Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦU Cho tới nay đã có khoảng 2000 loại virus hại thực vật được phát hiện, trong đó có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và chất lượng cây trồng. Để hạn chế sự l
MỞ ĐẦU Cho tới có khoảng 2000 loại virus hại thực vật phát hiện, có nhiều loài gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới suất chất lượng trồng Để hạn chế sự lây lan của virus thực vật , những biện pháp truyền thống được áp dụng hi ện loại bỏ những bị bệnh mới phát hiện , phun thuốc diệt môi giới truyền bệnh…t ỏ hiệu quả l ại đòi hỏi nhiều thời gian , công sức và ảnh hưởng xấu tới môi trường Việc tì m các biện pháp để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của virus gây b ệnh thực vật là một vấn đề được quan tâm nghiên cứu Sự phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học thời gian gần thúc đẩy nhiều nghiên cứu theo hướng tạo giống trồng có khả kháng virus gây hại cơng nghệ gen, góp phần phát triển xu cơng phịng chống bệnh hại thực vật Cùng với phát triển công nghệ sinh học, đã có nhiều ứng dụng sinh học phân tử chọn tạ o giống trồng kháng virus , đó , công nghệ RNA interference (RNAi) tỏ giải pháp hữu hiệu thông qua việc sử dụng vật liệu di truyền từ virus gây bệnh chuyển vào trồng tạo chuyển gen kháng chính virus đó với hiệu có thể lên tới 80-95% Ở Việt Nam gần có số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo giống trồng chuyển gen chống lại bệnh virus gây Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện Cơng nghệ sinh học nhóm nghiên cứu Việt Nam thành công việc ứng dụng kỹ thuật RNAi mơ hình th́c lá chủn gen kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc (TMV) hoặc kháng đồng thời loại virus Nhằm tiếp tục phân tích đặc tính di truyền gen chuyển hệ sau, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu các phương pháp phân tí ch thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá hệ T1” Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh virus thƣ̣c vật 1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh virus hại thƣ̣c vật Virus thực vật phát vào cuối kỉ 19 đến đầu kỉ 20 có nhiều virus gây bệnh cho thực vật phát virus khảm thuốc lá, virus thối hóa khoai tây, virus hại cà chua,… Virus thực vật gây hại nặng nề tới suất chất lượng nông sản, mức độ thiệt hại có lên tới 100% Theo ước tính thiệt hại hàng năm bệnh virus gây giới vào khoảng 70 tỉ USD (Nguyễn Văn Tỵ , 2002) Cho đến nay, với phát triển sinh học trợ giúp trang thiết bị, phương tiện đại, ngàn loại virus phát hiện, có 2000 lồi virus hại thực vật Virus thực vật là những vi sinh vật vô cùng nhỏ bé và có nhữn (PGS.TS Vũ Triệu Mẫn và PGS.TS Lê Lương Tề , 2002) g đặc ểm : Virus có cấu tạo rất đơn giản : có hai phần chính lõi axit nucleic vỏ protein Thông thường virus thực vật có vật chất di truyền là RNA , mợt sớ í t còn lại c ó vật chất di truyền là DNA Virus là vi sinh vật kí sinh ở mức độ tế bào Virus thực vật có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài , mỡi lồi có thể nhiễm hay nhiều loài virus Virus thực vật virus động vật, sau xâm nhiễm vào tế bào chủ chúng bắt đầu tác động đến trao đổi chất tế bào, virus sử dụng vật chất tế bào để tạo thành số virus Do thể thực vật bị kiệt quệ dần dần, thối hóa suy tàn có bị chết Khoảng thời gian từ lúc virus bắt đầu xâm nhiễm đến thối hóa chết phụ thuộc vào đặc điểm gây bệnh loài khác phụ thuộc vào từng loại sức chống chịu từng Virus khơng thể phịng chống, tiêu diệt