Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

62 2.4K 7
Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu đề tài 2 1.3 Yêu cầu 2 1.4 Nội dung thực hiện 2

1 Phần I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật trong nông nghiệp đã mang lại nhiều thành tựu to lớn trong đó quan trọng nhất là giảm tỷ lệ đói nghèo trên thế giới nhờ nâng cao năng suất cây trồng. Mặc dù thuốc bảo vệ thực vật giúp giảm tổn thất do sâu hại (ước tính mức độ tổn thất do sâu hại nếu không sử dụng thuốc trừ sâu là 83 % ở lúa gạo và 84 % ở bông vải (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2004)) song thuốc trừ sâu cũng mang lại những bất lợi khó giải quyết như: ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe con người, mất cân bằng sinh thái và gây tính kháng của côn trùng. Trong những năm gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu tạo ra các cây trồng chuyển gen mang tính kháng, xem các giống kháng là thành phần chủ yếu trong hệ thống phòng trừ tổng hợp. Tuy nhiên, những gen dùng trong công nghệ chuyển gen còn ít, chuyển gen tỷ lệ thành công thấp và vẫn còn tồn tại những tranh cãi về tính an toàn của cây chuyển gen nên thuốc trừ sâu vi sinh được coi là giải pháp khả thi, có thể đáp ứng nhanh yêu cầu của con người về một giải pháp phòng trừ sâu hại an toàn môi sinh và hiệu quả, giúp hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Thuốc trừ sâu vi sinh gồm các sản phẩm từ các loài thiên địch của sâu như: các loài ăn mồi, sinh, nguồn bệnh, trong đó các chế phẩm tạo nên trên cơ sở các loài nấm chiếm vị trí quan trọng, đặc biệt chế phẩm nấm diệt sâu từ nấm Beauveria bassiana đã có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn trùng gây hại. Để nâng cao hiệu quả ứng dụng của nấm này, cần đẩy mạnh các nghiên cứu về sinh học, sinh lý, sinh thái và mối quan hệ giữa nấm Beauveria bassiana với côn trùng vật chủ. Trong đó, nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh học hiện nay khi nghiên cứu các đối tượng là đọc được chuỗi mã DNA để phân tích bộ genome nhằm tìm hiểu quan hệ di truyền của các đối tượng nghiên cứu và mối liên hệ giữa genome với tính độc của nấm nhằm tạo ra các chế phẩm vi nấm có hiệu quả diệt côn trùng cao. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, chúng tôi chỉ đọc trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của rDNA để so sánh sự biến đổi trong trình tự giữa các chủng nấm Beauveria bassiana. 2 1.2. Mục tiêu đề tài Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 các nguồn nấm Beauveria basiana có tính độc cao và đọc trình tự sản phẩm PCR của nấm làm cơ sở xác định mối liên hệ giữa tính độc của nấm với những biến đổi trong trình tự vùng ITS - rDNA 1.3. Yêu cầu Nắm vững nguyên tắc nuôi cấy và nhân sinh khối nấm. Nắm vững kỹ thuật PCR Nắm vững nguyên tắc đọc trình tự. 1.4. Nội dung thực hiện Phân lập thêm một số dòng nấm Beauveria bassiana sinh trên côn trùng. Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm có tính độc cao. Đọc trình tự vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 trực tiếp từ sản phẩm PCR và tiến hành so sánh với cơ sở dữ liệu của NCBI. 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana 2.1.1. Vị trí phân loại Lớp: Deuteromycetes. Bộ: Moniliales. Họ: Moniliaceae. Giống: Beauveria. Giống Beauveria thường được chia thành 3 loài: Beauveria bassiana, Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn trùng (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.2. Đặc điểm hình thái Theo Nguyễn Ngọc - Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Nấm Beauveria bassiana có bào tử trần hình cầu (đường kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-5,5 x 1,3 m). Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi trường, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng.” Nấm khi mọc trên côn trùng thường có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và có nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi. Khi mọc trên môi trường thạch, nấm Beauveria bassiana nhìn chung có màu trắng, viền khuẩn lạc thường có màu kem hoặc vàng nhạt, thỉnh thoảng có màu đỏ nhạt (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). Beauveria bassiana tạo rất nhiều bào tử, bào tử thường có hình cầu, hình trứng, có khi chiều dài lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Các sợi nấm khí sinh mang các giá bào tử trần ngắn, phồng to 3 - 5 x 3 - 6 m. Các giá bào tử này hoặc tạo thành các nhánh ở phần ngọn, hoặc trực tiếp tạo thành các tế bào sinh bào tử trần. Các tế bào sinh bào tử trần thành cụm, được tạo thành từ giá hoặc từ nhánh của giá, hoặc được tạo thành trực tiếp từ sợi nấm khí sinh hay từ nhánh ngang và ngắn của các sợi nấm này. Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần hình cầu, hình chai 2,5 - 3,5 x 3 - 6 m, phần ngọn của tế bào dạng cuống hẹp, ngoằn ngoèo hình chữ chi, hoặc ngoằn ngoèo không 4 đều, có răng cưa 1 x 5 - 20 m. Bào tử trần không có vách ngăn, hình cầu hoặc elip, đôi khi có gốc nhọn, nhẵn 2 – 3 x 2 – 4 m, màu trắng hay vàng nhạt (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy 2.1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy Do có hệ enzyme phong phú (lipase, protease, urease, aspatainase, amylase) nên nấm này có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường dinh dưỡng với các thành phần khác nhau. Trong đó môi trường thạch khoai tây hay được sử dụng và khả năng phát triển của nấm trên môi trường này là tốt nhất (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.3.2. Điều kiện nhiệt độ Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng, hầu như ảnh hưởng tới toàn bộ hoạt động sống của nấm, mỗi loại nấm chỉ có khả năng phát triển trong một giới hạn nhiệt độ nhất định. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự nảy mầm, phát triển và tạo bào tử của nấm Beauveria bassiana là 25 – 30oC (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.3.3. Điều kiện pH Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trường từ 3 - 9 không ảnh hưởng tới sự phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral (1970) nấm Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trường, pH thuận lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng phát triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,3 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.4. Điều kiện phân bố Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống như hầu hết các loại nấm diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành thành viên trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên. Vì là vật sinh chuyên hóa 5 rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng nhiễm thành công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm khác nhau: qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp và qua lỗ của thân. Ngoài ra, nấm Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận lợi dưới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh dưỡng kết lại thành một thể rắn chắc). Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì: chúng có thể phát triển trên môi trường dinh dưỡng, có thể được chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêu diệt một lượng không nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). Nấm Beauveria bassiana có khả năng phát tán rộng trong thiên nhiên thông qua các hoạt động phóng bào tử bằng cơ học (chúng có có khả năng bắn bào tử tới khoảng cách gấp hàng nghìn lần lớn hơn kích thước của chúng), lan truyền nhờ dòng nước, không khí và côn trùng (một số loài của bộ Collembola, như Lepidocyrtus giúp nấm Beauveria bassiana di chuyển khá xa) (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.5. Độc tố của nấm Beauveria bassiana Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào tử nảy mầm. Tên thông thường của độc tố là beauverixin, công thức hóa học C45H57O9N3 - ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)3. Đó là một loại depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94oC (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 6 Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của beauvericin (F. R. Champlin, 1979) Tiến trình cấy chuyền Beauveria bassiana qua côn trùng vật chủ sống thì nồng độ độc tố tạo thành tăng hơn so với Beauveria bassiana phân lập giữ trên môi trường tổng hợp. Ngoài ra, nồng độ độc tố cao nhất với sâu được tạo thành khi nấm được nuôi cấy trên chính sâu này. Như vậy, nguồn dinh dưỡng của nấm có ý nghĩa đối với sự hình thành độc tố chuyên hóa (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). Ngoài ra, mô côn trùng bị nhiễm nấm thì bền vững dưới tác dụng của vi sinh vật gây thối rữa chứng tỏ nấm này có khả năng tạo ra một số chất trao đổi giống kháng sinh. Evlachova (1970) đã nghiên cứu tính chất kháng khuẩn của một số nòi nấm Beauveria bassiana và kết luận rằng phổ diệt khuẩn của chúng khá rộng. Tính chất này rất có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất (trích dẫn Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.6. Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng 2.1.6.1. Sự xâm nhập Các nấm diệt sâu xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua toàn bộ vỏ cutincun ngoài nhờ enzyme phân hủy lớp chitin của cutincun (Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). Theo Robinson R.K. (1996), sự xâm nhập của nấm diệt sâu qua lớp cutincun ngoài được thực hiện bằng lực cơ học, còn sự tiến sâu vào lớp cutincun trong thì được thực hiện nhờ họat động của enzyme do chính nấm tiết ra. Ngoài ra, Robinson R.K. 7 cũng xác nhận rằng các nấm diệt sâu chuyên hóa cao tạo nên trên bề mặt cutincun một kiểu giác bám phồng lên dạng kim xuyên vào bên trong cuticun của côn trùng. Sự xâm nhập vào xoang thân côn trùng xảy ra khá nhanh chóng, qua 32 - 48 giờ đã làm đầy cơ thể côn trùng với những đoạn sợi nấm đơn bào tự do bơi trong huyết tương dẫn đến sự phá hủy tiếp theo mô thân côn trùng (trích dẫn Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.6.2. Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết Theo Sekhurina J. A. (1964), khi các bào tử chồi của nấm Beauveria bassiana bắt đầu sinh sôi nảy nở trong huyết tương của bọ rùa thì bọ rùa bắt đầu tê liệt, và sau khi vật chủ chết thì nấm mọc thành sợi nấm chui vào trong các bắp cơ và khí quản của côn trùng; các chế phẩm mô bệnh lý nhuộm cho thấy hạch thần kinh bị biến đổi màu do ảnh hưởng của độc tố (ở giai đoạn đầu của bệnh tê liệt các hạch thần kinh có màu xanh tím, khi bị nấm sinh có màu xanh đỏ đậm trong khi đó màu của hạch thần kinh ở côn trùng khỏe có màu xanh lá cây) (trích dẫn Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). Hình 2.2 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng (Scholte E-J, 2004) 2.1.7. Triệu chứng của côn trùng nhiễm nấm A: sự xâm nhập. B: lớp cutin. C: sợi nấm phát triển. D: sợi nấm hình thành vách ngăn. E: túi bào tử hình thành. F: bào tử động. G: bào tử noãn. 8 Nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của nấm có lợi lên các đối tượng côn trùng khác nhau đã đưa ra các kết quả mô tả triệu chứng khác nhau: Làm biến đổi thành phần, hình dạng các nguyên tố enzyme và phản ứng huyết tương, làm giảm khả năng sinh sản, làm giảm trọng lượng, phá hủy sự hô hấp và phá hủy chức năng hệ thống nội tiết của côn trùng. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm Beauveria bassiana lên độ mắn đẻ của bướm Torticidae hại táo, Kondria V.S (1966) đã đưa ra kết luận rằng việc xử lý nhộng bởi nấm này làm giảm độ mắn đẻ của bướm rất nhiều. Trong các thí nghiệm nhiễm 5000, 15000, 45000 bào tử nấm Beauveria bassiana lên các con cái thì số lượng trứng trung bình còn lại không bị hư lần lượt là 59, 47 và 29 so với đối chứng là 71 trứng. Zagae (1963) cho biết độ mắn đẻ của các con cái bọ cánh cứng nhiễm Beauveria bassiana đã giảm tới 48 % so với đối chứng và nếu kết hợp với DDT sẽ giảm tới 83 % (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang). Phá hủy chức năng sinhcủa côn trùng. Theo Ferron P. (1967) thì sự nhiễm nấm trắng và nấm xanh trên sâu Melolontha melolontha sẽ gây ra hiện tượng biến đổi sinh hóa và giảm lực oxy hóa khử dẫn tới tình trạng hóa melanin trong huyết tương. Ngoài ra, công trình nghiên cứu của Codaira (1967) cho thấy sự nhiễm nấm vào côn trùng còn làm thay đổi độ nhớt của huyết tương. Một số các nhà nghiên cứu khác (Dieuzeide R. 1926, Cordon T.C và Schwartz J.H. 1962) còn thấy các tinh thể được tạo thành trong huyết tương khi côn trùng bị nhiễm nấm (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang). Phá hủy quá trình biến thái và phát triển của côn trùng, cụ thể là các ấu trùng bị nhiễm nấm không lột xác được (Benz G., 1963). Theo Gosswald K. (1938), nấm Beauveria bassiana có thể nhiễm tất cả các pha phát triển của Bombyx mori. Theo Prasertphon (1967), khi nấm B. bassiana nhiễm vào ấu trùng tuổi 4 và 5 của bọ rùa gây hại thì biểu hiện của ấu trùng bị phá hủy như sau: ấu trùng và rệp non không thể thoát ra khỏi tầng cutincun cứng và ở mức độ cao hơn thì côn trùng có dạng gù quái dị (trích dẫn Nguyễn Ngọc và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997). 2.1.8. Các chể phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana 9 Theo danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam (quyết định số 15/2004/QD – BNN ngày 14 tháng 4 năm 2004, các loại chế phẩm nấm Beauveria bassiana được phép sử dụng gồm có: Boverit 5,0 x 108 bào tử/g (Viện Bảo vệ Thực vật) trừ rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đay, sâu róm hại thông, sâu kèn hại tai tượng. Biovip 1,5 x 109 bào tử/g (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long) trừ rầy và bọ xít hại lúa. Beauverine (Công ty Thanh Sơn Hóa Nông) trừ sâu tơ hại bắp cải, sâu đục quả hại xoài. Muskardin (Công ty cổ phần thuốc trừ sâu Cần Thơ) trừ sâu đục thân hại lúa và ngô. Bermetent (Công ty hợp danh sinh học nông nghiệp Sinh Thành, Thành phố Hồ Chí Minh), trừ bọ cánh cứng hại dừa, sâu đục thân, rệp sáp, rầy đen hại mía. 2.2. Tổng quan về ITS - rDNA 2.2.1. Giới thiệu về rDNAvùng ITS rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de Peer và cộng sự, 1996). Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã. Có một rDNA 5 S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5 S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm. Kích thước của mỗi vùng lập lại nằm trong khoảng 7,7 – 24 kbp (Guarro, 1999). 10 Hình 2.3 Sơ đồ nhóm gen rDNA nhân và rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989) rDNA 18 S thường được quan tâm nghiên cứu; rDNA 5,8 S có kích thước rất nhỏ và ít có sự biến đổi song rRNA 5 S là thành phần không thể thiếu của nu - LSU-rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosom và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein (Szymanski và cộng sự, 2001); rDNA 25 S mặc dù ít có sự biến đổi song lại rất có ý nghĩa trong phân loại (Guarro, 1999). Vùng ITSvùng có rất nhiều sự biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999). 2.2.2. Phân nhóm rDNA Theo White và cộng sự (1989), rDNA có thể chia thành 2 nhóm: rDNA nhân và rDNA ty thể. rDNA nhân rDNA nhân (nu - rDNA) gồm có nu - SSU - rDNA (17 - 18 S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị nhỏ (small subunit rDNA) và nu - LSU - rDNA (26 - 28 S) mã hóa rRNA tiểu đơn vị lớn (large subunit rDNA). Nu - SSU - rDNA tiến hóa tương đối chậm, thường được sử dụng trong nghiên cứu các sinh vật có ít quan hệ về mặt di truyền. Nu - LSU - rDNA mặc dù có ít vùng [...]... BXD-Q 9-9 1,05 12 BH-BD-11 0,87 2 SCL-LA-5 1,69 13 BH-BD-12 2,12 3 DP-BD-1 0,54 14 DTB-5 0,54 4 SN-PT-9 2,04 15 PUL-BC-6 1,34 5 CC-TD-4 0,87 16 RM-TD-11 1,52 6 BXD-Q 9-8 2,12 17 PUL-Q 2-4 1,22 7 SX-DL-9 1,45 18 SCL-LA-3 1,67 8 CC-TD-5 1,34 19 SCL-KG-37 2,13 9 DTD-9 1,65 20 SCL-LA-8 1,43 10 BH-BD-13 2,23 21 RN-LA-10 0,30 11 PUL 2 1,69 22 SCL-LA-6 1,32 Nhận xét: Qua bảng 4.1 cho thấy tất cả các nguồn nấm. .. với 7 nguồn nấm: PUL-Q 2-4 , SCL-LA-8, BH-BD-11, SCL-LA-6, RN-LA10, SCL-LA-5, BH-BD-13 và một đối chứng dương là nguồn PUL2 đã được khẳng định là có thể tạo sản phẩm khuếch đại kích thước 580 bp với 2 primer ITS4 và ITS5 Nghiệm thức 2: Nồng độ primer trong 1 phản ứng 20 l là 3 pmol/ l Thí nghiệm được bố trí với 7 nguồn nấm: DP-BD-1, SCL-KG-37, BH-BD-12, SN-PT-9, PUL-BC6, BXD-Q 9-8 , RM-TD-11 Đối chứng... thứ 2 theo nghiệm thức trên với 7 nguồn: PUL-Q 2-4 , PUL-BC6, BH-BD-11, SCL-LA-8, BH-BD-13, RN-LA-10, DTB-9 Đối chứng dương là PUL2, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được bố trí với 2 nấm Metarhizum và Corynespora Chạy PCR lần thứ 3 theo nghiệm thức trên với 6 nguồn: SCL-LA-6, CC-TD-4, SCL-KG-3, BXD-Q 9-8 , SN-PT-9, BH-BD-12 Đối chứng dương là BXD-Q 9-9 , đối chứng âm là nước... kiểu gen của nấm Beauveria bassiana với đặc tính gây bệnh trên các côn trùng như Plutella xylostella, Leptinotarsa decemineata, côn trùng cánh cứng hại khoai tây Shih HL và cộng sự (2002) đã giải trình tự hoàn toàn gene mã hóa 5.8 S rDNAvùng ITS lân cận 2 dòng Beauveria bassiana Sự giống trên toàn vùng trình tự giải được của hai dòng này là 96 % Sự giống nhau ở vùng ITS1 là 96 %, vùng ITS2 là 100... đồng của hai vùng trình tự gen mã hóa 5.8 S rRNA là 98 % Theo Eiji và cộng sự (2002) đã nghiên cứu vùng intron nhóm 1 trong trình tự rDNA mã hóa tiểu đơn vị ribosom (SSU rDNA) của nấm Beauveria bassiana và chỉ ra rằng tổ tiên của Cordicepts prolifera và C kanzashiana có được các vùng intron trong trình tự rDNA là do nhận được từ các nấm khác Khi tiến hành đọc trình tự của SSU rDNA cua nấm Beauveria bassiana. .. Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR 3.4.6 Bố trí thí nghiệm tinh sạch, đọc trình tự và phân tích kết quả Tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 2 nguồn RN-LA-10 và PUL-Q 2-4 Tiến hành đọc trình tự với 2 primer ITS4 và ITS5 Trình tự đọc bằng primer ITS4 và primer ITS5 được so sánh bằng phần mềm Clustal và chọn trình tự đọc đáng tin cậy nhất So sánh trình tự PUL-Q 2-4 và RN-LA-10 bằng phần mềm... sự khác biệt So sánh trình tự PUL-Q 2-4 với trình tự tương ứng của vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 trên 6 nguồn nấm Beauveria bassiana sinh trên nhiều đối tượng chủ chọn ngẫu nhiên trong cơ sở dữ liệu của NCBI So sánh sự tương đồng bằng phần mềm Clustal và tìm những khác biệt giữa 2 nguồn nấm thí nghiệm với trình tự các nguồn còn lại Dùng phần mềm Treeview vẽ diagram của 8 nguồn nấm dùng trong so sánh... tách từ chủ thí nghiệm nhiễm đồng thời hai dòng nấm trên Talaei - hassanloui và cộng sự (2002) đã so sánh trình tự đoạn gen mã hóa RNA ribosom 5.8 S, vùng ITSvùng gen mã hóa các yếu tố kéo dài trong quá trình phiên mã của 10 nguồn Beauveria bassiana khác nhau Kết quả so sánh trình tự của vùng ITS1 - 5.8 S - ITS2 gồm 595 nucleotide của 10 nguồn nấm trên cho thấy chỉ có 0,16 1,77 % trình tự là có... 6 nguồn: SCL-KG-37, RM-TD-11, SCL-LA-5, SX-DL-9, PUL-BC-4, DTB-5, đối chứng dương là PUL-BC-3, đối chứng âm là nước cất 2 lần khử ion vô trùng, thí nghiệm cũng được tiến hành với nấm Paecilomyces để thử khả năng khuếch đại của 2 primer ITS4 và ITS5 trên nấm này Sau khi kiểm tra kết quả và xác định primer đã đạt nồng độ tối ưu, tiếp tục chạy PCR với các nguồn còn lại với nồng độ primer trên Chạy PCR... các nguồn nấm Beauveria bassiana có tính độc cao 3.3.1 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm dùng trong phản ứng PCR 3.3.1.1 Hóa chất Master mix 2X (Sapphire) Các primer: 2 primer sử dụng trong nghiên cứu là ITS 4 và ITS 5 (Biorad), được thiết kế để khuếch đại vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana Trình tự của các primer: Primer Trình tự (5’ - 3’) IT S 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG . đọc trình tự. 1.4. Nội dung thực hiện Phân lập thêm một số dòng nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng. Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 . Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 các nguồn nấm Beauveria basiana có tính độc cao và đọc trình tự sản phẩm PCR của nấm làm cơ sở xác định mối liên

