81 Chương DI TRUYỀN PHÂN TỬ VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN ỨNG DỤNG TRONG NHÂN GIỐNG ĐỘNG VẬT Đến năm 1940, di truyền học cổ điển gọi “di truyền học hình thức” vào kết lai hay quan sát tế bào học mà suy đốn gen Gen có chất nào? Nó thực chức sinh hóa sao? Đó vấn đề bỏ ngõ Năm 1941, G Beadle E Tatum nghiên cứu đột biến sinh hóa nấm mốc Neurospora crassa nêu lên giả thuyết gen - men tính trạng, cho thấy, gen xác định tính trạng thơng qua việc điều khiển tổng hợp enzym, chất xúc tác phản ứng sinh hóa Tiếp theo, đối tượng vi sinh vật bắt đầu sử dụng rộng rãi tạo buớc phát triển nghiên cứu di truyền Vào năm 40, J Lederberg, với công trình dã góp phần đưa vi khuẩn trở thành đối tượng sử dụng nhiều sinh học phân tử, vi khuẩn E coli Nhiều nhà vật lý, hóa học chuyển sang nghiên cứu di truyền học ứng dụng phương pháp nghiên cứu sinh học Việc xác định DNA vật chất di truyền mở cho nghiên cứu phân tử cấu tạo chức gen Năm 1944, Oswald Avery, Colin Mc Leod Maclyn McCarty nghiên cứu Streptococcus pneumonie, vi khuẩn gây viêm phổi, dựa vào quan sát trước Fred Griffiths phát tượng biến nạp chứng minh DNA nhân tố gây biến nạp, làm thay đổi kiểu di truyền phế cầu khuẩn D pneumonie Alfred Hershey Martha Chase (1952) củng cố thêm kết luận thực nghiệm thực khuẩn thể (bacteriophage), virus có khả xâm nhiễm vi khuẩn E coli Sự phát cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA James D Watson Francis H.C Crick (1953) thức khởi đầu cho thời kỳ nghiên cứu di truyền phân tử Cấu trúc đơn giản trình tự bổ sung phân tử DNA 82 sở cho chế tự chép phân tử DNA hệ tế bào chế tổng hợp RNA từ khuôn DNA Học thuyết trung tâm sinh học phân tử đời DNA Sao chép mRNA protein phiên mã dịch mã Vào cuối năm 70, xuất loạt kỹ thuật tạo cách mạng sinh học phân tử Với enzym cắt hạn chế, người ta cắt phân tử DNA vị trí xác định thành đoạn có kích thước mong muốn, gắn chúng vào vector, chuyển vào tế bào vi khuẩn Việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn cho phép thu hồi lại lượng lớn DNA cần Đó phương pháp tạo dịng Sau đó, người ta hồn thiện phương pháp xác định nhanh trình tự DNA Như nhà sinh học không ngồi đếm nhiễm sắc thể hay thiết lập đồ gen dựa vào đột biến lai, họ nắm đến nucleotit đoạn DNA Hơn nữa, họ cịn tùy ý tạo đột biến đoạn DNA chuyển chúng trở vào tế bào để nghiên cứu chức gen loại tế bào xác định, xác định trình tự tồn gen người, giải vấn đề bệnh ung thư, phát triển phơi, biệt hóa mơ DNA vai trị di truyền Vào năm 1868, Miescher, nhà sinh hóa học người Thụy Điển, phát nhân tế bào bạch cấu chất protein ông gọi nuclein (chất nhân) Về sau thấy chất có tính axit nên gọi nucleic axit Có hai loại desoxyribonucleic axit (viết tắt DNA) ribonucleic axit (viết tắt RNA) Chất mà Miesher tìm DNA Năm 1914, nhà bác học Đức R Fulgen tìm phương pháp nhuộm màu DNA Năm 1944, vai trò mang thông tin di truyền DNA chứng minh đến năm 1952 công nhận 1.1 Chứng minh gián tiếp Nhiều số liệu cho thấy có liên quan chặt chẽ DNA vật chất di truyền Thứ nhất, DNA có tế bào tất sinh vật, giới hạn nhân thành phần chủ yếu nhiễm sắc thể (một cấu trúc tế bào, có chứa nhiều gen) 83 Thứ hai, Tất tế bào sinh dưỡng loại sinh vật chứa lượng DNA ổn định, không phụ thuộc vào phân hóa chức hay trạng thái trao đổi chất Thứ ba, số lượng DNA tăng theo bội số nhiễm sắc thể tế bào Ở tế bào sinh dục, đơn bội (n) có số lượng DNA tế bào sinh dưỡng, lưỡng bội (2n) có số lượng DNA tăng lên gấp đôi Thứ tư, tia tử ngoại (uv) có hiệu gây đột biến cao bước sóng 260 nm, bước sóng mà DNA hấp thụ tia tử ngoại nhiều 1.2 Bằng chứng trực tiếp chứng minh axit nucleic vật liệu di truyền 1.2.1 Hiện tượng biến nạp Thí nghiệm Griffiths, 1928 phế cầu khuẩn Diplococcus pneumonie gây bệnh viêm phổi cho động vật có vú Hình 36 Thí nghiệm biến nạp chuột a/ Tiêm vi khuẩn S sống gây bệnh cho chuột b/ Tiêm vi khuẩn R sống không gây bệnh c/ Tiêm vi khuẩn S nung nóng cho chuột chuột chết chuột sống chuột sống d/ Hỗn hợp vi khuẩn S bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống đem tiêm cho chuột chuột chết Trong xác chuột có vi khuẩn S R D pneumonie có nịi: nịi S có vỏ bọc