Đang tải... (xem toàn văn)
Giâm cành chè in vitro
CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Đại học Quốc gia Tp.Hồ Chí Minh Trường Đại học Bách Khoa Khoa Công nghệ Hóa học BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC Phúc trình CƠNG NGHỆ TẾ BÀO Đề tài : IN VITRO CBHD Cô : Lê Thị Thuỷ Tiên Sinh viên : Nguyễn Thị Mộng Vân 60802586 Vũ Viết Văn Thưởng 60802199 Lớp : HC08SH Năm học: 2010 _ 2011 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Mục Lục: Mở Đầu Tổng Quan Tài Liệu I II Nguồn gốc chè Phân loại chè Giá trị chè Tình hình sản xuất chè giới Việt Nam Giới thiệu giống chè TB14 Các phương pháp nhân giống chè Cơ sở giâm cành chè Các nghiên cứu in vitro chè Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu I Vật liệu thí nghiệm Phương pháp thí nghiệm II Kết Quả Và Thảo Luận III Hình ảnh q trình ni cấy hom chè Xác định phương pháp, chất khử trùng mẫu, thời gian khử trùng mẫu Kết luận Đề nghị Nghiên Cứu Chiết Xuất Xác Định tác dụng kháng oxy hóa Polyphenol từ chè xanh Việt Nam Giới Thiệu Hợp chất EGCG: Chiết Xuất EGCG: IV Tài Liệu Tham Khảo: CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO I MỞ ĐẦU Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) cơng nghiệp dài ngày có giá trị xuất vai trị quan trọng việc bố trí cấu trồng dân cư nước ta Cây chè có chu kỳ khai thác kinh tế kéo dài 40 – 50 năm 100 năm, mang lại nguồn thu nhập cho nhiều nơng hộ Năm 2006 tổ chức Y tế giới bình chọn: “Thức uống lựa chọn số có lợi cho sức khỏe nước chè” Theo tổ chức FAO (2006), Việt Nam xếp thứ sản lượng thứ khối lượng xuất chè giới Cả nước có khoảng 125000 chè với sản lượng 570000 chè thô 630 sở nhà máy 34 tỉnh thành nước Qua đó, cho thấy việc phát triển mở rộng diện tích chè cao chất lượng chè nguyên liệu để phục vụ xuất cần thiết Chè giao phấn, trồng từ hạt phân ly tính trạng mạnh, làm vườn chè khơng đồng đều, để phát triển vườn chè đồng cho suất cao, phẩm chất tốt, biện pháp khuyến cáo nhân giống vơ tính Biện pháp giâm cành truyền thống dễ áp dụng, có hệ số nhân giống cao.Tuy nhiên, phương pháp giâm cành hom truyền thống làm cho tuổi chung chè cao mang phần tuổi chung từ mẹ làm giảm chu kỳ khai thác kinh tế sau Nếu quy trình giâm cành chè không thực nghiêm ngặt, nguyên liệu giâm cành khơng trẻ hóa mau bị thối hóa Thời gian gần đây, vườn chè cành vườn chè trồng giống Đài Loan chè sinh trưởng có triệu chứng thối hóa Hiện nay, việc nhân giống trồng phương pháp in vitro có xu hướng ngày áp dụng rộng rãi, đạt nhiều kết khả quan Nhân giống in vitro tạo bệnh, phục tráng giống Dựa ứng dụng công nghệ sinh học nhân giống trồng, giâm cành chè in vitro tiến hành Tuy nhiên, nhân giống phương pháp giâm cành chè in vitro phương pháp tương đối Hiện chủ đề nghiên cứu nhà khoa học giới, kết thu hạn chế Việc nghiên cứu phương pháp nhân giống chè in vitro cung cấp phương tiện phục tráng giống chè cành Một số nghiên cứu gần giới có thành cơng bước đầu việc áp dụng biện pháp nhân giống in vitro chè Nguyên nhân lớn hạn chế việc áp dụng phương pháp in vitro chè giai đoạn vô mẫu Do hàm lượng tanin chè cao nên xác định phương pháp khử tanin mẫu thích hợp quan trọng Tuy nhiên, Việt Nam, việc áp dụng phương pháp in vitro để nhân giống chè chưa có kết cơng bố CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nguồn gốc chè Việc xác định nguồn gốc chè nhiều quan điểm khác nguồn gốc chè, dựa sở lịch sử, khảo cổ học thực vật học Trong suốt thời gian dài, dựa vào khác biệt hình thái giống chè Ấn Độ Trung Quốc, nhà thực vật học chấp nhận giả thuyết chè có hai trung tâm khởi nguyên: Trung Quốc Ấn Độ Nhưng theo Hashimoto Shimura, khác biệt chè Ấn Độ chè Trung Quốc không đủ để giữ thuyết nhị nguyên nguồn gốc chè Bởi chè Ấn Độ chè Trung Quốc có số nhiễm sắc thể (2n = 2x = 30) chúng thụ phấn chéo cách tự Một số quan điểm nhiều người chấp nhận là: Theo Daraselia (1989) luận điểm có sở khoa học dựa theo học thuyết“Trung tâm khởi nguyên trồng” Vavilơp chè có nguồn gốc Vân Nam Trung Quốc (trích dẫn Nguyễn Đức Thiết, 2005) Cây chè có nguồn gốc vùng Assam (Ấn Độ) Năm 1823, Bruce phát chè dại to vùng Assam Cây chè có nguồn gốc Việt Nam: Những cơng trình nghiên cứu Djemukhatze (1961 – 1976) phức chất cathesin chè từ nguồn gốc khác nhau, so sánh thành phần chất cathesin loại chè trồng chè mọc hoang dại nêu lên luận điểm tiến hóa sinh hóa chè, sở xác minh nguồn gốc chè Djemukhatze kết luận chè mọc hoang dại Việt Nam tổng hợp chủ yếu (-) – epicathesin (-) – epicathesin galat (chiếm 70% tổng số loại cathesin ), cho phép tới định mới: “Nguồn gốc chè Việt Nam” Tuy có nhiều quan điểm khác chứng minh nguồn gốc đời chè có thống là: Cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng ẩm Phân loại chè Cây chè có tên khoa học Camellia sinensis (L.) O Kuntze Thea sinensis L., thuộc ngành thực vật hạt kín Angiospermae, lớp song tử diệp Dicotyledonae, chè Theales, họ chè Theaceae, chi chè Camellia (Thea), loài sinensis Hiện cách phân loại, cách phân loại chè Cohen Stuart (1919), chia chè làm bốn thứ (varietas): Chè Trung Quốc to (Camellia sinensis var macrophylla Sieb), chè Trung Quốc nhỏ (Camellia sinensis var bohea hay (Camellia sinensis var microphylla), chè Shan (Camellia sinensis var Shan J Wan-Fan) chè Ấn Độ (Camellia sinensis var.assamica (Mast) Choisy) (trích dẫn Võ Thái Dân, 2004) Giá trị chè Chè loại nước uống thông dụng phổ biến nhiều nước giới Hỗn hợp tanin chè có tác dụng làm nguôi khát Cafein số hợp chất ankaloide khác (theobromin, theofinlin, adenine) chè chất có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho thần kinh minh mẫn, kích thích tiêu hóa Trong chè có chứa nhiều vitamin: A, B1, B2, B6, K, PP,… đặc biệt chứa nhiều Vitamin C CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Đây nguồn dinh dưỡng có giá trị cần thiết cho thể Theo Zaprometo, cathesin chè có tác dụng vững cho mao mạch thể người Qua kết nghiên cứu nhà khoa học Nhật Bản chứng minh chè có tác dụng chống phóng xạ chất stronti 90 (Sr-90) đồng vị phóng xạ nguy hiểm Ngoài ra, chè dùng làm chất tạo màu thực phẩm vừa có khả thay chất tạp màu nhân tạo độc hại, có giá trị dinh dưỡng cao Các sản phẩm phụ chè dầu hạt chè sử dụng cơng nghiệp hay làm dầu ăn loại thực phẩm khác Tình hình sản xuất chè giới Việt Nam 4.1 Tình hình sản xuất chè giới Chè trồng tập trung nhiều Châu Á Châu Phi Trên giới chè phát triển với tốc độ nhanh từ kỷ XVIII Trên giới có khoảng 52 nước trồng chè, chiếm 2,7 triệu hecta diện tích đất canh tác nông nghiệp giới, sản lượng hàng năm đạt 2,2 triệu Mặc dù chiếm 16,4% tổng diện tích sản xuất chè giới Ấn Độ nước xuất chè lớn giới với doanh thu hàng năm đạt 66 triệu đôla Mỹ năm.Trong năm qua diện tích chè giới khơng ngừng tăng trưởng bình qn 40.000 ha/năm Theo Mao (1995) diện tích chè giới ổn định vòng 15 năm qua đạt khoảng 2.430.000 Sản lượng chè giới gia tăng trọng đầu tư, nghiên cứu cải thiện Số lượng thống kê FAO diện tích chè giới trình bày bảng 2.1 bảng 2.2 Bảng 2.1 Diện tích chè kinh doanh (ha) số khu vực giới 2000 – 2007 Năm Thế giới Châu Châuphi Châumỹ Châu âu Châu đại dương 2000 2384046 2104580 223544 46982 1540 7400 2001 2415365 2132570 228448 45407 1540 7400 2002 2480092 2183976 242608 44573 1535 7400 2003 2508339 2217087 241190 43526 1536 5000 2004 2601131 2801064 517608 80018 1365 9000 2005 2716075 2980027 532703 80095 1372 9000 2006 2708366 3052297 499438 84452 1265 9000 2007 2805502 3231778 565506 80269 755 9000 (Nguồn: www fao.org, 2009) Về lâu dài, nước sản xuất chè lớn tăng sản lượng kể từ thập niên 80 với tốc độ chậm Hơn nữa, sản lượng thu hoạch khác năm phụ thuộc nhiều vào thời tiết nhiều nhân tố khác Nhìn chung, sản lượng chè dự kiến tăng khoảng 1,9%/năm giai đoạn từ 1999- 2010, cao mức bình quân 1,3%/năm thập kỷ 90 Phần lớn tăng trưởng nhờ gia tăng sản lượng chè xanh Theo ước tính FAO, sản lượng chè đen giới tăng trung bình 1,2 triệu tấn/năm lên 2,4 triệu vào năm 2010, chủ yếu nhờ tăng suất Trong giai đoạn này, dự đoán phần lớn nhà sản xuất chè châu Phi tăng sản lượng đồn điền chè đến tuổi trưởng thành kỹ thuật sản xuất cải thiện Ví dụ sản lượng chè Uganda, Kenya Tanzania dự đoán tăng tương ứng thêm 2,7%, 2,3% 1,7% CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Bảng 2.2 Một số quốc gia có diện tích sản xuất chè (ha) lớn giới năm Ấn độ Trung quốc Sri lanka Kenya Indonesia 2000 490000 898012 188970 120390 121200 2001 504000 905662 188970 124290 115416 2002 510000 913100 210620 131450 115803 2003 516000 943400 210620 131450 116200 2004 520000 989262 212720 136700 116200 2005 521000 1058564 212720 141300 142847 2006 523000 1116740 212720 147080 111055 2007 558000 1165732 212720 149190 110524 (Nguồn: www fao.org, 2009) Tại châu Á, sản lượng chè Ấn Độ ước tăng bình quân 2,5%/năm năm 2010 Trong thập kỷ này, tỉ trọng Ấn Độ tổng sản lượng chè giới tăng từ 38% lên 44% Sản lượng chè Inđônêxia Sri Lanka ước tăng 1,1% 1,7% Tuy nhiên, sản lượng chè đen Trung Quốc tiếp