Đang tải... (xem toàn văn)
phát hiện và định danh vibrio cholerae và vibrio parathamolyticus
• MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH VẬT THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH DANH V.CHOLERAE VÀ V.PARATHEAMOLYTICUS TỔNG QUAN VỀ VIBRIO TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC VIBRIO TRONG THỰC PHẨM NỘI DUNG MỘT SỐ THUẬT NGỮ SO SÁNH QUI TRÌNH TCVN VÀ ISO NGUYÊN TẮC PHÂN TÍCH QUI TRÌNH VÀ GIẢI THÍCH QUY TRÌNH MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ I Tổng quan Vibro Giống Vibrio thuộc vào họ Vibrionaceae Là vi sinh vật gram âm khơng có nha bào , hình que đầu khơng tạo thành hình dấu phẩy,di động, sống kị khí tùy ý ,có phản ứng catalase oxidase lên men glucose không sinh ,không sinh H2S Có loại :V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.culnificus, V.alginolyticus Trừ V.cholera diện nước tất loài Vibrio cần muối để tăng trưởng thường có mặt hải sản, nước biển Phản ứng oxidase(+) tăng trưởng môi trường canh trypton 42oC arginine dehydrolase (-),lysine decarboxylase (+) lên men sucrose (saccharose) V.cholerae Khử nitrate thành nitrite tăng trưởng môi trường chứa 0-3% Nacl Tạo độc tố tả cholerae-toxin có độc tính mạnh Qua đường miệng gây tiêu chảy cho người trưởng thành Tiết độc tố hemolysin có độc tố tương tự tetrodotoxin cá Thời gian ủ bệnh từ đến ngày Vi khuẩn tả chết nhiệt độ 100oC 80oC phút bị tiêu diệt hóa chất cloramin, cresyl, vơi cục Phản ứng oxidase (+) phát triển môi trường canh trypon 24oC Chết 65oC sau 10 phút Phản ứng ADH(-) ,LDC(+) có khả khử nitrate thành nitrite không len men sucrose V parahaemolyticus Thời gian ủ bệnh bệnh ngắn từ Sử đụng số nguồn carbohydrate khác để lên men không sinh Tăng trưởng mơi trường có chứa tới % muối bị ức chế môi trường chứa tới 10% muối V.cholerae V.parahaemolyticus Bệnh biểu triệu chứng nôn tiêu chảy kiểu tả nhẹ tiêu chảy kiểu lỵ trực khuẩn, nôn, phân lỏng II TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC VSV VIBRIO TRONG THỰC PHẨM Tình hình ngộ độc nước • • • Bệnh tả lần xuất Việt Nam năm 1850 với triệu trường hợp bệnh thông báo Cuối năm 2007 dịch bùng phát 19 tỉnh/thành phố phía Bắt hàng ngàn trường hợp mắc khơng có trường tử xong Năm 2008 có 453 ca bệnh tả 2009 có 853 người mắc tả khơng có người chết.2010 có 606 ca bệnh tả, khơng có người chết Năm 2011 có người mắc bệnh tả khơng có người chết Cuối tháng 7/2004 huyện Bình Chánh (TP.HCM) bùng phát ổ dịch tiêu chảy cấp khiến 10 người phải nhập viện điều trị có bệnh nhi tử vong Kết cho thấy mẫu ốc bươu có chứa V.cholerae • Vụ ngộ độc huyện Bn Đơn có 157 người bị ngộ độc, quan chức lấy mẫu thức ăn) gồm gỏi hải sản, gà hấp, xôi cẩm, lẩu cá lăng + bún, trái cây) mẫu bệnh phẩm bệnh nhân để kiểm nghiệm Kết cho thấy, nguyên nhân gây ngộ độc vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus II TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC VSV VIBRIO TRONG THỰC PHẨM Tình hình ngộ độc ngồi nước Dịch xuất từ tuyến đường thương mại (trên đất liền biển) đến Nga năm 1817, sau lan sang phần cịn lại châu Âu, từ châu Âu sang Bắc Mỹ.Có trận đại dịch xảy 200 năm Năm 1832, gần 40.000 người dân Paris chết, nạn nhân có tể tướng Dịch tả công nước Anh vào năm 18481849 làm 70.000 người chết, Đại dịch năm 1854 cướp sinh mạng 1/8 dân số thành phố Ln Đơn • • Dịch tả vào Peru vào năm 1991, lan truyền sang Ecuador, Colombia, México Nicaragua kết 12.000 người chết Sang thời cận đại, riêng Bắc Kỳ thời Pháp thuộc năm 1937 dịch tả giết 75.000 người III NGUYÊN TẮC PHÂN TÍCH Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO 21872-1:2007) dùng để