phân tử DNA, nuôi cấy cho khuẩn lạc trơn, bóng, có khả gây bệnh 84 Nịi R: khơng có vỏ bọc, có phân tử DNA, nuôi cấy cho khuẩn lạc không trơn, bóng, khơng có khả gây bệnh Tiêm nịi S cho chuột, chuột chết Tiêm nòi R cho chuột, chuột sống Nung nóng nịi S tiêm cho chuột, chuột sống Trộn lẫn nòi S nung nóng với nịi R, tiêm cho chuột, chuột chết Ở có yếu tố từ nịi S bị giết chết chuyển sang nịi R (khơng gây bệnh) làm thay đổi đặc điểm nòi R Khi chuyển sang nòi R, làm cho nòi R từ chổ không gây bệnh trở nên gây bệnh Năm 1944, T Avery, Mc Leod McCarty tách chiết DNA nịi S đem cho vào tế bào ni cấy chủng R Kết số khuẩn lạc biến thành dạng trơn, bóng: chúng biến nạp Đặc biệt phân hủy DNA DNAse tượng biến nạp không xẩy Các tác giả chứng minh DNA nhân tố biến nạp làm thay đổi kiểu di truyền phế cầu khuẩn Ngày thực biến nạp sinh vật Eucaryotae nấm men, tế bào thực vật, tế bào chuột tế bào người, chí thực biến nạp lồi khác Do đó, biến nạp coi phương tiện chung để chuyển gen sinh vật 1.2.2 Sự xâm nhập DNA virus vào vi khuẩn Năm 1952, A Hershey M Chase tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 (thực khuẩn thể) cho xâm nhập vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Phage T2 có cấu tạo đơn giản gồm vỏ protein phân tử DNA bên Khi cho phage T2 vào vi khuẩn, chúng gắn lên bề mặt bên ngoài, phần chất xâm nhập vào vi khuẩn sau 20 phút làm tan tế bào vi khuẩn, phong thích nhiều phage Thí nghiệm A Hershey M Chase nhằm xác định, chất phage vào bên tế bào vi khuẩn: DNA, protein hay hai chất Vì DNA chứa nhiều photpho (P) khơng có lưu huỳnh (S) cịn protein chứa nhiều lưu huỳnh khơng có photpho, nên phân biệt DNA protein nhờ đồng vị phóng xạ P S Phage ni vi khuẩn nhiễm đồng vị phóng xạ P32 S Các phage nhiễm khoảng thời gian đủ để bám vào vách tế bào bơm chất vào tế bào Sau đem phân tích nhận thấy, 35 85 phần ngồi vi khuẩn có chứa nhiều S , P , chứng tỏ phần lớn protein vỏ phage nằm tế bào vi khuẩn Phân tích phần bên tế bào vi khuẩn thấy chúng chứa nhiều P32 S35 35 32 Hình 37 Vật chất di truyền phage DNA Điều chứng tỏ DNA phage đựơc bơm vào tế bào vi khuẩn, thơng tin di truyền chứa DNA dùng để tổng hợp virus Thành phần hóa học cấu trúc phân tử DNA 2.1 Thành phần hóa học Phân tử DNA chất trùng hợp (polymer), polynucleotit Nó tạo nên nối liền đơn phân (monomer) Mỗi monomer gồm thành phần: - Đường pentose (5 carbon) - desoxyribose - Base nitơ gồm nhóm purine: Adenine (A) Guanine (G) pyrimidine : Thymine (T) Cytosine (C) - Nhóm phosphate 86 Đường pentose gắn với base nitơ vị trí C1 tạo nên nucleoside Nucleoside gắn thêm nhóm phosphate vào C5 đường pentose thành nucleotid Hình 38 Cấu tạo base nitơ 2.2 Mơ hình xoắn kép DNA J Watson F Crick Năm 1953, J Watson F Crick đưa mơ hình cấu trúc phân tử DNA Theo mơ hình này, phân tử DNA chuỗi xoắn kép mà hai mạch gồm khung đường pentose xen kẽ với nhóm phosphate, gắn với nhờ cầu nối hydro (liên kết hydro) theo nguyên tắc bổ 87 sung Có nghĩa adenine mạch liên kết với thymine mạch kia, guanine mạch liên kết với cytosine mạch ngược lại Giữa adenine với thymine liên kết với cầu nối hydro, guanine với cytosine liên kết với cầu nối hydro Hình 39 Chuỗi xoắn kép DNA Watson - Crick 88 Hình 40 Sơ đồ cấu trúc mạch phân tử DNA theo Watson-Crick Điều thực nghiệm Chargaff xác định Khi thủy phân DNA nhận thấy, tổng số loại base purine tổng số loại pyrimidine Đặc điểm gọi định luật Chargaff Theo định 89 luật A = T; G = C, tức A T A T G C G C 1; A G T C , tỷ số , loài sinh vật khác nhau, tỷ số đặc trưng cho lồi, dựa vào phân biệt loài với Sinh vật bậc cao, tỷ số A T G C  , sinh vật bậc thấp, tỷ số A T G C  Từ năm 1953 trở lại nay, mơ hình phân tử DNA J Watson F Crick trung tâm nghiên cứu di truyền học sinh học phân tử, Watson Crick nhận giải thưởng Nobel vào năm 1962 Mỗi vòng xoắn phân tử DNA gồm có 10 cặp nucleotid, chiều dài 34 Ao; đường kính phân tử DNA 20Ao Sự xếp mạch theo kiểu đối song song, đầu 5’P (nhóm P tự gắn với C5 đường) đối diện với 3’OH (nhóm OH gắn với C3 đường) ngược lại 5’P 3’OH 3’OH 5’P Sao chép DNA Watson Crick cho rằng, hai mạch phân tử DNA tách liên kết hydro cặp base bị đứt, mạch