Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD và ISJ để đánh giá và xác định tần số đột biến của quần thể ở ngô được tạo ra từ gây đột biến hạt phấn với hóa chất EMS. Kết quả sử dụng 50 mồi RAPD và 2 mồi ISJ với DNA của giống ngô ML10 (giống nền sử dụng để tạo quần thể đột biến) đã xác định được 10 mồi đa hình từ 3 - 4 băng. Trong 10 mồi sử dụng, có 5 mồi chạy ổn định và lặp lại tốt giữa 186 mẫu DNA được tách từ 186 cá thể M1 từ quần thể đột biến. Tần số đột biến trung bình cho cả 5 mồi là 1/34,3 kb. Nghiên cứu này là bước đầu tiên đánh giá chất lượng quần thể đột biến bằng chỉ thị phân tử.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 XÂY DỰNG BỘ CHỈ THỊ PHÂN TỬ RAPD VÀ ISJ ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐA HÌNH VÀ TẦN SỐ ĐỘT BIẾN Ở NGÔ Trần hị húy1, Đậu hị Ngọc Ngà1, Nguyễn hị Loan1, Bùi Hồng Ngọc1, Trần Hồng Quân1, Trần hị Ngọc Diệp1, Trần Đăng Khánh1, Khuất Hữu Trung1, Vi Lạng Sơn1 TÓM TẮT Nghiên cứu sử dụng thị phân tử RAPD ISJ để đánh giá xác định tần số đột biến quần thể ngô tạo từ gây đột biến hạt phấn với hóa chất EMS Kết sử dụng 50 mồi RAPD mồi ISJ với DNA giống ngô ML10 (giống sử dụng để tạo quần thể đột biến) xác định 10 mồi đa hình từ - băng Trong 10 mồi sử dụng, có mồi chạy ổn định lặp lại tốt 186 mẫu DNA tách từ 186 cá thể M1 từ quần thể đột biến Tần số đột biến trung bình cho mồi 1/34,3 kb Nghiên cứu bước đánh giá chất lượng quần thể đột biến thị phân tử Kết mở đường cho nghiên cứu khác sàng lọc kiểu hình, giải mã hệ genome, để đánh giá sâu quần thể đột biến EMS ngô ML10 làm sở cho nghiên cứu chức gene chọn giống Từ khóa: RAPD, ISJ, tần số đột biến I ĐẶT VẤN ĐỀ Cây ngô trồng có ý nghĩa quan trọng sản xuất nơng nghiệp Vì vậy, có nhiều nghiên cứu giới sử dụng ngô làm mơ hình nghiên cứu ứng dụng Rất nhiều gene ngô làm sáng tỏ chức dựa vào việc tìm nghiên cứu biến dị tự nhiên/nhân tạo Phần lớn đột biến nhân tạo ngô tạo hai cách: dùng EMS xử lí hạt phấn, lai với dịng có transposon có khả “nhảy” (transpose) mạnh (Candela and Hake, 2008) Gerald Neufer tạo nhiều đột biến sử dụng nhà khoa học giới (Neufer, 1994) Để đánh giá chất lượng quần thể đột biến, người ta dựa vào tần số tìm thấy đột biến kiểu hình khác dạng so với dịng gốc Đánh giá dễ dàng trực quan lại phát đột biến điểm không gây kiểu hình Vì người ta kết hợp với phương pháp dùng thị phân tử để kiểm tra ước tính tần số đột biến EMS Mồi ISJ (Intron-exon Spliced Junction) loại mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ nơi tiếp giáp cắt intron exon theo Weining cộng tác viên (1991); Zeng cộng tác viên (2010) Mồi ISJ thường có 15 nucleotit nhiệt độ nóng chảy Tm mồi thường cao (Tm khoảng 46ºC) mồi RAPD (10 bp Tm khoảng 31ºC) Vì vậy, khả lặp lại phản ứng PCR tốt mồi RAPD Cách tính tần số đột biến với mồi ISJ giống với mồi RAPD Mồi RAPD (random ampliied polymorphic DNA) đoạn nucleotide (oligonucleotide) 10bp bám vào DNA khuôn nhân lên sản phẩm PCR Sự xuất thêm băng hay băng kết việc vị trí bám