xử lí chất hóa học những bệnh vi khuẩn, nấm sâu bọ Cách để loại bỏ virus phải loại bỏ những trồng bị bệnh 1.1.2 Những thiệt hại bệnh virus thực vật Do virus có cấu trúc di truyền đơn giản, nên khả nhân lên lây lan tế bào vật chủ nhanh chóng gây biểu bệnh thời gian ngắn Tác hại lớn virus làm cho bị thoái hoá, giảm sức sống, dần tàn lụi Thiệt hại quan trọng thứ hai virus ảnh hưởng tới phẩm chất sản phẩm nông nghiệp Sản phẩm từ bị nhiễm virus thường có chất lượng xa so với trồng bình thường Hạt lúa bị bệnh vàng lụi thường bị lép không cho thu hoạch, trường hợp thu hoạch hạt thường nhỏ hạt gạo bị đen, ăn có vị đắng Khoai tây bị virus gây hại làm cho cằn cỗi, khảm loang lổ, củ khoai nhỏ, hàm lượng tinh bột chất dinh dưỡng thấp Citrus tristeza virus hại cam quít nặng vùng bờ biển Địa Trung Hải, Trung Mỹ Đông Nam Á Bệnh làm cho cam chín ép rụng sớm, non úa vàng vỏ, nước cam nhạt khơng mùi vị Việt Nam có chiều dài gần 2.000 km, khí hậu nhiệt đới gió mùa trồng, thảm thực vật Việt Nam hệ sinh vật nước ta phong phú Đây điều kiện để bệnh virus Việt Nam đa dạng chủng loại lại dễ lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng tới sản xuất Gây hại nghiêm trọng có thể kể tới virus gây bệnh lúa (bảng 1.1) Trong lịch sử trồng lúa nước ta xảy nhiều trận dịch lớn vào năm 1910, 1920, 1940 -1945, 1964 -1969, 2006-2010 tiêu huỷ chục vạn lúa, tốc độ lây lan nhanh Cây lúa bị bệnh lúc đầu sẫm màu, sau lùn thấp xoè ngang, thâm lâu rễ đen, chết lụi nhanh chóng Bệnh có thể xuất từ vài m2 sau lây lan hàng trăm, hàng nghìn Làm cánh đồng lúa từ màu xanh biến thành màu nâu chết lụi vòng 10 -15 ngày sau phát bệnh Gạo thu từ lúa bị bệnh thường có màu sẫm, đắng khơng ăn Do đó, thiệt hại bệnh có thể tính 100% (1964 - 1968); đặc biệt dịch bệnh lúa lùn xoắn lá, lúa cỏ, lúa vàng lùn phá hoại miền tây Nam diện tích 500.000 (năm 2006 - 2007) Gần (2009-2010) virus gây bệnh lùn sọc đen lúa xuất số tỉnh phía Bắc Nam Định, Thái Bình,…(Bệnh chuyên khoa - Vũ Triệu Mân ) Một số virus gây bệnh khác cà chua, khoai tây, lạc, đậu tương (bảng 1.1),… có thể làm ảnh hưởng đến 80% suất trồng Bảng 1.1 Một số loại virus gây bệnh lương thực và hoa màu Cây chủ Bệnh Virus gây hại Lúa Bệnh vàng lá tungro Rice Tungro Sperical virus-RTSV Bệnh lúa cỏ Rice Grassy Stunt Virus- RGSV Bệnh lùn xoăn lá Rice Ragged Stunt Virus- RRSV Bệnh sọc đen lùn Rice Black Streaked Drap Virus- RBSDV Bệnh khảm lá ngô Maize Mosaic Virus- MMV Bệnh khảm lùn ngô Maize Dawrf Mosaic Virus- MDMV Ngô Cà chua Khoai tây Dưa chuột Bệnh xoăn vàng lá cà chua Tomato Yellow Leafcurl Virus- TYLV Bệnh đốm héo cà chua Tomato Spotted Wilt Virus- TSWV Bệnh khảm lá cà chua Tomato Mosaic Virus- ToMV Bệnh virus Y khoai tây Potato Virus Y- PVY Bệnh virus A khoai tây Potato Virus A- PVA Bệnh virus X khoai tây Potato Virus X- PVX Bệnh virus S khoai tây Potato Virus S- PVS Bệnh virus M khoai tây Potato Virus M-PVM Bệnh cuốn lá khoai tây Potato Leafroll Virus- PLRV Bệnh khảm Aucuba Potato Aucuba Mosaic Virus- PAMV Bệnh khảm dưa chuột Cucumber Mosaic Virus- CMV 2.1.3 Biện pháp phòng chớng Trên giới, nhiều biện pháp phịng trừ bệnh virus hại thực vật áp dụng loại bỏ nguồn bệnh, tiêu diệt côn trùng trung gian, diệt cỏ dại, luân canh trồng, dùng giống bệnh hoặc giống chống bệnh, chịu bệnh Dựa vào đặc điểm từng loại virus gây hại đặc tính trồng, người ta đề những biện pháp phịng trừ cho từng nhóm bệnh theo khả truyền lan tồn nguồn bệnh 2.1.3.1 Sử dụng giống trồng có khả kháng b ệnh