làm khuôn cho việc tổng hợp mạch mới, tương tự với mạch cặp trước Kết phân tử DNA ban đầu (mẹ) qua trình chép cho hai phân tử DNA (con) giống hệt Mỗi phân tử mang mạch cũ mạch Kiểu chép gọi chép bán bảo tồn Những nghiên cứu tìm chế phân tử q trình chép DNA Đó q trình phức tạp, phải trải qua chế chung sau: - Các liên kết hydro gắn hai mạch với phải bị phá vỡ hai mạch phải tách ra, từ mạch kép trở thành hai mạch đơn - Phải có đoạn mồi, tức đoạn DNA RNA ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu mạch khn 90 - Có đủ loại nucleosid triphosphate (ATP, TTP, GTP, CTP) bắt cặp với mạch đơn khuôn - Mạch tổng hợp theo hướng 5’P - 3’OH, nucleotid nối lại với liên kết phosphodieste Mỗi bước điều khiển enzym đặc hiệu thực cách nhanh chóng, xác 3.1 Các enzym, protein tham gia vào trình tái DNA - DNA polymerase I loại enzym phát đầu tiên, lúc đầu người ta cho loại enzym có vai trị chủ yếu tái DNA Về sau người ta phát enzym DNA polymerase II DNA polymerase III - DNA polymerase II có chức xác định bắt đầu tổng hợp phân đoạn DNA kết thúc tổng hợp DNA - DNA polymerase III enzym tham gia chủ yếu vào tái DNA kéo dài dần chuỗi tổng hợp Loại enzym có khoảng 10 phân tử tế bào, chúng có tốc độ tổng hợp DNA nhanh nhiều lần so với DNA polymerase I DNA polymerase II -Trên phân tử DNA dạng vòng vi khuẩn E coli có khoảng 400.000 vịng xoắn, nên tháo xoắn phải xẩy theo chế tối ưu để tháo xoắn khơng làm rối loạn cấu trúc Sự tháo xoắn tạo đứt điểm định mạch đơn trình tái bản, chổ đứt nhanh chóng sửa chữa sau tháo xoắn Enzyn tham gia vào sửa chữa DNA gyrase (hay topoisomerase) - Ngồi cịn có enzym khác như: Enzym “rep” mở xoắn chuỗi xoắn kép, RNA primerase tổng hợp đoạn mồi RNA ngắn để tạo nhóm 3’OH, enzym DNA ligase nối đoạn DNA ngắn (đoạn Okazaki) thành phân tử DNA dài Bên cạnh đó, q trình tổng hợp DNA cịn thấy có vai trò protein DNA-B nhận đánh dấu điểm khởi đầu tái bản, protein SSB bám vào hai mạch đơn ổn định để thực trình tái DNA 3.2 Các giai đoạn chép 3.2.1 Khởi Ở E coli, trình chép bắt đầu protein đặc hiệu (B) nhận biết điểm bắt đầu chép gắn vào trình tự base Tiếp theo 136 9.3.3 Các vector chuyển gen phage Phage (thực khuẩn thể) virus xâm nhiễm làm phân giải vi khuẩn Các phage, virus vi khuẩn dùng làm vector chuyển gen nhiều phage có khả thực tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào vi khuẩn nhận Vector phage sử dụng rộng rãi để lập ngân hàng gen, mang đoạn DNA lớn hơn, dễ bảo quản, dễ tách để phân tích Ưu điểm bật phage chúng có hệ thống tự động xâm nhập sinh sản tế bào vi khuẩn với hiệu cao nhiều so với việc đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn biến nạp Tuy nhiên thao tác ban đầu có phức tạp 9.4 Tạo plasmid tái tổ hợp (tạo dòng) Bước kỹ thuật di truyền gắn đoạn DNA hay c-DNA vào vector chuyển gen để tạo nên plasmid có mang DNA lạ gọi plasmid tái tổ hợp hay khảm 9.4.1 Các bước tạo dòng - Chọn xử lý vector: Việc chọn xử lý vector phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kích thước đoạn DNA muốn tạo dịng, mục đích tạo dịng Trước hết, vector cắt vị trí xác định enzyme giới hạn Sau đầu chổ nối cắt xử lý để chúng khơng thể nối trở lại; vecto trở lại dạng vòng ban đầu hai đầu chổ mối cắt nối với trình tự DNA lạ - Xử DNA cần tạo dòng (insert): Trước hết cần chọn lọc sơ khởi DNA có kích thước gần tương ứng với loại vector chọn Sau dó hai đầu đoạn DNA cần xử lý cho phù hợp với hai đầu chổ mối cắt vector (bằng cách cắt enzyme giới hạn để tạo đầu so le tương hợp) - Tạo vecto tái tổ hợp: Vecto DNA cần tạo dòng xử lý trộn chung theo tỷ lệ định với tham gia ligase Ligase xúc tác phản ứng nối vector với insert tạo thành vector tái tổ hợp (recombinant) Vector tái tổ hợp sau tinh qua tách chiết tủa - Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Nhằm mục đích sử dụng máy tế bào chủ để chép vector tái tổ hợp thành số lượng lớn Tùy thuộc loại tế bào chủ, người ta sử dụng kỹ thuật chuyển thích hợp 137 - Phát dịng cần tìm thư viện gen: Sự phát dịng cần tìm, người ta sử dụng mẫu dị, mẫu dị kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa gen cần tìm trình tự DNA bổ sung cho gen cần tìm