tục giảm (khoảng 1,7%/năm) nước tập trung sản xuất loại chè khác Đến 2010, dự đoán ba nước sản xuất chè đen lớn giới Ấn Độ, Kyena Sri Lanka chiếm 70% sản lượng chè toàn cầu, tăng so với 63% năm 2000 Chè xanh chủ yếu sản xuất Trung Quốc (chiếm 73% sản lượng giới năm 2000), Nhật Bản (13%), Việt Nam (6%) Inđônêxia (6%) Phần lớn chè xanh tiêu thụ nước sản xuất (như Trung Quốc Nhật Bản) Khối lượng xuất thấp, khoảng 27% Trong năm 2001, nhập chè xanh giới đạt tổng cộng 187.000 tấn, 17% lượng chè đen nhập Theo ước tính FAO, sản lượng chè xanh giới tăng bình quân 2,6%/năm năm 2010, cao gấp lần tỉ lệ tăng trưởng chè đen đạt 900.000 Trong đó, sản lượng chè xanh Trung Quốc tăng nhiều (2,7%/năm), tiếp đến Việt Nam (2,5%), Inđônêxia (2,3%) cuối Nhật Bản (0,1%/năm) Đến năm 2010, Trung Quốc chiếm tới 75% sản lượng chè giới 4.1 Tình hình sản xuất chè Việt Nam Việt Nam xác định tám địa điểm cội nguồn chè, có điều kiện địa hình, đất đai, khí hậu phù hợp cho sinh trưởng phát triển chè đứng thứ năm giới sản lượng xuất chè Sản phẩm chè Việt Nam có mặt 110 quốc gia vùng lãnh thổ, “CheViet” đăng ký bảo hộ 70 thị trường (Hiệp hội Chè Việt Nam, 2009) Năm 2004, tồn quốc có 108.000 chè, đạt suất 513,8 nghìn (chè tươi) có 85% diện tích trồng giống chè địa phương có suất chất lượng thấp nên chất lượng chè Việt Nam đạt mức trung bình yếu giới (Báo cáo ngành chè năm 2004) CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Bảng 2.3 Biến động diện tích, suất sản lượng chè Việt Nam từ 2000- 2007 Năm Diện tích(ha) Năng suất (kg chè khơ/năm/ha) Sản lượng (tấn/năm) 2000 70300 9943 69900 2001 80000 9462 75700 2202 98000 9612 94200 2003 86100 12113 104300 2004 120800 9892 119500 2005 122500 10818 132525 2006 102100 14789 151000 2007 106500 15399 164000 (Nguồn: www fao.org, 2009) Hiện nay, nước ta có năm vùng sản suất chè bao gồm: Vùng chè miền núi Tây Bắc: gồm Sơn La, Lai Châu hai tỉnh trồng chè lớn, giống chè trồng chủ yếu Shan Trung Du Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn: gồm tỉnh Hà Giang, Tun Quang, n Bái, Hịa Bình, Lào Cai, giống chè chủ yếu Shan, Trung du, Assam Vùng chè Trung du – Bắc Bộ: Bao gồm Thái Nguyên, Bắc Cạn, Phú Thọ, Yên Bái, Hà Tây, giống chủ yếu trồng chủ yếu Trung Du, Assam chè lai Vùng chè Bắc Trung Bộ: gồm tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, giống trồng chu yếu chè Gay địa phương chè Assam Vùng chè Miền Nam: chủ yếu trồng vùng Tây Nguyên Lâm Đồng, Gia Lai, Kontum Đắc Lắc, giống trồng chủ yếu chè Shan Việt Nam trở thành thành viên thức Tổ chức thương mại giới (WTO) từ tháng 1/2007 Nền nơng nghiệp nói chung, ngành chè nói riêng bước vào q trình hội nhập đối mặt với thách thức lớn cải thiện chất lượng sản phẩm, tiếp cận thị trường mới, bối cảnh buộc phải thực biện pháp ngặt nghèo nước khác kiểm dịch động thực vật, an tồn thực phẩm, sở hữu trí tuệ rào cản kỹ thuật thương mại Năm 2006, chè Việt Nam đứng vị trí thứ diện tích, thứ sản lượng thứ lượng xuất số gần 40 nước sản xuất 30 nước xuất chính, xem kỷ lục sản lượng giá trị xuất mà trước chưa có Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn năm 2009, diện tích trồng chè Việt Nam đạt 131,5 nghìn tăng 1.900 so với diện tích năm 2007 Năng suất trồng chè năm 2009 dự kiến đạt 6,5 búp tươi/ha, tăng so với mức 5,9 tấn/ha năm 2007 (Vinanet, 2009) Song, chè Việt Nam số nước cảnh báo dư lượng thuốc bảo vệ thực vật thực phẩm Chính vậy, vấn đề sản xuất chè an toàn, chất lượng, bền vững, an toàn cho sức khỏe người, bảo vệ môi trường phát triển nông nghiệp bền vững nghành chè tâm thực Giới thiệu giống chè TB14 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Là giống chè Shan Trấn Ninh người Pháp bình tuyển Blao từ tập đoàn so sánh giống Trung tâm thực nghiệm nông nghiệp Bảo Lộc từ năm 1952 Hiện giống chủ lực nghành chè Lâm Đồng chiếm 80% diện tích (Trung tâm nghiên cứu chuyển giao kĩ thuật công nghiệp ăn Lâm Đồng, 2008) Giống chè TB14 có màu xanh nhạt, hình thon dài, dài từ 10 – 15 cm, rộng – 4,5 cm, có 12 đơi gân Mép có cưa kéo dài đến chóp Góc lớn, tơm có nhiều lơng tơ trắng mịn, khả phân cành mạnh, suất đạt từ 18 – 20 tấn/ha/năm Chất lượng chè phù hợp với chế biến hương nội tiêu chè đen Hiện giống chè cành chủ lực Lâm Đồng Các phương pháp nhân giống chè 6.1 Nhân giống hạt Đây phương pháp nhân giống chè áp dụng từ ngành chè Việt Nam phát triển Hiện phát triển ngành chè khuyến cáo không nên sử dụng chè giao phấn nên vườn chè trồng hạt có phân ly lớn hình