virus Phương pháp đem lại hiệu cao, không gây ô nhiễm môi trường tạo bệnh Tuy nhiên biện pháp g ặp nhiều hạn chế số lượng giống kháng bệnh nguồn vật liệu di truyền kháng virus phục vụ cho cho công tác lai tạo giống Hơn nữa, suất chất lượng giống kháng điều đáng lưu tâm khó tích hợp nhiều phẩm chất giống trồng 2.1.3.2 Sử dụng hạt, giống trồng bệnh Sử dụng nguồn vật liệu giống bệnh xem biện pháp quan trọng để hạn chế bệnh virus nhiều loại trồng Có thể tạo nguồn hạt giống, củ, giống bệnh những biện pháp xử lý củ/hạt nhiệt hoặc hóa chất hoặc nhân giống in vitro tạo củ hoặc bệnh Nhược điểm biện pháp các loại trồng có thể bị nhiễm virus quá trì nh canh tác đồng ruộng 2.1.3.3 Biện pháp canh tác Luân canh xen canh có thể giảm bớt thiệt hại sâu bệnh gây so với trồng loại trồng Mặt hạn chế của biện pháp này là rất khó chọn được hệ thống luân canh xen canh vừa có hiệu quả đối với một số bệnh quan trọng mà đem lại lợi ích cao mặt kinh tế Mùa vụ thích hợp giúp giảm thiệt hại sâu bệnh gây mà giúp gia tăng suất đáng kể Gieo trồng tránh mùa phát triển trùng trung gian truyền bệnh (cịn gọi né bệnh) có thể hạn chế phần thiệt hại virus gây 2.1.3.4 Kiểm sốt trùng trung gian trùn bệnh và loại bỏ loại ký chủ trung gian nhƣ cỏ dại ,… Hiện phổ biến dung loại thuốc trừ sâu diệt cỏ để hạn chế trung gian Tuy nhiên, nhiều loại virus TMV lây truyền qua đường giới, virus lây lan trực tiếp qua khí khổng hoặc vết thương vật chủ Hơn nữa, việc lạm dụng thuốc trừ sâu có thể gây ô nhiễm môi trường, gây nguy hiểm cho nông dân và người tiêu dùng Bên cạnh đó , virus có thể đượ c lây nhiễm với số lượng rất í t môi giới truyền bệnh , ví dụ: cần rầy nâu / lúa đã có thể truyền virus lùn lúa cỏ (RGSV) 2.1.3.5 Biện pháp công nghệ sinh học: Trong 15 năm qua số virus có thể kiểm sốt thơng qua biện pháp tạo trồng chuyển gen mang gen hoặc đoạn gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh (Reddy el al., 2009) Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh sử dụng chủn vào trồng để tạo tính kháng có thể loại khác như: cấu trúc vius theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngược (antisense) (Boogaart et al., 1998), cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) (Yin et al., 2005) miRNA nhân tạo có đích trình tự gen virus gây bệnh (Niu et la., 2006; Qu Fang, 2008) Thành công việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo giống trồng kháng bệnh virus đánh dấu công bố Beachy cộng năm 1986 những thuốc chuyển gen mã hóa protein vỏ TMV (cấu trúc dạng sense) biểu tính kháng với virus (Beachy, 1990; Register Nelson, 1992) Sau Beachy cộng phát triển những thí nghiệm thành phương pháp CP tạo trồng kháng virus Phương pháp áp dụng tạo những dòng chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh thực vật hai mầm sau thực vật mầm (xem tổng quan Hull Davies, 1992) Tuy vậy, chuyển gen kháng chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà chuyển vào Điều gây trở ngại việc phát triển giống trồng kháng virus dựa phương pháp CP độ đa dạng virus thường cao (Scholthof et al., 1993) Tương tự phương pháp CP, biểu gen mã hóa cho enzyme liên quan tới trình tự chép hoặc mã (các replicase) có thể tạo chuyển gen kháng virus Cũng nghiên cứu đối tượng TMV, Carr cộng nhận thấy những dòng thuốc mang gen mã hóa cho replicase có khối lượng phân tử 183kDa hoặc 54kDa có khả kháng TMV tốt những dòng chuyển gen CP Biểu replicase virus khoai tây X (potato virus X: PVX) hay virus khảm dưa chuột (cucumber