Đang tải... (xem toàn văn)
Kỹ thuật ELISA là một trong kỹ thuật được áp dụng để xác định nồng độ kháng thể kháng vi rút sởi, tuy nhiên cần phải lựa chọn sinh phẩm với các thông số kỹ thuật phù hợp. Đề tài được thực hiện nhằm lựa chọn bộ sinh phẩm thương mại phù hợp để định lượng kháng thể IgG kháng vi rút sởi trong huyết thanh và xác nhận một số giá trị sử dụng của phương pháp sử dụng bộ sinh phẩm đã lựa chọn. Bộ sinh phẩm được lựa chọn dựa vào các tiêu chí như độ nhạy, đặc hiệu, tái lập, khả năng áp dụng và giá thành. Các thông số kỹ thuật được xác nhận dựa theo xác nhận phương pháp theo tiêu chuẩn ISO 15189 phiên bản 2012 với dàn mẫu gồm 50 mẫu huyết thanh đã được xác định nồng độ kháng thể với các dải nồng độ kháng thể thấp, trung bình, cao và âm tính do Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương (VSDTTW) cung cấp. Bộ sinh phẩm định lượng IgG kháng sởi của Siemens đã được lựa chọn với các thông số kỹ thuật được xác nhận bao gồm độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, độ lặp 4,9 % 9,3 %; độ tái lặp 6,3 % 10,6 %; giới hạn phát hiện là 145 mIUml và độ tuyến tính R2 94,7%. Toàn bộ thông số đạt các tiêu chí của một kỹ thuật xét nghiệm định lượng và nằm trong dải thông số nhà sản xuất đưa ra.
THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ELISA ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ IgG KHÁNG VI RÚT SỞI ÁP DỤNG TẠI TRUNG TÂM Y TẾ DỰ PHÒNG HÀ NỘI Nguyễn Thị Kiều Anh1*, Đỗ Phương Loan2 Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội TÓM TẮT Kỹ thuật ELISA kỹ thuật áp dụng để xác định nồng độ kháng thể kháng vi rút sởi, nhiên cần phải lựa chọn sinh phẩm với thông số kỹ thuật phù hợp Đề tài thực nhằm lựa chọn sinh phẩm thương mại phù hợp để định lượng kháng thể IgG kháng vi rút sởi huyết xác nhận số giá trị sử dụng phương pháp sử dụng sinh phẩm lựa chọn Bộ sinh phẩm lựa chọn dựa vào tiêu chí độ nhạy, đặc hiệu, tái lập, khả áp dụng giá thành Các thông số kỹ thuật xác nhận dựa theo xác nhận phương pháp theo tiêu chuẩn ISO 15189 phiên 2012 với dàn mẫu gồm 50 mẫu huyết xác định nồng độ kháng thể với dải nồng độ kháng thể thấp, trung bình, cao âm tính Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương (VSDTTW) cung cấp Bộ sinh phẩm định lượng IgG kháng sởi Siemens lựa chọn với thông số kỹ thuật xác nhận bao gồm độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, độ lặp 4,9 % - 9,3 %; độ tái lặp 6,3 % - 10,6 %; giới hạn phát 145 mIU/ml độ tuyến tính R2 94,7% Tồn thơng số đạt tiêu chí kỹ thuật xét nghiệm định lượng nằm dải thông số nhà sản xuất đưa Từ khóa: ELISA, sởi, IgG kháng sởi I ĐẶT VẤN ĐỀ Sởi bệnh truyền nhiễm cấp tính vi rút sởi gây ra, dễ lây lan thành dịch gây biến chứng nặng nề dẫn đến tử vong đặc biệt với trẻ bị suy dinh dưỡng [1] Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trước có vắc xin, khoảng 90% trẻ nhỏ bị nhiễm sởi trước đạt đến tuổi 15 [2] Hà Nội địa phương triển khai chương trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) sớm với thành tựu bật, chương trình bao phủ 100% xã, phường, thị trấn với tỷ lệ đối tượng tiêm chủng đầy đủ năm sau cao năm trước Từ năm 1992 đến tỷ lệ bao phủ nhóm trẻ tuổi liên tục đạt 99 %, nhờ tiêm vắc xin, tỷ lệ mắc bệnh truyền nhiễm giảm từ hàng chục đến hàng trăm lần [3, 4] Tuy nhiên, với nước, năm 2014 dịch bệnh sởi xảy nhiều địa phương có Hà Nội, dịch sởi xảy quy mô với 5.970 trường hợp mắc, 14 trường hợp tử vong Ca bệnh phân bố *Tác giả: Nguyễn Thị Kiều Anh Địa chỉ: Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội Điện thoại: 024 37757416 Email: nkanhhp@yahoo.com rải rác diện rộng tất 100% quận huyện, 93% số xã phường khơng có ổ dịch tập trung lớn Đa số ca mắc tuổi (57%) số mắc trẻ chưa đến tuổi tiêm chủng (0,05 Độ lặp kỹ thuật thực TTYTDPHN thực mẫu dương tính mạnh dương tính yếu, mẫu làm lặp lại lần lần thực xét nghiệm Kết cho thấy độ lặp có hệ số biến thiên CV (Coefficient of variation) 4,9% 9,3% nhỏ CV độ lặp nhà sản xuất công bố (5,8 – 11,4 %) (Bảng 2) Tạp chí Y học dự phịng, Tập 27, số - 2017 105 Bảng Kết đánh giá độ lặp lại Loại mẫu/lần thử Dương tính mạnh (OD) Dương tính yếu (OD) Lần 0,9 0,34 Lần 0,92 0,34 Lần 0,86 0,4 Lần 0,87 0,35 Lần Mean + SD CV 0,92 0,3 0,9 + 0,04 0,3 + 0,03 4,9% 9,3 % Độ tái lặp kỹ thuật thực dựa hai mẫu dương tính mạnh dương tính yếu thực lần thời điểm khác Mỗi lần thực xét nghiệm, mẫu thực lặp lại lần Tổng số giá trị thực 15 giá trị cho mẫu Kết cho thấy CV độ tái lặp đạt 6,28 - 10,6% nhỏ CV độ tái lặp nhà sản xuất công bố (6,4 – 21,6 %) (Bảng 3) Bảng Kết đánh giá độ tái lặp Loại mẫu/Thử nghiệm Dương tính mạnh (OD) Dương tính yếu (OD) Thử nghiệm 0,896 0,3 Thử nghiệm 1,004 0,35 Thử nghiệm 0,87 0,39 0,92 + 0,05 0,34 + 0,03 6,28 % 10,6 % Mean + SD CV Giới hạn phát (LOD) xác định dựa dàn mẫu kiểm tra gồm 30 mẫu dương tính có giá trị OD từ 0.2 đến 0.3 xác nhận lại kết Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Tiến hành pha loãng bậc mẫu 106 xác định nồng độ pha lỗng mà cịn phát 50% mẫu dương tính Kết cho thấy giới hạn phát kháng thể IgG kháng vi rút sởi nồng độ pha loãng 1/4 tương ứng với giá trị 145 mIU/ml (Bảng 4) Tạp chí Y học dự phịng, Tập 27, số - 2017 Bảng Kết xác định giới hạn phát Antigen Co - antigen Delta A Delta A*corection factor Định tính Delta OD ^ Beta Định lượng (mIU/ml) 0,062 0,014 0,048 0,06 Âm tính 0,53 73 0,093 0,035 0,058 0,08 Âm tính 0,55 87 0,11 0,004 0,106 0,14 Nghi ngờ 0,62 160 0,076 0,026 0,05 0,07 Âm tính 0,53 76 0,057 0,005 0,052 0,07 Âm tính 0,54 79 0,065 0,034 0,031 0,04 Âm tính 0,48 50 0,084 0,006 0,078 0,10 Nghi ngờ 0,59 116 0,082 0,036 0,046 0,06 Âm tính 0,52 71 0,07 0,003 0,067 0,09 Âm tính 0,57 100 0,109 0,028 0,081 0,11 Nghi ngờ 0,59 121 0,045 0,004 0,041 0,05 Âm tính 0,51 64 0,066 0,018 0,048 0,07 Âm tính 0,53 73 0,128 0,016 0,112 0,15 Nghi ngờ 0,63 169 0,138 0,014 0,124 0,17 Nghi ngờ 0,65 189 0,13 0,01 0,12 0,16 Nghi ngờ 0,64 182 0,097 0,009 0,088 0,12 Nghi ngờ 0,60 131 0,077 0,008 0,069 0,09 Âm tính 0,57 103 0,055 0,009 0,046 0,06 Âm tính 0,52 71 0,107 0,009 0,098 0,13 Nghi ngờ 0,61 147 0,07 0,011 0,059 0,08 Âm tính 0,55 89 0,082 0,009 0,073 0,10 Nghi ngờ 0,58 109 0,049 0,013 0,036 0,05 Âm tính 0,50 57 0,063 0,009 0,054 0,08 Âm tính 0,54 82 0,058 0,022 0,036 0,05 Âm tính 0,50 57 0,056 0,003 0,053 0,08 Âm tính 0,54 80 0,1 0,016 0,084 0,12 Nghi ngờ 0,59 125 0,098 0,013 0,085 0,13 Nghi ngờ 0,60 127 Độ tuyến tính tính toán mẫu kiểm tra gồm cặp mẫu dương tính cặp mẫu nồng độ cặp có giá trị dải từ thấp đến cao, mẫu lặp lại 05 lần Kết cho mối tương quan OD mIU/ml biểu thị công thức: y = 2,5877x – 347,29 y nồng độ kháng thể IgG tính mIU/ ml x giá trị mật độ quang học OD với R2 97,4% Độ tuyến tính khơng đề cập thông số kỹ thuật nhà sản xuất, nhiên theo tiêu chuẩn R2 độ tuyến tính đạt 90% chấp nhận (Hình 1) Tạp chí Y học dự phòng, Tập 27, số - 2017 107 Hình Đồ thị tương quan tuyến tính kết OD nồng độ kháng thể IgG Độ khơng đảm bảo tính dựa trung bình độ không đảm đo tất trang thiết bị trực tiếp tham gia vào xét nghiệm hiệu chuẩn; SD độ lặp, tái lặp, chứng chuẩn phần xác nhận giá trị trung bình độ khơng đảm bảo đo thiết bị Kết cho thấy độ không đảm bảo đo kỹ thuật 0,07 (Bảng 5) Bảng Các thông số đánh giá độ không đảm bảo đo kỹ thuật ELISA Thông số đánh giá độ không đảm bảo đo Độ lệch chuẩn (SD) Độ lặp lại 0,04 Độ tái lặp 0,05 Chứng dương 0,0048 Trung bình thiết bị 0,03 IV BÀN LUẬN 4.1 Lựa chọn sinh phẩm thương mại phù hợp để định lượng kháng thể IgG kháng vi rút sởi huyết Để đánh giá tình trạng miễn dịch vi rút sởi có nhiều kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử, ELISA So với phương pháp trung hịa, kỹ thuật ELISA có ưu điểm thời gian thực ngắn (khoảng tiếng); số lượng mẫu thực lần lớn; kỹ thuật thực đơn giản, khơng địi hỏi tay nghề cao Do đó, kỹ thuật ELISA kỹ thuật ưu tiên áp dụng giám sát huyết học cộng đồng Bộ sinh phẩm định lượng kháng thể IgG kháng vi rút sởi huyết Siemens lựa 108 chọn đảm bảo đảm nguyên tắc: sinh phẩm có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, sử dụng thuận tiện điều kiện phòng xét nghiệm Trong nghiên cứu này, sinh phẩm lựa chọn sinh phẩm IgG Measles Siemens phát định lượng kháng thể IgG kháng sởi có độ nhạy theo cơng bố nhà sản xuất 99,6% độ đặc hiệu 100% Đây hai thông số quan trọng lựa chọn sinh phẩm để thực xét nghiệm hai thông số cao tiến hành đánh giá so sánh với sinh phẩm lưu hành Việt Nam IBL, Virotech Genway Theo báo cáo tổng kết nghiên cứu giám sát huyết học giới từ năm 1998 đến năm 2004, tổng số 52 nghiên cứu sử dụng kỹ thuật ELISA để định lượng kháng thể IgG, có tới 21 (31%) nghiên cứu sử dụng sinh phẩm Siemens Enzygnost Tạp chí Y học dự phịng, Tập 27, số - 2017 để thực nghiên cứu [7] Tuy nhiên, ngưỡng xác định mức độ bảo vệ kháng thể nghiên cứu khác nhau, giao động từ 63 mIU/ml 636 mIU/ml (đơn vị ELISA) tùy sinh phẩm Đối với sinh phẩm Siemens Enzygnost, số nghiên cứu sử dụng ngưỡng đủ kháng thể bảo vệ 636 mIU/ ml [8] Tuy nhiên, phương pháp chuẩn thức trung hòa giảm đám hoại tử xác định nồng độ kháng thể trung hòa quy định mức độ bảo vệ 120 mIU/ml [8-10] Khi thực xét nghiệm với dàn mẫu phịng thí nghiệm chuẩn thức Viện VSDTTW cung cấp, kết định tính trùng khớp 100 % Hơn nữa, kết xét nghiệm 10 mẫu dải nồng độ kháng thể khác cho thấy kết định lượng có khác biệt hai đơn vị khơng có ý nghĩa thống kê Một nhược điểm sinh phẩm giá thành cao số sinh phẩm so sánh (14.000.000 đồng/ 96 phản ứng) Tuy nhiên, với ưu điểm chất lượng sinh phẩm độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát độ ổn định sinh phẩm nên định sử dụng sinh phẩm hãng Siemens Bộ sinh phẩm IgG Measles Siemens định lượng kháng thể kháng sởi chọn để thực Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội đáp ứng thông số kỹ thuật phù hợp với thông số nhà sản xuất đưa đảm bảo để áp dụng cho nghiên cứu dịch tễ huyết học với độ nhạy đặc hiệu 100%; lặp lại 4,9 % - 9,3 %; độ tái lặp 6,3 %-10,6 %; Giới hạn phát kháng thể IgG 145 mIU/ml; độ tuyến tính có R2 94,7% 4.2 Thẩm định kỹ thuật ELISA định lượng kháng thể IgG kháng vi rút sởi huyết sinh phẩm Enzygnost Measles/IgG hãng Siemens Khi kiểm tra độ lặp độ tái lặp kỹ thuật cho CV nhỏ số liệu công bố nhà sản xuất (CV độ lặp 4,9 % - 9,3 % độ tái lặp 6,3 % 10,6 %) Thông số kỹ thuật độ lặp độ tái tốt công bố nhà sản xuất với điều kiện tay nghề, thiết bị điều kiện phịng thí nghiệm trung tâm Các thông số độ tái lặp, lặp lại, độ tuyến tính khơng khẳng định mức độ ổn định sinh phẩm mà khẳng định điều kiện xét nghiệm đạt tiêu chuẩn đánh giá tay nghề người làm xét nghiệm đảm bảo thực quy trình, kỹ thuật Điều đặc biệt quan trọng chất lượng xét nghiệm kỹ thuật định lượng Trong nghiên cứu xác định số thông số kỹ thuật mà nhà sản xuất không đưa giới hạn định lượng độ khơng đảm bảo đo, tương ứng 145 mIU/ml 0,07 Với thơng số kỹ thuật hồn tồn đáp ứng yêu cầu xét nghiệm định lượng kháng thể kháng sởi phục vụ cho nghiên cứu xác định tồn lưu kháng thể kháng vi rút sởi phụ nữ có thai họ V KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO Trần Văn Tiến Giám sát kiểm soát bệnh truyền nhiễm người Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, 2003: 148-159 World Health Organization, http://www.nccvmtc org/PDF1/1_033.pdf, accessed on July, 2017 Nguyễn Trần Hiển, Phạm Ngọc Đính Thành 25 năm tiêm chủng mở rộng Việt Nam Nhà xuất Y học, Hà Nội, 2012: 7-33 Sở Y tế Hà Nội Báo cáo tóm tắt hoạt động 30 năm chương trình tiêm chủng mở rộng, 2014 Nguyễn Ngọc Quỳnh, Đặng Thị Kim Hạnh, Ngơ Khánh Hồng cs Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh sởi Hà Nội năm 2014 Tạp chí Y học dự phòng 2015; 15 (3): 45-51 Tài liệu cho Phịng thí nghiệm y tế - u cầu chất lượng lực, TCVN ISO 15189:2014, ISO 15189: 2012 Dimech W, Mulders MN A review of testing used in seroprevalence studies on measles and rubella Vaccine 