thái, đặc tính sinh trưởng, suất, phẩm chất giảm không ổn, áp dụng công tác chọn tạo giống trung tâm nghiên cứu Ưu điểm – Đơn giản, dễ làm giá thành thấp – Chi phí lao động thấp – Tuổi thọ chè cao – Cây có khả thích ứng rộng nhiều địa hình Nhược điểm – Cây chè khơng giữ đặc tính mẹ, quần thể chè không đồng đều, suất chè không cao, chất lượng phẩm chất không ổn định – Hạt chè dễ sức nảy mầm khó bảo quản lâu Thời vụ gieo hạt chủ yếu phụ thuộc vào mùa chín thường gieo vào đầu tháng 10 đến hết tháng 11 Số lượng hạt gieo cho hecta 200 – 250 kg tương đương 400 – 500 kg Do hệ số nhân giống thấp Theo Đỗ Ngọc Quý ctv (1978) hecta chè để giống trồng bốn hecta 6.2 Nhân giống phương pháp chiết cành Chiết cành chè tiến hành mẹ, hàng năm cành chiết khơng thu hái, sau tiến hành chiết hai cách: Cách 1: Uốn cành sát đất, lấy đất vùi phần cành, phần bị lấp đất mọc rễ Cách 2: Đắp đất vào toàn gốc cao đến tận cành, phần cành bị lấp mọc rễ Khi cành chè có rễ phát triển tốt tiến hành chặt đứt phần tiếp giáp với mẹ bứng cành đưa trồng Ưu điểm – Cây mau cho thu hoạch búp, rút ngắn thời gian kiến thiết – Cành chiết đem trồng có tỷ lệ sống cao Nhược điểm – Phương pháp chiết cành có hệ số nhân giống thấp chè mẹ 10 – 15 – Tốn nhiều nhân công nên không phổ biến rộng rãi sản xuất 6.3 Nhân giống ghép giai đoạn vườn ươm CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Chè giao phấn trồng chè hạt làm chè dễ bị thối hóa lẫn tạp, suất khơng ổn định, chè trồng hạt có rễ phát triển tốt ăn sâu, chịu hạn tốt Mặt khác, chè trồng cành cho suất cao chè trồng hạt từ 33 – 45 % tùy giống (kết nghiên cứu Trường Đại Học Nông Nghiêp I Hà Nội), rễ chè cành phát triển nông chịu hạn Tháng – 1999 Trung tâm Nghiên cứu chuyển giao kỹ thuật Công nghiệp Ăn Quả Lâm Đồng tiến hành nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo chè ghép Cây chè ghép tạo thành cách kết hợp hai cá thể, chè trồng hạt làm gốc ghép chè cành làm cành ghép Cành ghép lấy từ chè giống nội địa nhập nội có suất phẩm chất cao, dễ canh tác chăm sóc Ưu điểm: – Sản lượng chất lượng chè cao chè hạt – Cây đồng – Cây chè ghép có khả chống chịu tốt tuổi thọ cao, dễ chăm sóc Nhược điểm: – Chi phí cao, địi hỏi kỹ thuật thao tác ghép, thời vụ ghép 6.4 Nhân giống phương pháp giâm cành Hiện nay, giâm cành chè phương pháp nhân giống phổ biến giới Giâm cành chè nghiên cứu Trung Quốc từ năm 1900, Ấn Độ 1911, Gruzia năm 1928, Srilanka năm 1938 Ở nước ta, miền Bắc bắt đầu nghiên cứu ứng dụng năm 1962, miền Nam năm 1952 (Đỗ Ngọc Quỹ ctv, 1997) Ưu điểm: – Có hệ số nhân giống cao, cung cấp đồng thời số lượng giống lớn, tránh khó khăn thiếu giống trồng Một hecta chè để giống đem giâm cành trồng 30 – 70 hecta (Lê Tất Khương ctv 1999) Số liệu từ Viện nghiên cứu chè Phú Hộ cho thấy từ hecta vườn chè giống bốn tuổi cung cấp khoảng ba triệu hom, đủ cho trồng 50 hecta trồng hai cây/hố, 80 hecta trồng cây/hố – Tạo vườn chè đồng với đặc tính tốt mẹ, thuận lợi cho đầu tư thâm canh, giới hóa, cho suất cao, nguyên liệu đồng giúp chế biến chè có chất lượng tốt ổn định – Rút ngắn thời gian kiến thiết Thời gian cho thu hái nhanh khoảng hai đến ba năm (Viện nghiên cứu chè, 2000) Nhược điểm: – Phải qua giai đoạn vườn ươm – Đòi hỏi phải có kỹ thuật khâu giâm cành, chăm sóc, quản lý vườn ươm tỉ mỉ, tốn nhiều công lao động – Khối lượng vận chuyển trồng đồng lớn – Giá thành cao, làm tăng đáng kể chi phí trồng mới, chi phí cao trồng hạt từ sáu đến tám lần (Viện nghiên cứu chè, 2000) – Trong thời gian kiến thiết bản, khả chịu hạn 6.5 Nhân giống phương pháp nuôi cấy mô Hiện nay, nhân giống chè phương pháp nuôi mô hướng nghiên cứu Theo Willson Clifford (1992), tiến gần nghiên cứu tế bào nuôi cấy mô mở hội cho khơng việc nhân nhanh chóng vật liệu nhân giống, cho việc sử dụng quy luật di truyền, sinh lý học sinh hóa học vào việc phát triển dòng chè đặc trưng Đối với nước trồng chè tiếng giới như: Ấn Độ, Trung CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Quốc, Nhật Bản, Kenya, Đài Loan…đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật chè thu số thành tựu bước đầu việc chuẩn hóa quy trình ni cấy, môi trường nuôi cấy mô chè Ưu điểm: – Tạo đồng giống mẹ Phần giống nhân giống vơ tính Đối với trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo phần lớn loài ăn trái, sinh từ hạt khơng hồn tồn đồng nhất, khơng giống mẹ, trường hợp nhân giống vơ tính có lợi điểm nhân giống qua hạt – So với kiểu nhân giống vơ tính thơng thường (chiết