Do chất DNA cần tạo dòng (được gọi insert) người ta phân biệt hai loại thư viện gen: thư viện gen (genomic library) thư viện c-DNA (cDNA library) 9.4.2 Thư viện gen (genomic library) Thư viện gen sinh vật tập hợp tất trình tự DNA cấu thành gen gắn vào vector Về nguyên tắc, thư viện gen thiết lập từ loại tế bào sinh vật nghiên cứu Để thiết lập thư viện gen, trước hết người ta tách chiết DNA gen sinh vật đó, cắt DNA thành đoạn có kích thước xác định enzyme giới hạn; gắn đoạn vào vector tạo vector tái tổ hợp Các vector tái tổ hợp sau đưa vào tế bào chủ Các tế bào chủ ni cấy mơi trường đặc hình thành nên dòng (clone) Ứng dụng thư viện gen cần: - Giải mã thông tin di truyền chứa gen, đặc biệt cấu trúc intron-exon gen xác định - Tạo dòng trình tự DNA khơng mã hóa nằm cạnh gen đòng vai trò định điều hòa biểu gen 9.4.3 Thư viên cDNA Thư viện cDNA tập hợp cDNA từ tất mRNA tế bào Như vậy, không giống với thư viện gen, thư viện cDN thiết lập từ loại tế bào xác định gen nghiên cứu phải biểu thành mRNA Thư viện cDNA mang tính đặc trưng tế bào cao loại tế bào thể biệt hóa có số gen phiên mã thành mRNA Việc thiết lập thư viện cDNA có số điểm đặc trưng: Trước hết mRN tế bào tách chiết chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) Thư viện cDNA thiết lập chủ yếu nhằm mục đích nghiên cứu biểu gen xác định với vấn đề liên quan điều hòa biểu gen, mối tương tác gen trình sống 138 Thư viện cDNA hình thành theo bước sau: - Việc chọn vector tương đối dễ dàng kích thước cDNA lớn kb Ngày người ta thường sử dụng plasmid hệ thứ ba Plasmid cắt enzyme giới hạn hai đầu mối cắt loại phosphate để tránh tượng tự nối trở lại - Bên cạnh đó, mRNA tách chiết từ tế bào chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược Vector tái tổ hợp hình thành kết hợp plasmid cDNA - Sau đó, vector tái tổ hợp đưa vào tế bào vi khuẩn phương pháp biến nạp (transformation) Sau tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp, người ta lại nuôi chúng môi trường lỏng thời gian ngắn trước đem trải chúng mơi trường đặc Các dịng vi khuẩn hình thành nên khuẩn lạc mặt thạch 9.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào Sau DNA tái tổ hợp, việc biến nạp, đưa vào lại tế bào Có thể đưa vào nhiều cách 9.5.1 Hóa biến nạp DNA tái tổ hợp (plasmid mang đoạn gen lạ) ủ với số lượng lớn tế bào vi khuẩn chưa có plasmid Đối với vi khuẩn xử lý CaCL2 lạnh, kèm sốc nhiệt độ (42oC phút) DNA tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào nhiều Đối với tế bào động vật có vú, để thực biến nạp dùng phương pháp hấp thụ DNA qua trung gian phosphate calcium Phương pháp cho hiệu thấp 9.5.2 Điện biến nạp Sử dụng dòng điện cao cục theo xung làm tế bào hấp thụ DNA nên gọi điện biến nạp Lúc đầu phương pháp sử dụng động vật có vú, sau cho tế bào thực vật Hiệu biến nạp cao, gấp 10-20 lần so với xử lý hóa chất, đoạn DNA biến nạp có kích thước lớn Tuy nhiên tỷ lệ tế bào chết đáng kể (50-70%) Khó khăn khác phải chế dụng cụ chuyên biệt tạo dòng điện có điện cao cho khối lượng xử lý nhỏ 9.5.3 Vi tiêm 139 Đối với tế bào động vật có vú (thường hợp tử) tiêm thẳng DNA tái tổ hợp vào tế bào Đây phương pháp thơng dụng có hiệu chuyển gen tế bào động vật có vú, tạo động vật nhiễm gen 9.5.4 Bắn DNA vào tế bào Đối với tế bào thực vật, muốn thực biến nạp phải tạo tế bào trần (mất vách tế bào) DNA ngấm vào Việc tạo tế bào trần không đơn giản, tốn công sức thường sức sống tế bào giảm, khó phân chia để tự tái sinh Để khỏi phải làm công việc trên, phương pháp bắn DNA tái tổ hợp trực tiếp vào tế bào thực vật sử dụng Các hạt kim loại (đường kính khoảng micromet) mang DNA RNA bắn với tốc độ nhanh xuyên thủng vách tế bào đưa vào Phương pháp có nhiều ưu dùng nhiều thực vật nhiễm gen Ngồi cịn nhiều phương pháp khác đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào: - Sử dụng màng lipid bao DNA để đưa vào tế bào - Dùng tinh trùng mang DNA tái tổ hợp xâm nhập vào tế bào trứng - Các vector virus tự động thực tải nạp đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào với hiệu suất cao nhiều nên sử dụng rộng rãi tế bào người, động vật thực vật 9.6 Phương pháp PCR Vào năm 1985, K Mullis phát phương pháp đơn giản khuyếch đại nhanh nhiều đoạn DNA mà không cần sử dụng tế bào Kỹ thuật gọi polymerase chain reaction (PCR), hiểu phản ứng polymer dây chuyền Sự khuyếch đại PCR thực invitro ống nghiệm plastic nhỏ, khác hẵn với tạo dòng đoạn DNA invitro gắn vào plasmid tế bào vi khuẩn hay nấm men Kỹ thuật ứng dụng nhanh có ý nghĩa cách mạng phát triển sinh học phân tử kỹ thuật di truyền Thực chất phương pháp tạo dịng invitro khơng cần có diện tế bào 9.6.1 Nguyên tắc thực PCR trình khuyếch đại trình tự DNA đặc hiệu invitro xúc tác enzyme DNA polymerase Sự khuyếch đại nói chung thực nhờ chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 140 lần) gồm: đun nóng (95 C) vịng 30 giây đến phút Đây giai đoạn biến tính; Làm nguội (37 - 65oC), vòng 30 giây đến phút, cho phép mồi bắt cặp với khuôn, giai đoạn lai; Ủ lâu 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp Thời gian tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài 30 giây đến nhiều phút, giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation) Trong dung dịch có primer (đoạn mồi) P1 P2, loại bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn tương ứng Như vậy, mạch kép DNA, sau phản ứng DNA polymerase thực thành mạch DNA kép thực chu trình khuyếch đại thành 4, thành theo cấp số nhân o 3’ 3’ 5’ 5’ Lặp 5’ 3’ A 5’ 3’ lại n lần B 3’ 5’ C 5’ 3’ Hình 54 Sơ đồ nguyên tắc phương pháp PCR Một chu kỳ gồm bước: A Biến tính (denaturation): tách rời hai mạch phân tử DNA B Lai (hybridization): cặp mồi chuyên biệt cho trình tự DNA xác định cho bắt cặp với khuôn C Kéo dài (elongation): DNApolymerase tổng hợp mạch kể từ mồi bắt cặp Chu kỳ lặp lại n lần Phản ứng thực ống plastic nhỏ, có mẫu DNA, primer DNA polymerase, gắn vào hệ thống nung nóng điều chỉnh thành chu kỳ nung nóng, làm nguội theo chương trình định sẵn, gọi thermocycler (máy PCR) 9.6.2 Các ứng dụng phương pháp PCR - Sản xuất mẫu dò 141 Trước để sản xuất mẫu dị, cơng cụ thiếu phương pháp lai, người ta phải tiến hành qua nhiều giai đoạn-tạo dịng, ni cấy để tạo nhiều sao, đánh dấu mẫu dò Với phương pháp PCR, người ta sản xuất nhanh lượng mẫu dò đánh dấu thực phản ứng với cặp mồi chuyên biệt nucleotid đánh dấu - Khuyếch đại số lượng RNA Do Taq polymerase không hoạt động RNA nên người ta sử dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR (Reverse transcriptase-PCR) Trước hết RNA chuyển thành c-DNA nhờ enzyme phiên mã ngược Sau cDNA khuyếch đại nhờ Taq polymerase Người ta sử dụng Taq polymerase cho hai giai đoạn - Định lượng phương pháp PCR Thường sử dụng để nghiên cứu trình tự (DNA hay RNA) có số lượng thấp, khơng thể định lượng phương pháp lai phân tử cổ điển Về nguyên tắc người ta xác định số lượng mẫu ban đầu qua tính tốn dựa vào sản phẩm cuối cùng, số chu Nhưng thực tế, người ta định lượng tương đối trình tự đích, tức so sánh hàm lượng nhiều nguồn khác 9.6.3 Các hạn chế phương pháp PCR - Kích thước trình tự cần khuyếch đại Trừ vài trường hợp cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động với đoạn DNA lớn 3kb Việc sử dụng PCR độ dài 1,5 kb cho kết tốt - Sự ngoại nhiễm Vấn đề đặc biệt cấp thiết ứng dụng chẩn đốn, dự phịng hậu nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn sản phẩm khuyếch đại lần trước Người ta chứng minh việc mở nắp ống nghiệm sau lần khuyếch đại khoảng không gian kín phịng thí nghiệm sẽ.khiến cho phân tử khuyếch đại thoát khỏi ống nghiêm bay lơ lửng khơng khí, bám vào tường, cửa, thiết bị dụng cụ nhiễm vào phản ứng tiến hành sau - Các sai sót gây Taq polymerase 142 Sự chép Taq polymerase cho tỷ lệ sai cao (10 ), có nghĩa 1000 nucleotid enzyme gắn sai nucleotid Đặc tính khơng nghiêm trọng ta cần xem xét kích thước hay có mặt sản phẩm khuyếch đại, có ý nghĩa lớn cần xác định xác trình tự nucleotid DNA -4 10 Kỹ thuật gene chăn nuôi Các phương pháp chọn giống lai tạo cổ điển góp phần hình thành nên giống vật ni, trồng đa dạng có hiệu kinh tế cao Kỹ thuật gen phát triển tảng hiểu biết sinh học vật nuôi trồng, bao gồm hai hướng chính: - Phân tích di truyền vật nuôi trồng nhờ DNA marker (các trình tự đánh dấu gen liên kết với tính trạng cần quan tâm) - Tạo sinh vật chuyển gen Các DNA marker sử dụng vào việc hình thành đồ gen với vị trí gen mã hóa cho tính trạng mong muốn vật nuôi trồng nhằm phục vụ cho chiến lược lai tạo chọn giống lai tạo theo phương pháp cổ điển Việc tạo sinh vật chuyển gen cho phép đưa vào vật nuôi, trồng tính trạng q mà khơng phải qua q trình chọn lọc lâu dài; phương pháp khơng giúp cải thiện đặc tính sẵn có mà cịn bổ sung dặc tính hồn tồn sinh vật Việc hình thành thư viện gen biện pháp bảo tồn có hiệu nguồn gen tự nhiện giới 10.1 Sử dụng DNA marker phân tích di truyền Trong phương pháp chọn giống cổ điển, tiêu chọn lọc thuộc kiểu hình, dựa vào tiêu hình thái, sinh hóa tiêu thường khơng ổn định, chịu ảnh hưởng mạnh yếu tố môi trường Sử dụng thành phần kiểu gen, DNA marker, để chọn giống cho phép bỏ qua biến động không di truyền đồng thời theo dõi biến động di truyền kiểu hình (vì nằm đoạn khơng mã hóa gen) Phương pháp có nhiều ưu điểm, cho phép sử dụng nguồn gen mà khơng làm ảnh hưởng đến điều hòa biểu tự nhiên gen Các DNA marker đặc biệt có ích tính trạng mong muốn: có tính di truyền thấp, khó định lượng (tính kháng bệnh ), biểu theo giới tính, biểu muộn q trình 143 sống (năng suất trứng, sữa ), Các DNA marker sử dụng vào nhiều mục đích: - Dùng để đánh giá mức độ biến động di truyền quần thể vât nuôi Nếu mức biến động di truyền cịn cao cần phải tiếp tục chọn lọc để ổn định dòng - Cho phép đánh giá khác biệt di truyền hai cá thể bố mẹ, Sự khác biệt lớn tính dị hợp tử hệ cao - Theo dõi hiệu chương trình chọn giống định hướng alen đặc biệt - Xác định marker locus có liên kết chặt chẽ với tính trạng mong muốn, dùng chọn giống số lượng, đặc biệt tính trạng khó chọn lọc Các DNA marker sử dụng lai tạo chọn giống nhiều gia súc gia cầm thường có liên quan đến tính trạng suất, chất lượng thịt, sức sống cao, thích nghi Ví dụ, người ta xác định locus RN qui định chất lượng thịt lợn nằm nhiễm sắc thể 15, cách marker S0088 18cM (Milan cộng sự, 1985); cịn tính trạng kháng bệnh marek gà có liên quan đến marker nhóm máu thuộc MHC (Major Histocompatibility Complex- phức hợp tương hợp mới) Gần người ta phát sử dụng marker VNTR để phân biệt hai lồi hàu có giá trị kinh tế Ostrea edulis Dicentrarchus labax đồng thời để xác định gen kháng kí sinh trùng O edulis 10.2 Tạo động vật chuyển gen Về nguyên tắc việc chuyển gen qui định tính trạng mong muốn vào động vật ni khơng có khác so với liệu pháp gen người Tuy nhiên, người việc tác động lên tế bào sinh dục khơng phép thực ngược lại vật ni lại mục đích cần đạt nhằm tạo dòng động vật chuyển gen (transgenic animal) Các động vật chuyển gen, ban đầu truyền cho hệ cháu đặc tính đặc tính biến đổi Các phương pháp dùng chuyển gen vào tế bào động vật đa dạng thay đổi theo đối tượng tế bào Đối với tế bào sinh dưỡng, người ta dùng phương pháp chuyển gen phức hợp DNA-calcium phosphate hay nhờ vector virus Đối với tế bào sinh dục, sử dụng phương pháp vi tiêm tối ưu Ví dụ, động vật có vú, người ta vi tiêm DNA vào trứng thụ tinh cấy trở lại vào mẹ mang 144 Hình 55 Hai phương pháp tạo động vật chuyển gen Bên trái: Phương pháp vi tiêm Bên phải: Dùng tái tổ hợp tương đồng Vấn đề lớn phương pháp chuyển gen không kiểm sốt vị trí gắn xen gen đưa vào Động vật chuyển gen sử dụng vào nhiều mục đích - Dùng làm mơ hình thí nghiệm cho việc nghiên cứu bệnh người Người ta tạo dòng chuột chuyển gen mang nhiều rối 145 loạn di truyền kiểu với rối loạn di truyền người Việc nghiên cứu mơ hình chuột chuyển gen cho phép hiểu rõ chế sinh hóa rối loạn di truyền tương ứng Hơn việc thử nghiệm liệu pháp người thiết phải thông qua bước thử nghiệm mơ hình động vật - Dùng để sản xuất protein với số lượng lớn Người ta ghép gen mong muốn với promotor gen mã hóa cho protein sữa (casein) chuyển vào cừu Sản phẩm gen protein sản xuất với số lượng lớn tiết từ sữa cừu Đây mơ hình thử nghiệm - Tạo chủng mang đặc tính quí Ví dụ, để tăng sản xuất len cừu, người ta chuyển gen tổng hợp cysteine vi khuẩn vào cừu, cysteine cần cho hình thành keratin len - Việc chuyển gen góp phần đáng kể vào việc chọn giống động vật vì: + Giúp đưa nhiều tính trạng vào động vật mà trước chưa có + Đưa tính trạng có sẵn vào động vật nhanh phương pháp chọn giống thơng thường (lai chọn lọc) Một đóng góp quan trọng chuyển gen động vật tạo động vật mang gen bệnh người làm mơ hình nghiên cứu 10.2.1 Các phương pháp chuyển gen - Vi tiêm phương pháp thông dụng DNA bơm thẳng vào hợp tử giai đoạn sớm - Sử dụng vector virus như: SV40, BPV (bovine paoillomavirus, retrovirus) - Phương pháp dùng tế bào cuống phôi (stem embryonic cells hay stem cell insertion) Trong phơi có tế bào có khả phân chia mạnh, người ta lấy tế bào ra, thực biến nạp rối cấy trở lại vào phôi - Phương pháp dùng tinh trùng vector mang gen Nếu bơm DNA vào tinh trùng đưa DNA vào tế bào trứng dễ dàng thụ tinh 10.2.2 Các tính trạng chuyển gen 146 - Các tính trạng suất Người ta chuyển gen để tăng cường tính trạng suất như: khả chuyển đổi thức ăn cao, tăng chất lượng thịt, sữa, lông giảm mỡ Nhưng tính trạng kinh tế có di truyền đa gen, nên việc chuyển gen khó Người ta hy vọng tương lai xác định trình tự nucleotide gen động vật, cải thiện tính trạng - Gen hormone tăng trưởng Nhiều gen mã hóa cho hormone tăng trưởng chuyển vào vật nuôi với hy vọng giúp tăng trọng nhanh Hiệu thấy rõ chuột: chuột mang gen hormone tăng trưởng người lớn gấp đôi chuột bình thường Ở lợn, người ta tạo dịng mang gen mã hóa hormone tăng trưởng bị Lợn có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn, mỡ hơn, lại mang nhiều bệnh - Kích thích tăng trưởng Ở gà có gen cSKI kích thích tạo tăng mạnh bình thường, giảm mỡ Người ta đưa gen vào lợn tạo nên giống có nhiều thịt mỡ Những lợn có chân yếu trơn yếu nên cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện - Tăng suất tạo lông (ở cừu) Trong thành phần lơng có nhiều axit amin, chủ yếu cystein chứa lưu huỳnh (S) tạo nhiều cầu disulfite nên protein lơng có độ cao Nếu cho vào thức ăn nhiều cystein suất lơng cừu khơng cao, thức ăn vào thể qua đường ruột bị vi sinh vật tiêu thụ nên lông không hấp thụ Khi tiêm cystein vào da sản lượng lơng tăng lên nhiều (vì không bị vi sinh vật tiêu thụ) - Sản xuất protein trị liệu quan để ghép Từ năm 1990, nhiều nơi giới thành công việc chuyển gen người vào cừu, dê, bò Đã thu chế phẩm như: t-pA (tissue plasmonogen activator), -1- antitrypsin Hiệu việc chuyển gen thấp, thường khoảng 1/1000 hợp tử bơm DNA 10.2.3 Thay gen mục tiêu (gen targeting) 147 Một thành tựu đáng kể chuyển gen động vật sử dụng tái tổ hợp tương đồng để thay gen mục tiêu tế bào Kỹ thuật cho phép thay gen alen vị trí mong muốn nhiễm sắc thể tế bào thực phôi chuột vào giai đoạn túi phôi (blastocyst) 10.2.4 Tạo giống từ phôi Phương pháp tạo giống đại gia súc chuyển gen như: bị, dê, cừu từ phơi cho nhiều kết sử dụng rộng rãi Có hai cách đưa gen lạ vào hợp tử: vi tiêm dùng tái tổ hợp tương đồng - Vi tiêm Tế bào trứng bò thụ tinh in vitro Ở giai đoạn nhân non (pronucleus), thực vi tiêm đưa DNA gen lạ vào Phôi tạo cấy vào ống dẫn trứng bò mẹ mang thai - Phương pháp dùng tái tổ hợp tương đồng Các tế bào nuôi đưa DNA mang gen dùng thay đổi mục tiêu vào dịch nuôi tế bào Sau đó, tiến hành chọn lọc tế bào thay cho dung hợp với tế bào trứng bị loại nhân Tế bào dung hợp cấy vào bị mẹ 10.2.5 Siêu nỗn cấy truyền phơi Siêu nỗn cấy truyền phơi hai cơng nghệ gắn liền vào trình nhằm gây rụng trứng đồng loạt vật cho phôi (donor), tạo thành nhiều hợp tử thu nhiều phôi chất lượng cao, sau đưa phơi tạo vào cá thể khác, vật nhận phôi (recipient), mà phơi sống, phát triển bình thường sở trạng thái sinh lỹ, sinh dục vật nhận phôi phù hợp với trạng thái tương ứng vật cho phơi (đồng pha) Q trình kỹ thuật siêu nỗn cấy truyền phơi bao gồm cơng đoạn chủ yếu sau đây: - Chọn vật cho phôi Kỹ thụật nhằm khai thác triệt để tiềm di truyền cao sản Do vậy, việc chọn vật cho phôi (những vật xuất sắc) vô quan trọng Công việc ảnh hưởng tới suất chất lượng phôi thu 148 Các vật cho phôi chọn từ đàn hạt nhân, có nhiều đặc điểm tốt, biết rõ nguồn gốc - Chọn vật nhận phôi Thường không cần vào phẩm giống, suất vật khơng có vai trị kiểu gen đời sau nên chúng vật “ mang thai hộ” Tuy nhiên chúng có ảnh hưởng lớn đến vệc tiếp nhận phôi nuôi con, chọn vật