2016; 34(35): 4119-4122 Cohen BJ, Parry RP, Doblas D et al Measles immunity testing: comparison of two measles IgG ELISAs with plaque reduction neutralisation assay J Virol Methods 2006; 131(2): 209-212 Cohen BJ, Doblas D, Andrews N Comparison of plaque reduction neutralisation test (PRNT) and Tạp chí Y học dự phòng, Tập 27, số - 2017 109 measles virus-specific IgG ELISA for assessing immunogenicity of measles vaccination Vaccine 2008; 26(50): 6392-6397 10 Mao NY, Zhu Z, Jiang XH Comparison and evaluation of enzyme-linked immunization assay kits with plague reduction neutralization test for detection of measles IgG antibody Zhongguo Yi Miao He Mian Yi 2009; 15(3): 215-218 VERIFICATION OF ELISA FOR QUANTIFICATION OF IgG ANTIBODY AGAINST MEASLES VIRUS APPLIED IN HANOI PREVENTIVE MEDICINE CENTER Nguyen Thi Kieu Anh1, Do Phuong Loan2 Hanoi Preventive Medicine Center National Institute of Hygiene and Epidemiology ELISA is one of the techniques applied for quantitative analysis of measles antibodies However, it is necessary for selection of appropriate kits with technical criteria which is suitable for the test and laboratory This study was carried out to select the most suitable commercial kits to measure measles IgG level in serum and to verify technical criteria of technique using the selected kit The selection of the kit was based on criteria such as sensitivity, specificity, linearity, precision, limit of quantification, measurement uncertainty and price The technical criteria were determined based on the guideline of technique verification of ISO 15189, version 2012, using 50 panel serum samples which were already 110 measured antibody levels supplied by National Institute of Hygiene and Epidemiology The panel samples had different measles antibody levels and ranging from negative, low, average and high titer Siemens kit was selected based on criteria in which the sensitivity and specificity were 100% for both, CV of the repeatability and reproducibility were 4.9 % - 9.3 % and 6.3 % - 10.6 %, respectively; limit of detection was 145 mIU/ml and the linearity had R2 of 94,7% All technical criteria were met the requirment of quantitative technique and appropriate to indicated criteria of the manufacturer Keywords: ELISA, measles, IgG antibodies Tạp chí Y học dự phịng, Tập 27, số - 2017 ... khuyến cáo sử dụng phòng xét nghiệm chuẩn thức phục vụ cho chiến lược loại trừ sởi 3.2 Thẩm định kỹ thuật ELISA định lượng kháng thể IgG kháng vi rút sởi huyết sinh phẩm Enzygnost Measles /IgG. .. %; Giới hạn phát kháng thể IgG 145 mIU/ml; độ tuyến tính có R2 94,7% 4.2 Thẩm định kỹ thuật ELISA định lượng kháng thể IgG kháng vi rút sởi huyết sinh phẩm Enzygnost Measles /IgG hãng Siemens... sánh nồng độ kháng thể IgG trung bình mẫu dương tính dàn mẫu thực TTYTDPHN Vi? ??n VSDTTW Kết cho th? ?y nồng độ kháng thể trung bình Trung tâm Y tế dự phịng Hà Nội thực 1270±972,0 mIU/ml Vi? ??n VSDTTW