mosaic virus: CMV) chứng minh hiệu bảo vệ thực vật phương pháp (Braun Hemenway, 1992; Anderson cộng sự, 1992) Tuy vậy, tương tự phương pháp CP, phương pháp bảo vệ qua trung gian gen replicase có tác dụng từng chủng virus Hơn nữa, gen mã hóa cho replicase thường lớn, gây trở ngại biểu thực vật Nhằm khắc phục những hạn chế cấu trúc “dạng sense”, cấu trúc dạng antisense mang đoạn DNA có trình tự bổ sung với RNA virus có thể ức chế phiên mã với những trình tự RNA tương đồng nghiên cứu phát triển Nhiều dòng thuốc lá, khoai tây, cà chua,… kháng virus tạo dựa kỹ thuật này.Việc sử dụng những đoạn DNA thay đoạn gen mã hóa làm những dịng chủn gen có khả kháng với nhiều dịng virus thay vài dịng định (Boogart et al, 1998) Cho tới những năm cuối kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi xem kỹ thuật đại hữu hiệu việc chống lại bệnh virus gây thực vật Năm 2004, Baulcombe công bố chế hoạt động siRNA coi chế quan trọng việc kháng lại virus thực vật Các bước kỹ thuật bao gồm: (1) thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt mRNA virus gây bệnh, (3) sàng lọc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kiểm tra tính kháng virus chuyển gen (Tenllado et al., 2004) Tính hiệu kỹ thuật RNAi việc tạo trồng chuyển gen mã hố protein virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả kháng lại chính virus chứng minh thực tế những nghiên cứu tạo trồng kháng loại virus khác như: Potato virus Y PVY (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000), cucumber mosaic virus CMV (Kalantidis et al., 2002), Plum pox potyvirus PPV (di Nicola-Negri et al., 2005), Tobacco mosaic virus TMV Potato virus Y PVY (Sun et al., 2005), , Tomato yellow leaf curl virus TYLCV (Zrachya et al., 2007)Rice tungro bacilliform virus RTBV (Tyagi et al., 2008) African cassava mosaic virus ACMV (Vanderschuren et al., 2009 )… Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen virus lặp lại đảo chiều thường sử dụng để chuyển vào biểu thành RNA sợi đơi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) chuyển gen từ kích thích chế RNAi hoạt động có xâm nhập virus vào Người ta nhận thấy vùng đệm hpRNA lặp lại với trình tự intron (ihpRNA) kết ihpRNA tạo bất hoạt gen cao (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001) Năm 2007, Bonfim cộng tạo dòng đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93% Cũng năm này, Shinichiro Kamachi cộng công bố kết tạo số dòng thuốc chuyển gen CP cấu trúc ihpRNA có khả kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến hệ T2 (12/14 số kiểm tra) những siRNA phát những dòng chuyển gen Nói chung, hầu hết chuyển gen làm chậm tích lũy virus làm chậm hoặc giảm nhẹ triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009) Cho đến có loại trồng chuyển gen kháng bệnh virus công nhận trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vịng (papaya ringspot virus, PRSV) cơng nhận trồng Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, công nhận trồng Mỹ; Ớt cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, công nhận trồng Trung Quốc … Ngoài nhiều loại trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác giai đoạn khảo nghiệm để công nhận giống trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus)… (Reddy et al, 2009) 2.1.4 RNAi và chế kháng bệnh bằng phƣơng pháp chuyển gen virus RNAi chế để kiểm soát ch̃i thơng tin di truyền hay cách vơ hiệu hố hoạt động gen xác định hai nhà khoa học Andrew Z Fire Craig C Mello khám