nhận phôi phải đảm bảo tiêu chuẩn: không mang bệnh tật, sinh trưởng, phát triển bình thường, sinh lý sinh sản bình thường - Tạo chu kỳ động dục cho vật cho vật nhận phôi Vật cho nhận phôi trước đưa vào sử dụng gây siêu noãn gây động dục đồng pha phải biết ngày biểu động dục trước để ấn định ngày gây siêu nỗn vật cho gây động dục đồng pha vật nhận phôi - Thu hoạch phôi Vật cho phôi siêu nỗn, phối giống sau thời gian định giội rửa ống dẫn trứng để lấy phôi khỏi thể gọi thu hoạch phơi Có thể dùng phương pháp phẩu thuật không qua phẩu thuật Phôi coi tốt kích thước đảm bảo, có dạng cầu đều, nguyên vẹn, tế bào xếp đều, liên kết chặt chẽ, có độ sáng phần Phơi sau đánh giá, phân loại đem cấy truyền cho vật nhận phôi đồng pha (cấy phôi tươi) hay đem đông lạnh để sau sử dụng (cấy phôi đơng lạnh) Khi có phơi vật nhận phơi tiến hành cấy truyền phơi, tức đem phơi bên vào thể vật nhận Nguyên tắc phơi lấy vị trí cấy trả vào vị trí nhờ súng cấy phôi Vật nhận phôi sau cấy thời gian, tùy thuộc loài khám để đánh giá kết Đối với bò, thời gian tháng - Lợi ích siêu nỗn cấy truyền phôi công tác giống gia súc 149 + Cho phép phổ biến nhân nhanh giống có suất cao, có đặc tính q sản xuất sở khai thác triệt để tiềm di truyền cao sản thơng qua siêu nỗn, lấy phơi, bảo quản phôi cấy truyền + Cho phép nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh hiệu công tác giống sở tăng nhanh tiến di truyền + Nâng cao khả sinh sản sản phẩm thịt, sữa Siêu noãn cấy truyền phôi làm tăng số sinh từ cao sản, làm thay đổi nhanh chóng chất lượng đàn giống, khắc phục số trường hợp sinh sản khơng bình thường gia súc cao sản + Hạn chế đến mức tối thiểu số lượng gia súc làm giống, từ giảm chi phí khác kèm như: chuồng trại, vật tư, nhân lực + Giúp dễ dàng, thuận lợi việc xuất nhập khẩu, vận chuyển, trao đổi giống nước, vùng + Đây phương pháp giữ gìn, bảo tồn vật liệu di truyền (phương pháp ex situ) + Siêu nỗn cấy truyền phơi hạn chế số dịch bệnh nâng cao khả chống chịu bệnh, khả thích nghi vật mơi trường phần lớn bệnh gia súc không lây qua phơi + Siêu nỗn cấy truyền phơi tạo sở để thúc đẩy nghiên cứu phát triển số ngành khoa học có liên quan như: phơi sinh học, q trình tiếp nhận, đào thải phơi cho sinh lý, hóa sinh, miễn dịch, lai ghép phơi, chuyển gen cho sinh học phân tử, chế tạo vacxin chống bệnh, thay gen xấu cho y học 150 Câu hỏi ôn tập chương Hãy nêu sở chứng minh gián tiếp chúng minh trực tiếp vai trị DNA di truyền? Hãy trình bày thành phần hoá học cấu trúc phân tử DNA? Sao chép DNA? Hãy trình bày thành phần hố học cấu trúc phân tử RNA? Các loại RNA chức chúng? Hãy trình bày trình phiên mã (tổng hợp RNA)? Thế mật mã di truyền? Đặc trưng mật mã di truyền? Hãy trình bày trình sinh tổng hợp protein? Tại phải có chế điều hồ biểu gen? Thành phần operon theo Jacob Monod? Hãy trình bày hoạt động điều hoà operon latoza? Thế đột biến gen? Nguyên nhân đột biến gen? Phân loại đột biến gen? 10 Các hình thức biểu đột biến gen dạng kiểu hình đột biến gen? 11 Thế kháng nguyên? Tính chất kháng nguyên? Thế kháng thể? 12 Cơ sở di truyền sinh tổng hợp kháng thể? 13 Hãy cho biết số trường hợp sức đề kháng bệnh vật nuôi? 14 Thế kỹ thuật di truyền? Enzym hạn chế? Các phương pháp thu nhận gen? 15 Thế vectơ chuyển gen? Các loại vectơ chuyển gen? 16 Các bước tạo dòng? Phương pháp tạo dòng chuyển gen? 17 Các phương pháp biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào? 18 Phương pháp PCR? Ứng dụng PCR hạn chế phương pháp? 19 Phương pháp chuyển gen động vật? Các tính trạng chuyển gen động vật? ... Kỹ thuật di truyền Kỹ thuật tái tổ hợp DNA thường gọi kỹ thuật di truyền, bao gồm tập hợp gồm nhiều kỹ thuật, vai trò hàng đầu thuộc tư phương pháp di truyền vi sinh vật, sinh học phân tử, hóa... điểm mã di truyền - Mã di truyền mã ba, nghĩa nucleotide mã hóa cho axit amin - Mã di truyền khơng gối lên Thông tin phân tử mRNA đọc theo chiều 5’P - 3’OH kể từ codon khởi đầu - Mã di truyền. .. đa tiềm di truyền, tức có đủ tất thơng tin di truyền để tổng hợp loại kháng thể, kháng nguyên có tác dụng tác nhân kích thích cảm ứng gen tổng hợp kháng thể hoạt động - Quan điểm di truyền học