phát V.Cholerae V.parahaemolyticus thực phẩm thức ăn chăn ni Ngun tắc phân tích Phát V Cholerae V.parahaemolyticus thực phẩm thực cách cân lượng mẫu xác định nuôi ủ môi trường lỏng chọn lọc Từ dịch khuẩn cấy chuyển sang môi trường rắn chọn lọc Những khuẩn lạc giống V.Cholerae thử nghiệm phản ứng sinh hóa IV QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VÀ GIẢI THÍCH QUY TRÌNH GIẢI THÍCH QUY TRÌNH Bước 5: Kết Kết báo cáo dạng phát (hay không phát hiện) V cholera V parahaemolyticus 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng Cần lưu ý Vibrio nhóm chứa dịng gây bệnh nên cần tuân thủ triệt để biện pháp an toàn làm việc với chủng Vibrio dùng làm đối chứng (+) thao tác củng phân lập Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần hấp khử trùng cẩn thận trước rửa Dịch tăng sinh Cấy lên môi trường TCBS ủ 370C, 18-24h Trên môi trường TCBS thạch ,khuẩn lạc V.cholerae, trịn dẹp,bóng màu vàng(lên men sacaroza) Thử nghiệm sinh hóa kháng huyết Thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm oxidaza Ðặt giấy lọc lên nắp đĩa petri, nhỏ khoảng - giọt thuốc thử oxidaza /que thử oxidaza Dùng que cấy bạch kim (platin) que cấy nhựa dùng lần; que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí nhỏ thuốc thử oxidaza V cholerae làm vết ria có màu tím thẫm xanh thẫm sau 10 giây Thử nghiệm với canh thang trypton muối Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào ống canh thang muối trypton có dải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 10 % Nuôi ủ nhiệt độ 37,0 ± 1,0 0C 18 - 24 giờ, ủ lại ống âm tính sau 18 - 24 V cholerae phát triển ống canh thang có nồng độ NaCl 0%, 1%, 3% làm đục mơi trường VI MƠI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ: Mơi trường hóa chất Mục đích APW ( Alkaline Phosphat Water) Tăng sinh chọn lọc TCBS (Thiosulphate citrate bile salt sucrose) Phân lập NA/TSA Phục hồi TSI/KIA Đĩa giấy Oxidase Khẳng định sơ Dung dịch NaCl KOH 3% Thử String test để khẳng định sơ Arginine dehydrolase Ornithine decarboxylase Lysine decarboxy Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định TW( Tryptone Water) ONPG Kowa’s Thuốc thử Indol HCL NaOH (KOH) 10% Chỉnh PH VI MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ: Dụng cụ Thiết bị Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng Đĩa petri ɸ100m Nồi hấp Cốc thủy tinh 100ml, 250 ml Tủ hấp Đầu tiếp Pipetman Pipetman Micropipet Máy đập mẫu ( Stomacher) Que trang, que cấy vòng Máy trộn mẫu (vortex mixer) Pipette 1ml, 10ml Cân kỹ thuật Máy nghiền đồng thể mẫu Máy lắc ống nghiệm Bể điều nhiệt IV MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ: ※ Dụng cụ VI MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ, THIẾT BỊ: ※ Thiết bị Chỉ tiêu so sánh Nguyên tắc Lấy mẫu TCVN ISO TCVN 7905-1:2008 Việc phát Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae cần đến bốn giai đoạn liên tiếp (Xem Phụ lục A) Tăng sinh Phân lập Phục hồi môi trường dinh dưỡng NA/TSA Khẳng định hóa sinh kháng huyết TCVN 7905-1:2008 ISO/TS 21872-1:2007 The detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae requires four consecutive stages (See Annex A) Increase fertility Setting Recovery on nutrient medium NA/TSA Confirms biochemistry and antisera ISO/TS 21872-1:2007 Điều quan trọng mẫu gửi đến phòng It is important that the laboratory receive a sample thử nghiệm phải mẫu đại diện that is truly representative of the sample and has not không bị hư hỏng bị thay đổi suốt trình vận chuyển bảo been damaged or changed during security transfer and management quản Cách tiến TCVN 7905-1:2008 hành Tăng sinh Tăng