mồi DNA khn bị thay đổi bp Trong trường hợp gây đột biến EMS, phần lớn thay đổi đột biến điểm (thay nucleotide) Chen cộng tác viên (2012) sử dụng RAPD để ước tính tần số đột biến quần thể đột biến lúa mì 2.1 Vật liệu nghiên cứu Viện Di truyền Nông nghiệp 46 Bằng xử lí hạt phấn với EMS dịng ngơ nội chủng ML10, tạo quần thể đột biến Trong nghiên cứu này, chúng tơi chuẩn hóa điều kiện PCR sàng lọc mồi RAPD chạy ổn định dịng ngơ ML10, từ xác định tần số đột biến quần thể đột biến EMS giống ngô ML10 II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Dòng mẹ ML10 giống lai đơn LVN10 lựa chọn để xử lí đột biến Giống ngơ lai đơn LVN10 có nguồn gốc Viện Nghiên cứu Ngô, công nhận giống tiến kỹ thuật tháng năm 1994 Mặc dù tạo cách 25 năm giống LVN10 giống nhiều hộ nơng dân chọn lựa suất cao khả thích ứng với vùng sinh thái nước - Các mồi RAPD ISJ Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Bảng Danh sách mồi RAPD sử dụng nghiên cứu Trình tự mồi (5’ - 3’) STT Tên mồi 10 11 12 13 14 15 16 17 OPO01 OPO02 OPO03 OPO04 OPO05 OPO06 OPO07 OPO08 OPO09 OPO10 OPO11 OPO12 OPO13 OPO14 OPO15 OPO16 OPO17 GGC ACG TAA ACG TAG CGT CTG TTG CTA AAG TCC GCT CCC AGT CAC CCA CGG GAA CAG CAC TGA CCT CCA GTG TCC CAC GCA TCA GAG CGC GAC AGG AGG CAG TGC TGT GTC AGA GTC AGC ATG GCT TGG CGT CCT TCG GCG GTT GGC TTA TGC STT Tên mồi 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 OPO18 OPO19 OPO20 OPN01 OPN02 OPN03 OPN04 OPN05 OPN06 OPN07 OPN08 OPN09 OPN10 OPN11 OPN12 OPN13 OPN14 Bảng Danh sách mồi ISJ sử dụng nghiên cứu (trình tự mồi thiết kế theo Weining cộng tác viên, 1991) STT Tên mồi Trình tự mồi (5’3’) E2 GGAATTCCA CGTCCA R2 TGCTGGTTTGCA GGT 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xử lí đột biến Ngơ trồng hai vụ Hà Nội: vụ Xuân trồng vào tháng 2, vụ Mùa trồng vào tháng Phương pháp gây đột biến thực theo (Neufer (1994) Hạt phấn ngô thu thập vào buổi sáng túi bao cờ (cờ bọc từ chiều hơm trước đó) Khoảng 1220 ml phấn ủ với 70 ml dầu Mineral oil (Sigma) chứa EMS (Sigma) nồng độ 0,05% 30 phút Sau đó, dung dịch hạt phấn dầu nhỏ vào râu ngô Các hạt ngơ thu từ bắp xử lí gọi hạt M1 Trong nghiên cứu sử dụng 186 cá thể M1 ngẫu nhiên từ quần thể đột biến từ dòng ML10 2.2.2 Phương pháp PCR, điện di - Mẫu thu thập tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB (Doyle JJ Dolyl JL, 1990) Trình tự mồi (5’ - 3’) CTC GCT ATC GGT GCA CGT ACA CAC GCT CTC ACG TTG ACC AGG GGC GGT ACT CCC GAC CGA CCC ACT GAA CGC GAG ACG CAC CAG CCC AGA ACC TCA GCT TGC CGG CTT ACA ACT GGG TCG CCG CAA CAC AGA CAC AGC GTC ACT TCG TGC GGG STT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 OPN15 OPN16 OPN17 OPN18 OPN19 OPN20 OPF01 OPAA03 OPAA04 OPAB01 OPAH03 OPAJ01 OPAJ05 OPBA01 OPBB01 OPBB05 CAG CGA CTG AAG CGA CCT CAT TGG GGA GGT GAG GTC GTC CGT ACT GGT GCT CCG ACG GAT CCT G TTA GCG CCC C AGG ACT GCT C CCG TCG GTA G GGT TAC TGC C ACG GGT CAG A CAG CGT TGC C TTC CCC ACC C ACA CTG GCT G AACAGGGCCG - Phản ứng PCR tiến hành máy Veriti 96 well