cành, hom), nhân giống ni cấy mơ có ưu điểm nhân số lượng lớn từ cá thể ban đầu thời gian ngắn – Có thể tạo bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu cách chặt chẽ làm cho vật liệu ban đầu trở nên bệnh Khơng chiếm nhiều diện tích, khơng bị ảnh hưởng thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống quý nhân nhanh chóng để đưa vào sản xuất Việc trao đổi giống dễ dàng – Phục tráng giống Nhược điểm: – Đòi hỏi kỹ thuật cao – Chi phí cao 6.6 Nhân giống phương pháp giâm cành in vitro Đây phương pháp nhân giống dựa kế thừa phương pháp giâm cành truyền thống nuôi cấy mô Bằng cách sử dụng hom chè mang mầm nách qua khử trùng giâm mơi trường dinh dưỡng có chứa chất kích thích sinh trưởng Hom chè kích thích cho tăng trưởng tạo rễ tạo chồi trực tiếp từ hom chè, không qua giai đoạn tạo cụm chồi cấy chuyền Từ hom chè ban đầu qua giâm cành tạo thành phát triển hoàn chỉnh rễ thân lá, tiến hành trồng đất Ưu điểm – Làm cho sinh trưởng tốt, làm trẻ lại nhiễm bệnh – Giữ nguyên đặc tính mẹ, có ý nghĩa cơng tác phục tráng giống nhân giống chè – Hệ số nhân giống cao – Có thể tiến hành nhân giống quanh năm, rút ngắn thời gian nhân giống – Tuổi chung chè tạo từ giâm cành in vitro nhỏ tuổi chung chè tạo từ giâm cành truyền thống Nhược điểm – Chi phí tốn – Kỹ thuật giâm cành chè in vitro giai đoạn thử nghiệm phịng thí nghiệm – Chưa tìm chất khử trùng thời gian khử trùng thích hợp cho hom chè lấy trực tiếp từ đồng ruộng – Trong chè hàm lượng tanin cao, gây khó khăn lớn việc khử trùng mẫu, hóa nâu mơi trường tanin mẫu tiết làm hóa nâu mơi trường làm hom chè dễ bị chết hoại 2.7 Cơ sở giâm cành chè 7.1 Cơ sở hình thành callus rễ 10 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO chồi bên auxin vận chuyển từ xuống Kích thích hình thành rễ Kích thích hình thành quả, lớn quả, tạo nên đơn tính khơng hạt kìm hãm rụng lá, hoa, Tạo phôi nuôi cấy huyền phù Các phản ứng auxin tăng trưởng có liên quan với vơ số q trình sinh lý, trao đổi chất khác Phản ứng chủ yếu nhanh chóng việc xử lý auxin làm tăng độ kéo dài tế bào, điều xảy vài phút sau xử lý Một đặc trưng quan trọng vách tế bào, vị trí quan trọng chịu tác động chất điều hoà sinh trưởng thực vật (Torry ctv.,1981) Auxin làm giảm pH kích thích xuất proton H+, pH hoạt hoá enzyme tác động nới lỏng vách tế bào enzyme tổng hợp vách tế bào, nhờ khởi động q trình giãn nở tế bào (Prat, 1993) Auxin hoạt hoá sinh tổng hợp hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin,…) ngăn cản phân giải chúng (Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lượng, 2002) 8.2 Cytokinin Cytokinin hình thành chủ yếu hệ thống rễ thực vật Ngoài ra, số quan cịn non sinh trưởng mạnh có khả tổng hợp cytokinin chồi, non, non, tầng phát sinh Đây chất hoạt hoá phân chia tế bào, đồng thời làm tăng trình chuyển hoá acid nucleic protein (Vũ Văn Vụ, 2003) Cytokinin sử dụng nhiều kỹ thuật nuôi cấy mô Đặc điểm cytokinin Cytokinin vận chuyển khơng phân cực auxin, hướng hướng gốc Cytokinin dạng liên kết dạng tự phytohormone khác Ở chúng bị phân giải enzyme, tạo nên sản phẩm cuối ure Các cytokinin thường dùng nuôi cấy mô: kinetin, BA TDZ Chức cytokinin Vai trò sinh lý đặc trưng cytokinin thực vật kích thích phân chia mạnh mẽ tế bào Ảnh hưởng lên hình thành phân hố quan đặc biệt phân hố chồi Kìm hãm q trình hố già quan tồn cây, kìm hãm phân huỷ diệp lục, protein acid nucleic Phá vỡ trạng thái ngủ hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng nở hoa Điều chỉnh tượng ưu Ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý có ảnh hưởng đến q trình trao đổi chất Cytokinin gây nên hình thành chồi mầm nhiều mô gồm mô sẹo sinh trưởng mô nuôi cấy, hay việc tạo thành mô bướu gỗ lâu năm (Nester ctv., 1985; Taiz ctv., 1991) Vai trị cytokinin kích thích tạo chồi Cytokinin có hiệu vai trị kích thích tạo chồi trực tiếp gián tiếp thực vật nguyên vẹn mô thực vật ni cấy in vitro Một tỷ lệ thích hợp auxin cytokinin có hiệu phát sinh hình thái mẫu cấy Để tăng sinh chồi bên, nồng độ cytokinin cao kích thích hình thành nhiều chồi nhỏ chồi kéo dài, làm cho bị biến dạng làm cho chồi có nhiều nước Để kích thích tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy gián tiếp qua tạo mô sẹo người ta thường phối hợp cytokinin với auxin Nồng độ cytokinin cao (0,5 – 10,0 mg/l) thường cản làm chậm tạo rễ (Schraudolf Reinert, 1959; Harris Hart, 1964; Ben Jaacov ctv., 1991; Humphries, 1960; trích Vũ Văn Vụ, 2003) Tùy vào loại trồng mục đích sử dụng để kết hợp hợp lý nồng độ axin cytokinin Các nghiên cứu in vitro chè 9.1 Chất khử trùng mẫu 12 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Theo Debergh Vanderschaeghe (1988), mẫu chè lấy trực tiếp từ đồng ruộng bị nhiễm bẩn nhiều nguồn khác tùy theo quan phận, nguyên nhân chủ yếu gây tổn thất nhân giống chè phương pháp nuôi cấy mô Thông thường mẫu cấy lấy từ phát triển sàng lọc, bảo vệ từ ruộng thí nghiệm Theo Sandal ctv (2001), tiến hành rửa hom chè Tween 20 15 phút, sau khử trùng bề mặt hom chè thủy ngân clorua 0,04% phút rửa mẫu nước cất vô trùng Mondal ctv (1998) tiến hành khử trùng bề mặt hạt chè Natri clorua 4% 10 phút, sau rửa hạt nước cất vô trùng Sharma ctv (1999) tiến hành khử trùng mẫu hom chè có mang hai đốt Streptomycin sulphate 0,001% 10 – 15 phút, sau khử trùng thủy ngân clorua 0,04% – phút rửa nước cất từ – lần Ogutaga Northcote (1970) dùng đoạn thân chè dài -15 mm trồng nhà kính khử trùng bề mặt với cồn 70 o sau khử trùng mẫu dung dịch natri hypoclorit 7% Kato (1985, 1989) dùng đoạn thân chè có từ – từ chè trồng nhà kính (giống Yabukira) khử trùng mẫu Canxi hypoclorit 7% 20 phút Arulpragasam Latiff (1986) tách bỏ có cuống nằm sát thân cách cẩn thận tránh gây hại cho mầm nách Sau khử trùng bề mặt dung dịch clo 10 – 15% 15 phút lắc mẫu liên tục sau rửa nước cất cấy vào môi trường Karanuki Shibata (1993) làm giảm vi khuẩn nội sinh có mẫu cách lấy mẫu cấy mô phân sinh mầm non với kích thước 0,5 mm Theo Nakamura (1989) tỉ lệ nhiễm mẫu phụ thuộc theo mùa Để làm giảm nấm ta thu thập, lấy mẫu vào đầu mùa nhiệt độ khơng khí tương đối thấp chọn trưởng thành khỏe mạnh Haldeman ctv (1987) biện pháp quan trọng để làm giảm vi khuẩn nấm, không gây độc cho mẫu benomyl (1, 2, g/l) rifampicin (10, 25, 50 mg/l) Das Barman (1988) xử lý mẫu Streptomycin sulfate 1% ngăn chặn tái nhiễm mẫu thí nghiệm Rajacumar Ayyappan (1992); Rajashekaran Mohankumar (1992); Jha Sen (1992); Agarwal ctv (1992) dùng dung dịch thủy ngân clorua 0,05 – 1,0% khử trùng bề mặt mẫu mẫu thí nghiệm 9.2 Môi trường vật liệu vô trùng mẫu Murashige Skoog (1962) cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu bước tiến kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường MS họ dùng làm sở cho việc nuôi cấy nhiều loại có áp dụng phổ biến chè Theo Sandal ctv (2001) thực vô trùng mẫu hom chè, Camellia sinensis (L) O Kuntze, 30 năm tuổi tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm tiến hành bình tam giác 250ml có bổ sung 100ml môi trường MS với 0,8% agar bổ sung thêm BA (8,88µM), IBA (0,98µM) 3% đường Mondal ctv (1998), tiến hành vô trùng mẫu hạt chè Camellia sinensis (L) O Kuntze cách cho hạt nảy mầm môi trường 1/2 MS bổ sung sucrose 30g/l agar 8g/l (Qualigens, Bombay) tạo ống nghiệm sau 60 ngày làm vật liệu cho vi nhân giống chè Sharma ctv (1999) vô trùng mẫu hom chè Camellia sinensis (L.) var China hybrid môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l agar g/l (Qualigens, Bombay) Theo Nguyễn Thanh Mai Nguyễn Sĩ Tuấn (2005), q trình vơ trùng mẫu hom chè Camellia sinensis (L.) var Oo-Long tiến hành erlen 100ml có bổ sung 20 ml môi trường MS, agar 8g/l, TDZ 1mg/l, sucrose 30g/l 13 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 9.3 Môi trường tạo chồi Sandal ctv (2001) tiến hành cắt khúc hom chè tạo thành từ vật liệu vơ trùng mẫu, có chiều dài từ 0,5 – 1,0 cm đem cấy vào môi trường MS lỏng lắc, lỏng tĩnh môi trường đặc với TDZ (2,5 µM, 5,0 µM, 10,0 µM) BA (4,4 µM, 8,8 µM, 17,7 µM) Thể tích mơi trường ni cấy chứa bình tam giác 250ml 10ml, 20ml, 50ml Kết thu sau: Sự nhân chồi chè tốt môi trường MS lỏng tĩnh với nồng độ TDZ 2,5 – 5,0 µM, thể tích mơi trường chứa bình tam giác 250ml phù hợp cho tái sinh chồi 20ml Thời gian cấy chuyền từ – tuần phịng thí nghiệm tiết kiệm giá thành sản xuất có hiệu so với phương pháp tạo protocols vi nhân giống chè môi trường đặc với tuần lần cấy chuyền Trong thí nghiệm TDZ cytokinin làm giảm tỉ lệ chết hoại mẫu cấy tái sinh chồi chè môi trường lỏng tốt BA (Mok ctv 1982; Huetteman Preece, 1993) Mondal ctv (1998), từ mọc ống nghiệm vô trùng mẫu sau 60 ngày gieo cắt thành hom có chiều dài cm Tiến hành ni cấy hai môi trường WPM môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l agar 0,8g/l Nồng độ TDZ (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với nồng độ NAA (5µM, 10 µM, 15 µM) BAP (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với IBA(5µM, 10 µM, 15 µM) BAP (5µM, 10 µM, 15 µM) kết hợp với NAA 5µM Kết thu với nồng độ 5µM TDZ 10µM NAA thu (98%) mẫu cảm ứng tạo chồi, chồi kéo dài Cảm ứng tạo chồi 5µM NAA với 10µM BAP (77,9%) 5µM IBA với 5µM BAP (84,8%) Mặc dù tỉ lệ cảm ứng tạo mô sẹo BAP tương đối cao sau 2- lần cấy chuyền mẫu bị hóa nâu chết hoại TDZ tỏ phù hợp việc nhân nhanh tái tạo chồi chè Mơi trường MS đặc thích hợp mơi trường WPM đặc Sandal ctv (2000) tiến hành nuôi cấy mô chè cách tạo mô sẹo từ mắt mầm điều kiện có ánh sáng mơi trường MS lỏng tĩnh có thêm chất điều hồ sinh trưởng TDZ IBA Trên giống chè Camellia sinensis var TV-1, T-78, UPASI-9 KangraJat Sood ctv (1993) Nuôi cấy chè tạo từ protocols nuôi cấy mô phương pháp vi nhân giống chè môi trường MS + IBA (0,98 µM) + BA( 8,88 µM) giống chè Camellia sinensis var Kangra Jat môi trường lỏng tĩnh, môi trường lỏng Tahardi (1994), nhân giống chè ống nghiệm mơi trường WP có GA3 thu 30% tỉ lệ tạo chồi Trần Hoài Khải (2002), tiến hành tạo mô sẹo thu môi trường MS + 100ml nước dừa + 3mg BA + 50mg adenin sulfate môi trường MS + 100ml nước dừa + 5mg BA + mg NAA tỏ thích hợp nuôi cấy mô chè Nguyễn Thanh Mai Nguyễn Sĩ Tuấn (2005) từ cành chè hình thành từ q trình vơ trùng mẫu cắt thứ ba tính từ đỉnh xuống cắt thành mẫu cấy – 10 mm dùng làm vật liệu thí nghiệm Các phản ứng phát sinh hình thái mơ thử nghiệm mơi trường MS1 có bổ sung 30g/l sucrose nồng độ IBA (0,05; 0,1; 0,5 mg/l) BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) Các mô sẹo hình thành sau 20 ngày ni cấy mơi trường MS1 chuyển sang mơi trường MS2 có bổ sung nồng độ ABA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) tổ hợp BA IBA để tái sinh chồi Kết thu được: Sau 14 ngày nuôi cấy tất nồng độ mô sẹo cảm ứng thứ tính từ xuống với kích thước – mm Các phát thể chồi bất định phát triển từ mô giai đọan nuôi cấy kéo dài tuần tốt mơi trường có bổ sung IBA 0,05 mg/l, BA 2,0 mg/l, ABA 1,0 mg/l Các thể chồi phát triển từ mô sẹo ABA thêm vào môi trường nhằm gây ức chế tăng sinh khối mơ sẹo kích thích phát thể chồi khối mơ sẹo 9.4 Môi trường tạo rễ Sandal ctv (2001) tiến hành cắt chồi chè có chiều dài cm hình thành q trình ni cấy mơ nhúng vào dung dịch IBA 4,92 µM 30 phút, sau 14 CƠNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO chuyển sang khay chứa tỉ lệ cát: đất: 2: điều kiện trồng phịng thí nghiệm Sau 60 ngày chồi mọc rễ chuyển sang chậu để nhà kính Nguyễn Thanh Mai, Nguyễn Sĩ Tuấn (2005) từ chồi tái sinh q trình ni cấy chuyển sang mơi trường MS có bổ sung 3mg/l 1g/l than hoạt tính mơi trường IBA 5mg/l khơng có agar Kết sau tuần ni cấy rễ bất định hình thành 10.5 Hạn chế hoại mẫu Hàm lượng phenol chè cao, tiết môi trường từ vết cắt mẫu cấy trải qua q trình oxy hóa trở thành chất độc cho mẫu cấy Những chất độc giảm cách hạ thấp pH môi trường nuôi cấy Sarwar (1985) thử bỏ số chất hóa học khác vào môi trường acid ascorbic, catechol, l-cystein, phloroglucinol, phenyl-thiourea, polyvilyl-pyrolidone- 10, natri diethyl dithio-carbonat, natri flouride thioure với nồng độ khác mơi trường muối khống MS Ơng tìm nồng độ cao để ngăn chặn hóa nâu mẫu MS 1/20 Pandidurai ctv (1996) báo cáo thành công việc cấy chuyển mẫu cấy sang môi trường định kỳ ngăn chặn tốt q trình hóa nâu mẫu Trần Hoài Khải (2002), tiến hành khử tanin chè lòng trắng trứng thu dấu hiệu khả quan biện pháp khử tanin, thời gian khử tốt 120 phút thu từ 30 - 40% mô sẹo Từ sở lý luận làm cở sở cho thí nghiệm thử nghiệm quy trình giâm cành chè in vitro III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu thí nghiệm 15 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 1.1 Đối tượng thí nghiệm Hom chè (VD nước ta hom chè TB14 lấy từ Trung tâm Nghiên cứu Chuyển giao kỹ thuật công nghiệp ăn Lâm Đồng) 1.2 Trang thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu 1.2.1 Phòng chuẩn bị giữ môi trường dinh dưỡng Dùng để chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường giâm dụng cụ để giâm bảo quản dung dịch mẹ Trang thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, kệ đặt bình Dụng cụ: Pen, kéo, dao, ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, đèn cồn 1.2.2 Phịng tiến hành ni cấy Phòng sử dụng để tiến hành thao tác giâm cành điều kiện vơ trùng, phịng gồm hai lớp cửa kiếng để hạn chế bụi, kín gió ngăn cản côn trùng Thiết bị gồm: tủ cấy, đèn UV, dụng cụ nuôi cấy hấp vô trùng, giá để mơi trường 1.2.3 Phịng bảo quản ni mẫu Tạo điều kiện thích hợp giúp cành giâm phát triển Thiết bị gồm có: kệ, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, ẩm kế, máy điều hoà nhiệt độ Điều kiện bảo quản: pH môi trường = 5,8, nhiệt độ 23 – 27 0C, chu kì chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 16 1.2.4 Các vật liệu nghiên cứu Dung dịch khử trùng mẫu: Sử dụng dung dịch khử trùng mẫu: Cồn 700, nước cất vô trùng, xà phòng, nước javen Chất điều hòa sinh trưởng, than hoạt tính, nước dừa, agar Mơi trường cấy môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) với thành phần trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Thành phần môi trường MS( Murashige Skoog): Tên Thành phần: Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lượng: NH4NO3 KNO3 CaCL2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO 1650 1900 440 370 170 Khoáng vi lượng: MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCL2.6H2O Na2EDTA FeSO4.7H2O 16.9 8.6 6.2 0.83 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 Vitamin vaø Amino acid: Thiamine HCL Myo-Inositol Pyridoxine HCL Glycine Nicotinic Acide 0.1 100 0.5 0.5 16 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Chất khác GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Đường Agar 30 g/l 8.5 g/l Phương pháp thí nghiệm Mơ tả quy trình thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành nhằm mục tiêu tạo mắt mầm thứ tính từ búp, quy trình thí nghiệm tiến hành qua bước sau: Bước 1: Lấy mẫu:Cắt cành chè có búp sinh trưởng bình thường, khơng bị sâu bệnh hại, gồm - thật, gói giấy báo túi nilông giữ cho mẫu tươi không bị héo mang phịng thí nghiệm Nhiều nghiên cứu cho mầm nách thật thứ thứ hai chưa phân hóa hồn chỉnh nên bị tác động tuổi Vì chọn hom chè thật thứ hai tính từ tôm để làm vật liệu tiến hành giâm cành Từ đoạn cành chè non gồm tôm ba thật Dùng kéo cắt bỏ để lại cuống lá, lấy đoạn hom vị trí thật thứ hai, để chừa lại đốt phía đốt phía dưới, hom có chiều dài từ - cm Hình 3.1 Hom chè sau bước Bước 2: Xử lý hom chè: Hom chè rửa vịi nước, sau đem ngâm nước xà phịng lỗng hai phút, dùng bơng thấm nước xà phòng rửa kĩ mẫu, nhẹ nhàng tránh làm dập gây tổn thương cho mẫu Dùng ngón tay chèn vòi nước cho dòng chảy thành tia, xịt vào mẫu để rửa trôi bào tử nấm bám mẫu Sau để vịi nước chảy tràn nhẹ – phút 17 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Hình 3.2 Hình ảnh hom chè khử trùng mẫu A: có lắc B: khơng lắc Hom chè đựng bình tam giác 350 ml hấp vô trùng, đem vào phịng giâm vơ trùng tiến hành khử trùng mẫu dung dịch khử trùng Canxi hypoclorit, nước javen với nồng độ thời gian thích hợp, vớt mẫu rửa từ – lần nước cất vô trùng, tiếp tục bỏ mẫu vào ngâm cồn 700 vòng 30 giây vớt rửa nước cất vô trùng từ 2-3 lần Đến khâu khử trùng mẫu hoàn tất Bước 3: Tiến hành giâm cành: Dùng giấy thấm hấp vô trùng thấm cho khô hom mẫu, dùng dao sắc cắt hai đầu hom khoảng – cm cuống 0,2 – 0,3 cm tránh làm hư hại đến mầm Sau tiến hành cắm vào môi trường, chai nước biển cắm hom Thao tác giâm cành phải nhanh để hạn chế tiếp xúc hom chè với khơng khí làm đen hom chè, tiến hành điều kiện vô trùng lửa đèn cồn Bước 4: Bảo quản mẫu: Mẫu chè giâm xong chuyển qua phòng bảo quản nhiệt 23 – 27 0C, chu kì chiếu sáng 2000 Lux, thời gian chiếu sáng 16 h Môi trường giâm cành chuẩn bị trước chai nước biển 100 ml, 200 ml, 500 ml dùng để chứa môi trường IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Hình ảnh trình ni cấy hom chè 1.1.Hom chè sau khử trùng 18 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 19 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Hình 4.1: Hom chè sau khử trùng A: Hom chè chết hoại, mơi trường hóa nâu B: Hom chè thối mầm nách C: Hom chè nhiễm khuẩn D: Hom chè chết hoại thân có màu xanh E: Hom chè nhiễm nấm F: Hom chè chết hoại G: Hom chè 1.2.Hom chè không phát động mầm 20 ... GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO 19 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Hình 4.1: Hom chè sau khử trùng A: Hom chè chết hoại, môi trường hóa nâu B: Hom chè thối mầm nách C: Hom chè nhiễm khuẩn D: Hom chè. .. gian nhân giống – Tuổi chung chè tạo từ giâm cành in vitro nhỏ tuổi chung chè tạo từ giâm cành truyền thống Nhược điểm – Chi phí tốn – Kỹ thuật giâm cành chè in vitro giai đoạn thử nghiệm phịng... 0.025 0.025 37.3 27.8 Vitamin vaø Amino acid: Thiamine HCL Myo-Inositol Pyridoxine HCL Glycine Nicotinic Acide 0.1 100 0.5 0.5 16 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO Chất khác GIÂM CÀNH CHÈ IN VITRO Đường Agar 30 g/l