sinh lần đầu môi trường lỏng chọn lọc Cấy phần mẫu thử vào môi trường tăng sinh (nước pepton muối kiềm, ASPW) nhiệt độ môi trường Ủ 370C 6h sản phẩm đông lạnh sâu 41,5 0C h h sản phẩm tươi Tăng sinh lần thứ hai môi trường lỏng chọn lọc Cấy dịch cấy thu vào môi trường tăng sinh (ASPW) Sau ủ 41,50C 18h ISO/TS 21872-1:2007 Tăng sinh First proliferation in selective liquid medium Inoculate the test portion in the enrichment medium (alkaline saline peptone water, ASPW) at ambient temperature.Incubate at 370°C for 6hours for deeply frozen products or at 41.5°C for 6hous for fresh produce Second proliferation in selective liquid medium Inoculate the obtained culture into enrichment medium (ASPW).Then incubated at 41.50C for 18hours Cách tiến TCVN 7905-1:2008 hành Phân lập nhận dạng Cấy dịch cấy thu vào hai môi trường đặc chọn lọc sau đây: - thạch sacaroza, mật, xitrat thiosulfat (TCBS); - mơi trường đặc chọn lọc thích hợp khác (do phịng thử nghiệm chọn), bổ sung cho thạch TCBS, để phát Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerae Ủ môi trường TCBS 370C kiểm tra sau 24h Việc ủ môi trường chọn lọc thứ hai theo dẫn nhà sản xuất Khẳng định Dùng que cấy vòng, cấy dịch cấy thu từ khuẩn lạc giữ lại vào mơi trường ISO/TS 21872-1:2007 • Isolation and identification Inoculate the obtained inoculum into the following two selective solid media: - sucrose agar, bile, citrate and thiosulfate (TCBS);- another suitable selective solid medium (chosen by the laboratory), supplemented with TCBS agar, for detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae.Incubate TCBS medium at 370C and check after 24 hours.Incubate the second selective medium according to the manufacturer's instructions • Positive Using a loop, inoculate each culture obtained from the retained colonies into the specified medium Một số thuật ngữ Selective media Môi trường chọn lọc Isolation Phân lập Sampling Lấy mẫu Cultivation Nuôi cấy Colony Khuẩn lạc Solid medium Môi trường rắn Biochemical Phản ứng sinh hóa Proliferation Tăng sinh Recovery Phục hồi Agar medium Môi trường thạch Kết luận Phương pháp phát định danh Vibrio cholerae (V cholerae) Vibrio parathaemolyticus ( V parathaemolyticus) giúp phát vi khuẩn có khả gây bệnh đường ruột có thực phẩm, từ đưa biện pháp phịng ngừa mầm bệnh TCVN 7905-1:2008 có quy định :Do tính đa dạng thực phẩm thức ăn chăn ni nên phương pháp khơng thích hợp đến chi tiết cho sản phẩm cụ thể Trong trường hợp này, sử dụng phương pháp khác đặc trưng cho sản phẩm, hoàn tồn lý kỹ thuật Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp Tài liệu tham khảo [1] Trần Linh Thước , Phương pháp phân tích vi sinh vật nước thực phẩm mĩ phẩm,NXB Giáo dục [2] Cục Y tế dự phòng (2016), “Bệnh tả”, Tháng 07 năm 2019(http ://vncdc.gov.vn/vi/danh-muc-benh-truyen-nhiem/1081/benh-ta) [3]Nguyễn Thị Thúy Hương – Phân tích vi sinh thực phẩm – 2011 [4]Giáo trình phân tích vi sinh - ĐHCNTP TPHCM [5]TCVN 7905-1:2008 Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi ... MỘT SỐ THUẬT NGỮ SO SÁNH QUI TRÌNH TCVN VÀ ISO NGUYÊN TẮC PHÂN TÍCH QUI TRÌNH VÀ GIẢI THÍCH QUY TRÌNH MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ I Tổng quan Vibro Giống Vibrio... khí tùy ý ,có phản ứng catalase oxidase lên men glucose không sinh ,không sinh H2S Có loại :V.cholerae, V.parahaemolyticus, V.culnificus, V.alginolyticus Trừ V.cholera diện nước tất loài... canh trypton 42oC arginine dehydrolase (-),lysine decarboxylase (+) lên men sucrose (saccharose) V.cholerae Khử nitrate thành nitrite tăng trưởng môi trường chứa 0-3% Nacl Tạo độc tố tả cholerae-toxin