hermal cycler Tổng thể tích phản ứng 15 µl, bao gồm: Taq2X Mastermix (NEB): 7,5 µl; DNA khn: µl; mồi (5 µM): µl, H2O: 1,5 µL Chu trình nhiệt: 95ºC: phút; sau lặp lại 40 chu kì: 95ºC: 30 giây, 31ºC (với mồi RAPD) 46ºC (với mồi ISJ): phút, 68ºC: phút kết thúc 68ºC: 10 phút - Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,0% Gel nhuộm ethidium bromide 0,5 mg/ml soi máy Alpha Imager 1220 (Alpha Innotech, CA, USA) - Cơng thức tính tần số đột biến dựa vào số nucleotide sàng lọc nhờ chạy RAPD, ISJ sau: Với mồi RAPD có chiều dài “n”, có số băng nhân lên dịng wild-type (chưa gây đột biến) “X”, số băng xuất thêm (hoặc bớt) “Y”, chạy kiểm tra “Z” cá thể Tần số đột biến = Y/((nx2) X Z) Đơn vị 1/base pair (1/bp) theo Chen cộng tác viên (2012) 2.3 hời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2018 Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nơng nghiệp 47 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết chuẩn hoá PCR mồi RAPD ISJ ngô 50 mồi RAPD sử dụng với DNA giống ngô ML10 (giống sử dụng để tạo quần thể đột biến) cho kết hình Hình Kết chạy kiểm tra mồi RAPD cho mẫu ngô ML10 Ghi chú: M thang DNA O’Generuler 1kb hermo; (-) đối chứng âm (có mồi OPN16) thay DNA khuôn nước cất; (+) đối chứng dương: mồi OPN16, DNA ML10 Nhằm lựa chọn mồi có nhiều điểm bám để phục vụ kiểm tra nhiều vị trí hệ gene ngơ, chúng tơi chọn mồi có lên từ ba băng trở lên để chạy lại cho kết hình Các mồi RAPD cho từ băng trở lên ổn định qua hai lần lặp lại là: OPO3, OPO6, OPO7, OPO10, OPO11, OPO12, OPN3, OPN4, OPN11, OPN13, OPN16, OPN18, OPF01, OPAA03, OPAA04, OPAB01, OPAH03, OPBA01, OPBB01 (Hình 2) Trong số mồi RAPD chạy ổn định này, mồi có số băng rõ có từ băng trở lên tám mồi: OPN4, OPN11, OPN16, OPN18, OPAA03, OPAB01, OPBA01, OPAH03 Hai mồi ISJ chạy ồn định E2 R2 Chúng ưu tiên sử dụng 10 mồi trước để sàng lọc quần thể đột biến Hình Kết chạy lặp lại mồi RAPD với DNA giống ngô ML10 Ghi chú: M (1) thang DNA O’Generuler 1kb hermo 3.2 Xác định tần số đột biến thị phân tử RAPD ISJ 3.2.1 Tần số đột biến dòng ML10 Trong 10 mồi sử dụng, xác định mồi chạy ổn định lặp lại tốt 186 mẫu cá thể M1 từ 48 quần thể đột biến Các mồi khác phản ứng PCR lên khơng có độ lặp lại ổn định mẫu DNA nên chúng tơi khơng sử dụng kết để tính tần số đột biến Kết tóm tắt bảng hình Chúng tơi sử dụng băng rõ, lặp lại mẫu chạy để tính tần số đột biến Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Ví dụ: mồi R2 có thêm số băng kích thước từ 500 - 700 bp không rõ không lặp lại tất mẫu nên chúng tơi tính có băng rõ đối chứng (Hình 3) Kết bảng cho thấy có mồi (OPN16, E2, R2) chúng tơi phát cá thể có băng đột biến, hai mồi OPN18, OPAH03 không xuất cá thể đột biến Mồi OPN16, E2, R2 xuất vị trí đột biến (1 cá thể/186 cá thể kiểm tra) Tần số đột biến mồi OPN16, E2, R2 1/26,7 kb; 1/27,9 kb; 1/16,7 kb Như vậy, tính chung cho mồi (tổng số đột biến (3)/tổng số nucleotide sàng lọc từ mồi (103 kb): tần số đột biến 1/34,3 kb Lu cộng tác viên (2018) dùng EMS đột biến hạt phấn giống ngơ B73, sau giải mã exon (exon capture) dịng M1, từ tính trung bình 4585 đột biến dịng M1 Với hệ genome ngơ 2,300,000 kb, tần số đột biến quần thể nghiên cứu Lu cộng tác viên (2018) 1/500 kb Tuy nhiên, dựa giải mã đoạn exon genomic nên tần số đột biến Lu cộng tác viên (2018) hệ genome cao Hình Hình ảnh chạy điện di sản phẩm PCR có xuất băng đột biến mồi E2, R2 OPN16 Ghi chú: Mũi tên mẫu có số băng thêm/bớt đột biến Bảng Kết xác định tần số đột biến thị phân tử Tên mồi Trình tự (5’-3’) Số Nu mồi (n) OPN16 OPN18 OPAH03 E2 R2 AAGCGACCT GGTGAGGTC GGTTACTGCC GGAATTCCA CGTCCA TGCTGGTTTGCA GGT 9 10 15 15 Ở loài khác sử dụng phương pháp đột biến khác cho tần số đột biến khác heo nghiên cứu Chen cộng tác viên (2012), sử dụng phân tích đoạn mồi RAPD ISJ phát tần số đột biến lúa mì 1/34 kb, Uauy cộng tác viên (2009) - 1/49,4 kb Parry cộng tác viên (2009) - 1/49 kb Những mật độ đột biến cao lúa mì sử dụng nồng độ EMS Slade cộng tác viên (2005) 1/24 kb Dong cộng tác viên (2009) - 1/30 kb Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tần số đột biến, chẳng hạn nồng độ đột biến, thời gian tiếp xúc, tác động môi trường kiểu gen loài mục tiêu (Song Henry, 1995) Số băng PCR rõ đối chứng (X) 5 Số băng thêm/bớt xuất (Y) 0 1 Số cá thể kiểm tra (Z) Tần số đột biến (F) 186 186 186 186 186 1/26,7 kb 0/16,7 kb 0/14,9 kb 1/27,9 kb 1/16,7 kb IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Tầm soát xây dựng thị bao gồm 50 thị RAPD thị ISJ Chọn mười mồi chạy ổn định băng rõ nét giống ngô nội ML10 OPN4, OPN11, OPN16, OPN18, OPAA03, OPAB01, OPBA01, OPAH03, E2 R2 Kết chạy thị phân tử RAPD (OPN16, OPN18 OPAH03) thị ISJ (E2, R2) 186 cá thể quần thể đột biến cho thấy tần số đột biến trung bình 1/34,3 kb 4.2 Đề nghị Ứng dụng thị RAPD để sàng lọc di truyền cho chọn giống, để kiểm tra đa hình quần thể 49 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(110)/2020 Để bổ sung làm rõ cho kết này, chúng tơi tiến hành giải mã trình tự hệ gene số cá thể đột biến để xác định cụ thể có đột biến cá thể TÀI LIỆU THAM KHẢO Candela H, Hake S., 2008 he art and design of genetic screens: maize Nature reviews Genetics, 9: 192-203 Chen L, Huang L, Min D, Phillips A, Wang S, Madgwick PJ, Parry MA, Hu YG., 2012 Development and Characterization of a New TILLING Population of Common Bread Wheat (Triticum aestivum L.) PLoS ONE, (7): e41570.doi:10.1371/journal.pone 0041570 Dong C, Dalton-Morgan J, Vincent K, Sharp P, 2009 A Modiied TILLING Method for Wheat Breeding Plant Gen., 2: 39-47 Doyle JJ, Doyle JL, 1990 Isolation of plant DNA from fresh tissue Focus, 12: 13-15 Lu, X., Liu, J., Ren, W., Yang, Q., Chai, Z., Chen, R., Wang, L., Zhao, J., Lang, Z., Wang, H., Fan, Y., Zhao, J and Zhang, C., 2018 Gene-Indexed Mutations in Maize. Molecular Plant, 11(3), pp 496-504 Neufer M.G., 1994 Mutagenesis In: Freeling M., Walbot V (eds) he Maize Handbook Springer Lab Manuals Springer, New York, NY, pp 212-219 Parry MA, Madgwick PJ, Bayon C, Tearall K, Hernandez-Lopez A, Baudo M, Rakszegi M, Hamada W, Al-Yassin A, Ouabbou H, Labhilili M, Phillips AL, 2009 Mutation discovery for crop improvement Journal of Experimental Botany, 60: 2817-2825 Slade AJ, Fuerstenberg SI, Loeler D, Steine MN, Facciotti D, 2005 A reverse genetic, nontransgenic approach to wheat crop improvement by TILLING Nat Biotechnol, 23: 75-81 Song W, Henry RJ, 1995 Molecular analysis of the DNA polymorphism of wild barley (Hordeum spontaneum) germplasm using the polymerase chain reaction Genetic Resources and Crop Evolution, 42: 273-281 Uauy C, Paraiso F, Colasuonno P, Tran RK, Tsai H, B Steve, C Luca, D Jorge., 2009 A modiied TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat BMC plant Biology, 9: 115 Weining S and Langridge P., 1991 Identiication and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. heoretical and Applied Genetics, 82 (2): 209-216 Zeng X, Wang Y, Li W, Wang C, Liu X and Ji W., 2010 Comparison of the genetic diversity between Triticum aestivum ssp tibetanum Shao and Tibetan wheat landraces (Triticum aestivum L.) by using intron-splice junction primers. Genetic Resources and Crop Evolution, 57 (8): 1141-1150 Development of RAPD and ISJ markers for analyzing mutation rate in a Vietnamese maize EMS-induced mutant population Tran hi huy, Dau hi Ngoc Nga, Nguyen hi Loan, Bui Hong Ngoc, Tran Hong Quan, Tran hi Ngoc Diep, Tran Dang Khanh, Khuat Huu Trung, Vi Lang Son Abstract EMS-induced pollen mutagenesis have been used to create a mutant population in a Vietnamese inbred ML10 RAPD and ISJ molecular markers were used to evaluate the mutation frequency of Vietnamese maize EMS-induced mutant population Fity RAPD and two ISJ markers were used to screen ML10 for robust markers that ampliied consistently more than bands across tested samples Ten such markers were identiied and were used to screen a subset population of 186 random individuals M1 plants he average mutation frequency was estimated to be 1/34.3 kb hese results are the irst step to show that the mutagenesis was efective allowing other methods such as phenotyping and genome sequencing for further evaluation of EMS population in the ML10 Keywords: RAPD, ISJ, Mutation frequency, maize mutagenesis, EMS Ngày nhận bài: 15/12/2019 Ngày phản biện: 9/01/2020 50 Người phản biện: TS Vũ hị hu Hiền Ngày duyệt đăng: 13/01/2020 ... trước để sàng lọc quần thể đột biến Hình Kết chạy lặp lại mồi RAPD với DNA giống ngô ML10 Ghi chú: M (1) thang DNA O’Generuler 1kb hermo 3.2 Xác định tần số đột biến thị phân tử RAPD ISJ 3.2.1 Tần. .. genome cao Hình Hình ảnh chạy điện di sản phẩm PCR có xuất băng đột biến mồi E2, R2 OPN16 Ghi chú: Mũi tên mẫu có số băng thêm/bớt đột biến Bảng Kết xác định tần số đột biến thị phân tử Tên mồi... thể đột biến Mồi OPN16, E2, R2 xuất vị trí đột biến (1 cá thể/186 cá thể kiểm tra) Tần số đột biến mồi OPN16, E2, R2 1/26,7 kb; 1/27,9 kb; 1/16,7 kb Như vậy, tính chung cho mồi (tổng số đột biến