Ngày đăng: 31/10/2012, 09:26

Hình ảnh liên quan

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của beauvericin (F. R. Champlin, 1979) - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 2.1.

Cấu trúc phân tử của beauvericin (F. R. Champlin, 1979) Xem tại trang 6 của tài liệu.
Hình 2.2 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng (Scholte E-J, 2004) - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 2.2.

Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng (Scholte E-J, 2004) Xem tại trang 7 của tài liệu.
Hình 2.3 Sơ đồ nhóm gen rDNA nhân và rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989) - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 2.3.

Sơ đồ nhóm gen rDNA nhân và rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989) Xem tại trang 10 của tài liệu.
Hình 2.4 Sơ đồ vị trí primer trên n u- rDNA (White và cộng sự, 1989) - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 2.4.

Sơ đồ vị trí primer trên n u- rDNA (White và cộng sự, 1989) Xem tại trang 12 của tài liệu.
Bảng 2.2 Trình tự primer dùng khuếch đại mt - rDNA (Bruns và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1989) - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Bảng 2.2.

Trình tự primer dùng khuếch đại mt - rDNA (Bruns và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1989) Xem tại trang 14 của tài liệu.
Hình 2.5 Vị trí primer trên rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989). - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 2.5.

Vị trí primer trên rDNA ty thể (White và cộng sự, 1989) Xem tại trang 14 của tài liệu.
Muthumeenakshi và cộng sự (1994) đã chứng minh có sự đa hình xảy ra khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng ITS của các dòng  Trichoderma harzianum. - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

uthumeenakshi.

và cộng sự (1994) đã chứng minh có sự đa hình xảy ra khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng ITS của các dòng Trichoderma harzianum Xem tại trang 15 của tài liệu.
Bảng 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Bảng 3.1.

Đối tƣợng nghiên cứu Xem tại trang 23 của tài liệu.
Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Bảng 3.3.

Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR Xem tại trang 27 của tài liệu.
Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR. - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 3.2.

Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR Xem tại trang 33 của tài liệu.
Bảng 3.5 Các nguồn nấm dùng trong so sánh (Coates Brat S., 2002)  - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Bảng 3.5.

Các nguồn nấm dùng trong so sánh (Coates Brat S., 2002) Xem tại trang 34 của tài liệu.
Hình 4.1 Hình dạng và cách mọc bào tử của Beauveria bassiana chụp dƣới kính - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 4.1.

Hình dạng và cách mọc bào tử của Beauveria bassiana chụp dƣới kính Xem tại trang 35 của tài liệu.
Bảng 4.1 Khối lƣợng sợi nấm sau khi nhân trong môi trƣờng lỏng - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Bảng 4.1.

Khối lƣợng sợi nấm sau khi nhân trong môi trƣờng lỏng Xem tại trang 36 của tài liệu.
Qua bảng 4.1 cho thấy tất cả các nguồn nấm thí nghiệm đều có khả năng tạo sợi - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

ua.

bảng 4.1 cho thấy tất cả các nguồn nấm thí nghiệm đều có khả năng tạo sợi Xem tại trang 36 của tài liệu.
Hình 4.3 DNA tổng số ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996. - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 4.3.

DNA tổng số ly trích theo quy trình của Hegedus, 1996 Xem tại trang 37 của tài liệu.
Hình 4.4 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 5 pmol /l - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 4.4.

Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 5 pmol /l Xem tại trang 38 của tài liệu.
Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 3 pmol /l - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 4.5.

Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 3 pmol /l Xem tại trang 39 của tài liệu.
Hình 4.7 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol /l - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 4.7.

Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol /l Xem tại trang 40 của tài liệu.
Hình 4.6 Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol /l - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 4.6.

Sản phẩm PCR với 2 primer ITS4 và ITS5, nồng độ 0,5 pmol /l Xem tại trang 40 của tài liệu.
Hình 4.9 Sản phẩm PCR trƣớc và sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp cắt gel - Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại

Hình 4.9.

Sản phẩm PCR trƣớc và sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp cắt gel Xem tại trang 42 của tài liệu.

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

Tài liệu liên quan