocyanin, Đồ án môn học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM [3] Kiều Thị Nhi, Nguyễn Tuấn Kiệt, Hoàng Thị Ngọc Nhơn (2017) Nghiên cứu quy trình chiết tách anthocyanin hiệu từ hành tím, hành lá, tỏi tía, cần tây, cần ta, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm 12 (1) (2017) 100-107, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM [4] Lê Thị Mùi (2004) Thí nghiệm phân tích định lượng, Trường Đại học Sư [5] Lê Thị Mùi (2009) Kiểm nghiệm phân tích thực phẩm, Trường Đại học Đà [6] Nguyễn Đình Triệu (2001) Bài tập thực hành phương pháp phổ, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội [7] Nguyễn Thị Trang (2011) Nghiên cứu chiết xuất chất màu anthocyanin từ Cẩm, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang [8] Nguyễn Tấn Lực (2014) Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến màu, độ bền màu ứng dụng anthocyanin từ bắp cải tím, Đồ án tốt nghiệp, Trường Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu [9] Nguyễn Thị Tố Nga (2001) Cơ sở lý thuyết ứng dụng trình chiết, NXB Đại học Quốc gia TP.HCM [10] Nguyễn Thị Tuyết Trâm, Nguyễn Thị Chí Linh (2017) Xác định hàm lượng anthocyanin số rau phương pháp pH vi sai, Đồ án tốt nghiệp, Đại học Lạc Hồng Tiếng anh [11] Anna Bakowska-Barczak (2005) Acylated Anthocyanins as Stable, Natural Food Colorants – A Review, Pol J Food Nutr Sci., Vol 14/55, No 2, pp 107-116 [12] Andersen R.A (2005) Algal culturing techniques Elsevier/Academic Press, Burlington, Mass, pp 226 77 [13] Delgado-Vargas, F., A.R Jimenez, and O Paredes-Lopez (2000) Natural pigments: Carotrnoids, anthocyanins, and betalains-characteristics, biosynthesis, processing, and stability, Crit Rev Food Sci Nutr 40:173-289 [14] Francis (1989) Food colourants: Anthocyanins Cr Rev Food Sci Nutri 28:273-314 [15] Fantz PR (1991) Ethnobotany of Clitoria (Leguminosae) Economic Botany (New York Botanical Garden Press) 45: 511–520 [16] Jain N, Ohal CC, Shroff SK, Bhutada RH, Somani RS, Kasture VS and Kasture SB (2003) Clitoria ternatea and the CNS Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 75: 529 [17] Kannan, V (2011), Extraction of Bioactive Compounds from Whole Red Cabbage and Beetroot using Pulsed Electric Fields and Evaluation of their Functionality, Master Thesis, Dept Food Sci and Tech., University of NebraskaLincoln [18] Kamkean N., Wilkinson J M (2009) The antioxidant activity of Clitoria ternatea flower petal extracts and eye gel Wiley online Library, phytotherapy research [19] Manach, C., Wiliamson, G., Morand, C et al (2005) Bioavaibility and bioeffcacy of polyphenols in humans l Review of 97 bioavailability studies Am J Clin Nutr,81,230S-242S [20] Mazza, G and Minitiati, E (1993) Introduction: Anthocyanin in Fruits, Vegetables and Grains CRC Press, Boca Raton, Florida, pp: 1-28 [21] Motohashi S and Nakayama T (2008) Clinical applications of natural killer T cell-based immuno-therapy for cancer Cancer Sci 99:638-645 [22] Nguyen KTG, Zhang S, Nguyen NT, Nguyen P Q, Chiu M S, Hardjojo A andTam JP (2011) Discovery and Characterization of Novel Cyclotides Originated from Chimeric Precursors Consisting of Albumin-1 Chain and Cyclotide Domains in the Fabaceae Family Journal of Biological Chemistry, 286: 24275–24287 [23] Niraj Kumar Singh, Jeetendra Kumar Gupta, Kamal Shah, et al (2017) A review on Clitoria ternatea (Linn.): Chemistry and pharmacology OMICS Group eBooks, 2017 78 [24] Pendbhaje NS, Sudheendra G, Pthan SM and Musmade DS (2011) Ethanopharmacology, pharmacognosy and phytochemical profile of Clitorea ternatea Linn: An overview Pharmacology online, 3: 166-175 [25] Puupponen-Pimiä, R.; Aura, A.M.; Oksmancaldentey, K.M.; Myllärinen, P.; Saarela, M.; Mattila-Sanholm, T.; Poutanen, K (2001) Development of functional ingredients for gut health Trends Food Sci Technol., Amsterdam, v.13, pp.3-11 [26] Shipp, J., Abdel-Aa, E M (2010) Food Applications and Physiological Effects of Anthocyanins as Functional Food Ingredients, The Open Food Science Journal, Vol 4, pp 7-22 [27] Terahara N, Oda M, Matsui T, Osajima Y, Saito N, Toki K, et al Five new anthocyanins ternatins A3, B4, B3, B2 and D2 from Clitoriaternatea flowers J Nat Prod 1996; 59: 139-144 http://dx.doi.org/10.1021/np960050a [28] Trease, GE Evans, WC (1983) Pharmacopoeia textbook, 12th version, Tindall Co., London, pp 343-383 Internet [29] [30] http://en.wikipedia.org/wiki/anthocyanin http://community.h2vn.com/index.php?topic=3633.0 [31]https://caycanhhanoi.vn/cay-canh/cay-hoa-dau-biec-dau-hoa-tim-bong biec?v=e14da64a5617 [32] [33] http://www.micro-ox.com/chem_tan.htm http://luanvan.co/luan-van/nghien-cuu-chiet-tach-mot-so-chat-mau-thuc- pham-tu-kinh-nghiem-su-dung-thuc-vat-cua-dong-bao-dan-toc-thieu-so-576/ [34]https://www.researchgate.net/publication/263714827_Clitoria_ternatea_L_Old_ and_new_aspects [34]https://www.researchgate.net/publication/312498930_Phytochemistry_and_pha rmacological_activities_of_Clitoria_ternatea 79 PHỤ LỤC Kết xử lý ANOVA cho thí nghiệm a) Khảo sát nồng độ dung mơi Kết phân tích anova thu thay đổi nồng độ dung môi: ANOVA Table for Hieu suat chiet by Nong dm Source Between groups Within groups Total (Corr.) So sánh khác biệt hiệu suất chiết nồng độ dung môi: Multiple Range Tests for Hieu suat chiet by Nong dm Method: 95.0 percent LSD Nong dm 80 40 50 60 70 Trung bình hiệu suất độ lệch chuẩn: Summary Statistics for Hieu suat chiet Nong dm 40 50 60 70 80 Total 80 Dựa vào kết tiến hành xử lý ANOVA, nhận thấy P-value