phá cơng bố tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 RNAi (RNA interference) coi phương thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại xâm nhập virus RNA cách phân huỷ trình tự nucleotide tương đồng chúng Nó làm trung gian kháng lại acid nucleic ngoại bào nội bào, nhờ điều khiển biểu gen mã hóa protein Nó thực có xuất phân tử RNA mạch kép thể sinh vật gây nên ức chế biểu gen loại trình tự đặc hiệu Hình 1.1: Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi Cơ chế RNAi bắt đầu việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) enzyme Dicer - những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26 nucleotide Các siRNA giải xoắn mạch gắn kết với phức hợp protein cách chọn lọc gọi phức hợp cảm ứng bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex) Argonaute (protein Argonaute) RISC có chứa RNase-H hoạt động nhờ endonuclease tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, có ch̃i đơn RNA có đầu 5‟ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ chọn để tiếp tục vào phức hệ RISC Sau đó, RISC thu nhận phân tử phiên mã mRNA nội sinh tế bào có trình tự tương đồng với trình tự ch̃i siRNA có mặt phức hệ cách bắt cặp với base theo nguyên tắc bổ sung Khi nhận diện mRNA nhanh chóng bị cắt đứt khoảng giữa chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA bị tiêu hủy RNA nuclease (Helicase) có RISC Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành siRNA Quá trình tiếp diễn liên tục nhờ phân hủy mã hình thành, kết ức chế biểu gen mong muốn 2.1.5 Một số thành tựu trồng chuyển gen kháng virus Việt Nam Virus là nguyên nhân gây hại tới nhiều loại trồng thế giới cũng ở Việt Nam Hầu hết các bệnh thực vật virus gây cho tới chưa có thuốc đặc trị, tạo giống trồng kháng bệnh virus mục tiêu nhiều nghiên cứu nước ta Từ năm 1999, phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ sinh học phối hợp với nước khu vực ASEAN tham gia vào chương trì nh nghiên cứ u phát triển đu đủ chuyển gen kháng virus đốm vịng (Papaya ringspot virus : PRSV) tở chức ISAAA (International Service for Acquisition of Agri -biotech Application) tài trợ Trong khuôn khổ đề tài nhóm thực hiện đã phân lập được g en CP của một số chủng virus tại miền Bắc và Nam Trung Bộ Gen CP được sử dụng để thiết kế cấu trúc chuyển gen vào đu đủ nhằm tạo chuyển gen kháng virus đốm vòng Một số dòng đu đủ chuyển gen đã biểu hiện tính kháng virus sau thử nhiễm bệnh nhân tạo (Lâm Đại Nhân, 2000; Lê Trần Bì nh, 2008) Thời gian gần có số nghiên cứu theo hướng ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo giống trồng chuyển gen chống lại bệnh virus gây Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học GS Lê Trần Bình TS Chu Hồng Hà đứng đầu nhóm nghiên cứu Việt Nam thành công việc ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo chuyển gen kháng virus Một những kết đề tài cấp Viện KH &CN Việt Nam được tiến hành 10 ... nghệ RNAi đối với các đối tượng trồng khác 2.2 Cây thuốc lá - mô hì nh nghiên cƣ́u tạo trồng chuyển gen khá ng virus 2.2.1 Giới thiệu chung về thuốc lá Cây thuốc có tên khoa... chuyển gen làm chậm tích lũy virus làm chậm hoặc giảm nhẹ triệu chứng bệnh (Gottula et al, 2009) Cho đến có loại trồng chuyển gen kháng bệnh virus công nhận trồng thương mại như: Đu đủ chuyển gen. .. loại trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác giai đoạn khảo nghiệm để công nhận giống trồng thương mại như: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng