MỞ ĐẦU  LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thuốc (Nicotiana tabacum L.) cơng nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia giới Việc trồng sản xuất thuốc góp phần tạo công ăn việc làm thu nhập cho nhiều đối tƣợng lao động Ngồi ra, thuốc cịn đƣợc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt Hơn nữa, với khả dễ tái sinh chấp nhận gene ngoại lai tốt, thuốc cịn đƣợc xem mơ hình nhiều nghiên cứu sinh học nhƣ: nghiên cứu trình trao đổi chất thực vật; nghiên cứu vai trò, chức gene protein nhƣ làm đối tƣợng để tiếp nhận gene ngoại lai Thuốc trồng mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại, đặc biệt bệnh virus gây nên Cho tới nay, 2000 loại virus gây hại thực vật đƣợc phát nghiên cứu, có nhiều lồi gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới suất chất lƣợng trồng nhƣ: bệnh khảm chủ yếu Tobaco mosaic virus (TMV) Cucumber mosaic virus (CMV) gây nên; bệnh xoăn đọt vàng lá, héo virus héo đốm cà chua Tomato spotted wilt (TSWV) Tomato yellow leaf curved virus (TYLCV) gây nên Các virus gây thiệt hại nghiêm trọng tới suất trồng lên tới 95% chí 100%, làm ảnh hƣởng lớn tới kinh tế nhiều quốc gia có Việt Nam [3] Bệnh virus gây khơng có biện pháp diệt trừ mà phịng bệnh Các biện pháp truyền thống đƣợc áp dụng để phòng ngừa, hạn chế lây lan virus nhƣ: loại bỏ bị bệnh phát hiện, trồng luân canh trồng, vệ sinh đồng ruộng không mang lại hiệu cao mà cịn địi hỏi nhiều thời gian, cơng sức ảnh hƣởng xấu tới mơi trƣờng Việc tìm biện pháp để ngăn chặn phát triển lây lan virus thực vật vấn cấp bách Cùng với phát triển công nghệ sinh học, có nhiều ứng dụng sinh học phân tử chọn tạo giống trồng kháng virus, đó, cơng nghệ RNA interference (RNAi) giải pháp hữu hiệu thông qua việc sử dụng vật liệu di truyền từ virus gây bệnh nhƣ gene mã hóa protein vỏ (coat protein, CP), protein di chuyển (movement protein, MP) để chuyển vào trồng tạo trồng chuyển gene kháng lại virus Đã có nhiều nghiên cứu thành công việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo giống trồng chuyển gene kháng virus gây bệnh nhƣ kiểm soát virus Y khoai tây [47], chuyển gene kháng RYMV (Rice yellow mottle virus) vào lúa [34]; kháng virus khảm dƣa chuột (CMV) [11][26], virus khảm thuốc (TMV) [12] Tuy nhiên, hầu hết cơng trình cơng bố chuyển đơn gene gene kép để tạo trồng kháng hai loài virus định, trồng bị nhiễm lồi virus khác Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng thuốc công nghệ RNAi”  MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Thiết kế đƣợc cấu trúc gene đa đoạn nhiều loài virus gây bệnh hại thuốc - Thiết kế vector RNAi chuyển gene mang cấu trúc gene đa đoạn - Tạo thuốc mang cấu trúc gene chuyển  NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn nhiều loài virus - Sử dụng trình tự gene CP virus để thiết kế mồi đặc hiệu - Ghép nối đoạn gene - Xác định trình tự gene Thiết kế vector RNAi - Tạo vector pDONOR mang cấu trúc gene CP loại virus - Chuyển cấu trúc gene CP vào vector chuyển gene pK7GWIWG(II) kỹ thuật Gateway - Chuyển vector chuyển gene vào vi khuẩn A tumefaciens Chuyển gene vào thuốc nhờ vi khuẩn A tumefaciens - Chuyển gene - Phân tích chuyển gene Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1 Lịch sử phát triển thuốc Thuốc (Nicotiana tabacum Nicotiana rustica) có nguồn gốc từ châu Mỹ, nhiệt đới nhiệt đới, có hƣơng vị đặc trƣng đƣợc ngƣời địa sử dụng nghi lễ tôn giáo dùng làm thuốc chữa bệnh [6] Khi Christopher Columbus đặt chân lên Tây Ấn Độ Dƣơng, ông phát ngƣời xứ vừa nhảy múa, vừa hút loại cuộn tròn gọi Tabaccos Các thông tin phân bố sớm thuốc vùng khác đƣợc số tác giả đƣa [13] Thuốc bắt đầu đƣợc trồng châu Âu vào khoảng năm 1496 1498 nhà truyền đạo ngƣời Tây Ban Nha mang từ châu Mỹ Andre Teve mang hạt từ Braxin trồng Tây Ban Nha Bồ Đào Nha năm 1556 [9] Thuốc đƣợc du nhập vào trồng Trung Quốc Nhật Bản từ kỷ thứ XVI, Ấn Độ vào khoảng năm 1605 Từ đó, nƣớc trở thành nhà sản xuất thuốc lớn, phục vụ cho tiêu dùng nội địa thị trƣờng thuốc giới Ở Việt Nam, thuốc đƣợc du nhập vào từ năm 1660 thời vua Lê Thánh Tông, nhƣng phải đến năm 1876, nghề trồng thuốc thức đƣợc phát triển Gia Định (1899), Tuyên Quang (1940) số tỉnh miền bắc với giống ban đầu Virginia Bland Cash [10] 1.1.2 Phân loa ̣i nguồn gốc Thuố c lá có tên khoa ho ̣c là : Nicotiana sp.,thuộc ngành thực vật hạt kín Angiosper, lớp mầm Dicotylndones, phân lớp Cúc Asteridae, hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana [35] Chi Nicotiana có khoảng 50-70 lồi, đa sớ là da ̣i , vào hiǹ h thái , màu sắc hoa ngƣời ta phân chia thành loại chính: Lồi Nicotiana tabacum L Có hoa màu hồng , đỏ tƣơi hoă ̣c đỏ thẫm là loài phổ biến chiếm 90% diê ̣n tić h thuố c lá thế giới , hầ u hế t các giố ng thuố c lá sơ ̣i vàng th ̣c loa ̣i này Lồi Nicotiana rustica L Có hoa màu vàng , chiế m 10% diê ̣n tích, hầ u hế t các giố ng thuố c lá sơ ̣i nâu và sơ ̣i đen thuô ̣c loa ̣i này , thƣờng dùng để nhai, ngƣ̉i, làm thuốc xì gà Lồi Nicotiana petunioide L Có hoa màu trắng , phớt hồ ng hay tím , thƣờng có vƣờn thƣ̣c vâ ̣t ho ̣c phu ̣c vu ̣ ng̀ n dƣ̣ trƣ̃ gene cho lai , íttacọ́o sản xuất Lồi Nicotiana polidieide L Có hoa màu trắng, thƣ̣c tế cũng có ít sản sản xuấ t, có vƣờn thực vật học số nƣớc Các giống thuốc sợi vàng có chất lƣợng cao Virginia gold, Virginia blond cash, Virginia bright… đƣợc trồ ng nhiề u ở Mỹ , Italia, Bungari, Trung Quố c, Ba Lan, Đức số nƣớc khác ở Nam Mỹ Ở Việt Nam, giống thuốc sợi vàng đƣợc trồng lâu năm Ba Vì Cao Bằ ng, giớ ng Trung Hoa Bài trồ ng ở các tỉnh phiá Bắ c , giống C-83, K 51E, Coker 176, K326, C9-1, Burley Flue-Cured virginia trồng phổ biế n ở Nam và Trung bô ̣ Hiện nay, giống thuốc N tabacum L K326 C9-1 đƣợc trồng phổ biến [3] 1.1.3 Giá trị kinh tế giá trị khoa học thuốc Thuốc loại công nghiệp ngắn ngày có giái trị kinh tế cao, có tầm quan trọng bậc kinh tế giới.Việc trồng thuốc không trực tiếp tạo công ăn việc làm cho 33 triệu nông dân 120 quốc gia giới mà cịn đóng vai trị quan trọng cho tồn cơng nghiệp thuốc [13] Các hãng sản xuất thuố c lá giới đề u phải thƣ̀a nhâ ̣n thuố c đem đến cho họ nguồn lợi nhuận khổng lồ Ở số nƣớc nhƣ Brazil , Zimbabue, Mỹ, Cu Ba, Bungari… thuố c lá là mô ̣t mă ̣t hàng chiế n lƣơ ̣c, cho thu nhâ ̣p lớn các các loa ̣i trồ ng khác Các số liệu thống kê đã ƣớc tiń h khoảng ¼ sản lƣơ ̣ng th́ c lá thế giới đã đƣa vào kim nga ̣ch xuấ t khẩ u Ngồi ra, th́ c còn giải quyế t nhiề u vấ n đề khác nhƣ luân canh , tăng vu ̣, tâ ̣n du ̣ng đấ t đai, lao đô ̣ng và thu nhâ ̣p cao mô ̣t số trồ ng khác Ở Việt Nam, thuốc đƣợc trồng phổ biến tỉnh thuộc Bắc Bộ Nam Bộ Đây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu kinh tế cao cho nông dân thu nhập cho quốc gia Theo thống kê Tổng công ty thuốc Việt Nam (Vinataba) [3] năm (2006-2008) tổng doanh thu thuốc đạt 47,656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nƣớc đƣợc 9,653 tỷ đồng, kim ngạch xuất đạt 192,136 triệu USD, việc làm ngƣời lao động đƣợc bảo đảm, đời sống bƣớc đƣợc nâng cao Ngoài giá trị to lớn kinh tế, thuốc cịn có giá trị mặt khoa học, thuốc mơ hình quan trọng nghiên cứu đối tƣợng thực vật nhƣ: nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gene thực vật… dễ tái sinh chấp nhận gene ngoại lai, có sức sinh trƣởng chống chịu tốt [40] Trong y dƣợc học, thuốc dƣợc liệu tốt để trị giun đũa, ký sinh trùng nhƣ chấy, rận, ghẻ, khô giã đắp vào vết thƣơng để cầm máu [50] 1.2 MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1 Bệnh virus thuốc Hiện nay, suất chất lƣợng thuốc giảm sút nghiêm trọng bệnh virus hoành hành Trong đó, phổ biến nghiêm trọng bệnh khảm TMV (Tomato mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra; bệnh xoăn vàng lá, héo đốm loài virus TYLCV (Tomato yellow leaf curl virus) TSWV (Tomato spotted wilt virus) gây hại (Bảng 1.1) Năm 2008, theo thống kê Nguyễn Văn Chín Nguyễn Ngọc Bích thuộc Tổng cơng ty thuốc Việt Nam, TMV CMV hai loài virus gây hại chủ yếu thuốc Việt Nam Bệnh khảm xuất sớm với tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) tăng dần tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo vùng, từ 18,5-26,5% chí lên tới 100% nhƣ xã Lâu Thƣợng, tỉnh Thái Nguyên, giống thuốc mẫn cảm với TMV chủ yếu K326 Thiệt hại virus gây thuốc lên đến hàng chục tỷ đồng [3] Đối với bệnh virus nói chung bệnh khảm nói riêng chƣa có loại thuốc hố học phịng trị đƣợc cách hữu hiệu, biện pháp phịng bệnh tốt sử dụng hạt giống bệnh để trồng, không sử dụng hạt giống từ ruộng trƣớc bị bệnh nói để làm giống cho vụ sau Thƣờng xuyên vệ sinh, kiểm tra đồng ruộng để phát sớm phun thuốc diệt trừ loại trùng chích hút mang mầm bệnh nhƣ: bọ cánh tơ, bọ phấn trắng, rệp muội, loại thuốc trừ sâu để tránh lây lan Bảng 1.1 Bệnh virus thường gặp thuốc [49] Tên bệnh Tên virus gây bệnh Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus (Virus khảm linh lăng) Quăn cúc tần Beet curly top virus (Virus gây bệnh quăn cúc tần) Ngọn bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (Virus gây biến dạng gân thuốc lá) Tobacco bushy top virus (Virus bụi thuốc lá) Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (Virus gây bệnh khảm dƣa chuột) Vàng chết hoại rau diếp Lettuce necrotic yellows virus (virus dây bệnh vàng chết hoại rau diếp) Nicotiana glutinosa Cịi cọc lạc Peanut stunt virus Bệnh hình hoa hồng Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus bây biế n da ̣ng gân thuốc lá) Tobacco mottle virus (virus gây bệnh đốm thuốc lá) Kỵ axit thuốc Tobacco etch virus (Virus gây bệnh ky ̣ axit thuốc lá) Xoăn vàng cà chua Tomato yellow leaf curl virus(Virus gây xoăn vàng cà chua) Khảm thuốc Tobacco mosaic virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá) Satellite Tobacco mosaic Virus (Virus gây bệnh khảm thuốc vệ tinh) Hoại tƣ̉ thuốc Tobacco necrosis virus (Virus gây hoại tƣ̉ thuốc lá) Bung hạt thuốc Tobacco rattle virus (Virus gây bung hạt thuốc lá) Đốm vòng thuốc Tobacco ring spot virus (Virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) Sọc thuốc Tobacco streak virus (Virus gây bệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc Tobacco stunt virus (Virus gây bệnh còi cọc thuốc lá) Vằn gân thuốc Tobacco vein mottling virus (Virus gây bệnh vằn gân thuốc lá) Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (Virus gây bệnh héo đốm cà chua) Viền gân Potato virus Y (Virus Y khoai tây) U vết thƣơng Wound tumor virus (Virus gây bệnh khối u vết thƣơng) 1.2.2 Sơ lƣợc TMV, CMV, TYLCV, TSVV gây bệnh thuốc 1.2.2.1 Virus khảm thuốc (Tobacco mosaic virus - TMV) Virus khảm thuốc láTMV virus gây bệnh khảm phổ biến thực vật thuộc lồi Tobamovirus đƣợc mơ tả sớm Mayer (1886) [30], Iwanowski (1892) [25], Allard (1914) [14] Stanley (1935) [43] Virus khảm thuốc có phổ ký chủ rộng, gây bệnh 120 loại thực vật khác nhau, nhƣng nhiều thuốc TMV lây truyền theo cách thức tiếp xúc giới thâm nhập vào tế bào qua vết thƣơng, khí khổng qua rễ [7] Biểu bệnh khảm non chuyển sang màu vàng nhạt, nhỏ lại, bề mặt xuất vết khảm loang lổ, màu sắc chỗ đậm chỗ nhạt Bên cạnh đó, cịn có biểu khác nhƣ phiến nhăn, mặt không đƣợc phẳng mà chuyển sang lồi lõm gân bị kìm hãm sinh trƣởng, thịt phát triển bình thƣờng Dạng tiềm ẩn bệnh mức độ khác nhau, bao gồm [5]: - Dạng tiềm ẩn tồn phần: hồn tồn khơng có biểu triệu trứng bệnh - Dạng tiềm ẩn cục bộ: triệu trứng bệnh xuất phần non, nhƣng không đƣợc rõ ràng - Dạng tiềm ẩn tạm thời: xuất giai đoạn bệnh, thƣờng giai đoạn sau - Tiềm ẩn vĩnh viễn: bệnh không biểu triệu chứng suốt thời gian phát triển Giải thích cho tƣợng tiềm ẩn bệnh thời gian ủ bệnh virus TMV tƣơng đối dài, bị nhiễm bệnh giai đoạn trƣởng thành, TMV không kịp biểu triệu trứng Tuy nhiên, suất chất lƣợng sản phẩm sau thu hoạch bị ảnh hƣởng nghiêm trọng Ngoài ra, điều kiện nhiệt độ cao (> 30 oC) làm triệu chứng bệnh Hình 1.1 Bệnh khảm thuốc virus TMV gây (Nguồn: internet) Nghiên cứu cấp phân tử, vật liệu gây TMV Hình 1.1.độ Bệnh khảm thuốc ládi dotruyền virus TMV sợi đơn Nghiên cứu có cấp độ phân tử, vật liệu truyền TMV sợi đơn RNA đơn dƣơng, chiều dài khoảng 6,4diKb chứa khung đọc mở RNA đơn dƣơng, có chiều dài khoảng 6,4 Kb chứa khung đọc mở (ORF) Đầu 5’ RNA có gắn với 7-methyl guanosine Những khung đọc (ORF) Đầu 5’ RNA có gắn với 7-methyl guanosine Những khung đọc mở (ORF) gần đầu 5’ mã hóa protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt 126 mở (ORF) gần đầu 5’ mã hóa protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt kDa 183 kDa (Hình 126kDa 183kDa [18].1.2) [20] 6,395 nt RdRp CP Helicase MP Hình Hình 1.2 1.2.Sơ Sơđồ đồcấu cấutrúc trúcgenome genomecủa củaTMV TMV RdRp replicase; replicase;CP CP- protein - protein helicase - enzyme tới trình trình vỏ;vỏ; helicase - enzyme liênliên quanquan tới duỗi xoắn; dịch mãmã xoắn; MP MP protein proteinvận vậnchuyển chuyển.Chiều Chiềumũi mũitên tênthể thểhiện hiệnchiều chiều dịch 1.2.2.2 Virus khảm Virus khảm trêncây câydưa dưaleo leo(Cucumber (Cucumbermosaic mosaicvirus, virus, CMV) CMV) môđƣợc tả lầnmô đầutảtiên Bệnh khảm khảm trêncây câydƣa dƣaleo leođƣợc CMV lầnvào đầunăm tiên1916, vào năm bệnh virusbệnh gây nên đƣợc 1916, virustrên gâythực nênvật thựcphát vậthiện đƣợcsớm phát Hiệnnhất nay, có nhiều CMV đƣợc tả vớimơ dữtảliệu sớm Hiện nay,dịng có nhiều dịng CMVmô đƣợc với di truyền liệu di chứa truyền khoảng 60 protein khác 15 trình genome virus hồn chứa khoảng 60 protein khácvà 15tựtrình tự genome viruschỉnh hoàn chỉnh Virus khảm thuộc loài Cucumovirrus, họ Bromovirus Virus khảm dƣa dƣa leo leo (CMV) thuộc loài Cucumovirrus, họ Bromovirus đƣợc đƣợc biết đến virus có phổ gây bệnh rộng với 1000 lồi thực biết đến virus có phổ gây bệnh rộng với 1000 loài thực vật [33] Phƣơng thức lan truyền CMV thông qua vật trung gian lồi rệp, ! 9! lồi chủ yếu Myzus persicae Aphis gossypii [27] Hình 1.3 Cây thuốc bị bệnh khảm virus CMV gây ra(Nguồn: internet) Các chủng CMV đƣợc chia thành hai nhóm I II dựa phân tích huyết [24, 46], lai acid nucleic giải trình tự gene [32] Giữa nhóm I II có mối quan hệ xa nhau, hệ gene chúng có 75% nucleotide tƣơng đồng Trong nhóm I lại đƣợc chia thành phân nhóm IA IB với độ tƣơng đồng chúng lên tới 92 – 95% [33, 37] Các chủng CMV phân nhóm IA nhóm II xuất gần nhƣ toàn giới, chủng thuộc phân nhóm IB lại chủ yếu xuất Châu Á [12] Khi xem xét cấp độ tế bào phân tử, CMV có dạng hình cầu, đƣờng kính khoảng 28 – 30 nm trọng lƣợng phân tử từ 5,0 – 6,7.106 Da Vật liệu di truyền CMV gồm sợi RNA thông tin (RNA1, RNA2, RNA3) có khung đọc mở (ORF) RNA1 gồm có 3357 nucleotide mã hố cho protein 1a (khoảng 111 kDa), RNA2 chứa 3050 nucleotide mã hoá trực tiếp protein 2a (97 kDa), RNA3 mã hoá trực tiếp protein di chuyển (30kDa) Ngồi sợi RNA trên, cịn có RNA4A gồm 691 nucleotide có nguồn gốc từ RNA2 mã hoá cho protein 2b (15 kDa) RNA4 (1034 nucleotide) có nguồn gốc từ RNA3 mã hố protein vỏ (24,5 kDa) Hai protein 1a, 2a kết hợp với protein kí chủ tạo thành enzyme “replicase” CMV [37] Trong ba loại RNA CMV, RNA3 thƣờng xuyên xảy trình tái tổ hợp so với RNA1 RNA2 [37] Do đó, có nhiều nghiên cứu dựa RNA3 để đánh giá đa dạng di truyền xây dựng phát sinh chủng CMV Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc hệ gene virus CMV Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome CMV 1.2.2.3 Virus héo đốm cà chua (Tomato spotted wilt virus, TSWV) gây bệnh Các chủng CMV đƣợc phân chia thành hai nhóm I II dựa vào huyết xoăn đọt héo thuốc học [42] [22], lai acid nucleic [50], trình tự gen [27] Phân nhóm I II virus héo đốm câychỉ cà chua đƣợc mơ tả có mối TSWV quan hệlàkhá xa gây nhaubệnh genmon củatrên chúng có 75% nucleotid lần đầu tƣơng nhómvàI lại đƣợc thành IA IB, bệnh độ tƣơng tiên vàođồng nămTrong 1930 bởiphân Samuel cộng chia Australia [39], héo đốm cà đồng chúng lên tới 92%-95% [29] [31] Các chủng CMV phân nhóm IA chua gây thiệt hại đáng kể cho kinh tế nông nghiệp TSWV đƣợc đánh giá II xuất hầu nhƣ khắp giới chủng CMV phân nhóm virus gây hại phổ rộng với 370 loại trồng 50 họ thực vật khác IB chủ yếu có mặt Châu Á [21] [9] vùng khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới [18] Trong ba RNA CMV, RNA3 xảy tái tổ hợp thƣờng xuyên Tại Việt Nam, virus héo đốm cà chua đƣợc phát cà chua RNA1 RNA2 [31] Vì có nhiều nghiên cứu dựa RNA3 để đánh Môn [7]divà thuốc giáHooc bảng đa dạng truyền xây dựnglá phát sinhc chủng CMV TMV thuộc loại Tobamovirus, phổ ký chủ virus TMV có tới 230 lồi thuộc 32 họ virus gây hại thực vật đƣợc mô tả sớm nƣớc ta Đây virus gây bệnh thực vật đƣợc mô tả sớm 12 Hình 1.5: Ảnh thuốc bị bệnh héo đốm virus TSWV gây ra(Nguồn: internet) 10 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thiết kế thành công vector chuyển geneRNAimang gene chọn lọc mannose đoạn gene vỏ (coat protein-CP) loại virus TMV, CMV, TSWV TYLCV (pK7M/TCYS) Với nồng độ mannose 30 g/l thích hợp cho chọn lọc thuốc chuyển gene mang gene chọn lọc mannose Chuyển thành công cấu trúc RNAi TCYS mang gene chọn lọc mannose vào giống thuốc K326 C9-1, tỷ lệ chuyển gene kháng virus lần lƣợt 51,67% 42,5% Kiến nghị Tiếp tục theo dõi đánh giá tính kháng mẫu thuốc chuyển gene hệ nhằm tạo đƣợc dòng thuốc có khả kháng TCYS ổn định qua nhiều hệ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình cộng (2006), Báo cáo tổng kết đề tài “Thu thập phân lập gene virus gây bệnh ba trồng thuộc họ Cà (Solanaceae) thuốc lá, khoai tây cà chua nhằm xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus tạo vật liệu di truyền cho tạo giống kháng bệnh virus” Báo cáo đề tài cấp viện giai đoạn 2005 – 2006.Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Lê Trần Bình (2008), Báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi tạo giống trồng chuyển gene kháng bệnh virus” Báo cáo đề tài cấp viện giai đoạn 2007 – 2008 Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008),Báo cáo theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc làm sở dự báo nghiên cứu biện pháp phòng trừ,Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng cơng ty thuốc Việt Nam Chu Hồng Hà (2010),“Nghiên cứu tạo trồng kháng bệnh virus gây công nghệ ức chế RNA (RNAi)”Báo cáo tổng kết đề tài.Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Trầ n Văn Hai (2009), Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ Trần Đình Long, Mai Thạch Hồnh, Hồng Tuyết Minh, Phùng Bá Tạo, Nguyễn Thị Trâm (1997), Chọn giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Vũ Triệu Mân (2007),Giáo trình bệnh chuyên khoa chuyên ngành Bảo vệ thực vật Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội Đồn Thị Thanh Nhàn (1996),Giáo trình Cây cơng nghiệp NXB Nông nghiệp, Hà Nội Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006),Kỹ thuật gieo trồng, chế biến thuốc lá, NXB Lao động Hà Nội 46 10 Lê Lƣơng Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn virus hại trồng, NXB Giáo dục 11 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà, Lê Trần Bình (2008),“Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dƣa chuột kỹ thuật RNAi” Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A): 679-687 12 Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Hà Viết Cƣờng, Lê Văn Sơn, Lê Trầ n Bình Chu Hồng Hà (2009),Tạo thuốc kháng virus TMV kỹ thuật RNAi Hô ̣i thảo Quố c gia Bê ̣nh ̣i Thƣ̣c vâ ̣t Viê ̣t Nam , 25-26/7 Viê ̣n Nghiên cứu Bông và phát triể n NN Nha Hố - Ninh Thuâ ̣n Tr 32-40 Tiếng Anh 13 Akehurt B C (1981), “Tobacco”, Longman group Ltd, New York 764pp 14 Allard, H.A (1914),“The mosaic disease of tobacco”, US Dep Agric Bull 40 15 Avidov, H Z (1944),“Tobacco whitefliy in Israel”,Tel Aviv: Hassadeh (in Hebrew), pp 1-33 16 Baulcombe D (2004), “RNA silencing in plants”, Nature 431(7006): 356-63 17 Chicas and Macino (2001),“Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing”,EMBO (11): 992-6 18 Cho, J J., Mau, R F L., Mitchell, W C., Gonsalves, D., and Yudin, L S (1987),“Host list of plants susceptible to tomato spotted wilt virus (TSWV)” Res Ext Ser Univ Hawaii, Honolulu 19 Cohen, S N., Chang, A C Y & Hsu, L (1972), Proc Nat Acad Sci., U.S.A 69, 2110-2114 20 Collmer, Vogt, and Zaitlin.(1983), “The H protein was comprised of a backbone of TMV”, Virology 126:429-448 21 Czosnek, H., Ber, R., Antignus, Y., Cohen, S., Navot, N., & Zamir, D (1988),Isolation of tomato yellow leaf curl virus, a geminivirus Phytopathology 78, 508-512 47 22 Herbers K, Meuwly P, Wolf B, Metraux JP, and Sonnowald U (1996),“Systemic acquired resistance mediated by the ectopic expression of invertase possible hexose sensing in the secretory pathway” Plant Cell 8: 793-803 23 Hull R, Davies JW (1992),“Approaches to nonconventional control of plant virus diseases”,Crit Rev Plant Sci 11: 17-33 24 Ilardi V., Mazzei M., Loreti S., Tomassoli L., barba M (1995),“Biomoleccular and serological methods to identify strains of cucumber
mosaic cucumovirus on tomato”, EPPO Bulletin 25: 321- 327 25 Iwanowski, D (1892),“Concerning the mosaic disease of the tobacco plant”,St Petersb Acad.Imp Sci Bul 35: 67-70 26 Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M (2002),“The occurrence of CMV2 specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus derived double-stranded RNA is indicative of resistance to the virus”, MPMI 15(8): 8262833 27 Karen_Beth G Scholthof (2004),“Tobacco Mosaic Virus: A Model system for plant biology”,Annu Rev Phytopathol 42:13-34 28 Kormelink, R., Kitajima, E W., De Haan, P., Zuidema, D., Peters, D., and Goldbach, R (1991),“The nonstructural protein (NSs) encoded by the ambisense S RNA segment of tomato spotted wilt virus is associated with fibrous structures in infected plant cells”,Virology 181: 459-468 29 Lazarowitz, S G (1992),“Geminiviruses: Genome structure and gene function”,Crictic Rev Plant Sci 11: 327 - 349 30 Mayer, A (1886),“Concerning the mosaic disease of tobacco”.Die Landwirtschaftliche Versuchsstationen 32:451-467 Translation published in English as Phytopathological Classics Number (1942) American Phytopathological Society Press St Paul, MN 48 31 Navot, N., Pichersky, E., Zeidan, M., Zamir, D., & Cozosnek, H (1991), “Tomato yellow leaf curl virus: a whitefly-transmitted geminivirus with a single genomic component” Virology 185, 131-161 32 Owen A.M., Downes, J.D., Sahakian, B.J., Polkey, C.E and Robbins T.W (1990),“Planning and spatial working memory following frontal lobe lesions in Man”,Neuropsychologia, 28 (10), 10211034 33 Palukaitis, P., Roossinck, M J., Dietzgen, R G., and Francki, R i B (1992),“Cucumber mosaic virus”, Adv, Virus Res 41: 281-348 34 Pinto YM, Kok RA, Baulcombe D C (1999),“Resistance to rice yellow mottle virus (RYMV) in cultivated African rice varieties containing RYMV transgenes”, Nat Biotechnol 17: 702-707 35 Reed S M (1993),“Use of stomatal size to distinguish between haploid and dihaploid tobacco plants”,Tobbaco Sciences 37: 84-86 36 RN (1999),“Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation”.Phil Trans R Soc Lond B 354: 659-664 37 Roossinck MJ (2002),“Evolutionnary history of cucumber mosaic virus as deduced by phylogentic analyses”,J Virol 76: 3382- 3387 38 Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T (1989),“Molecular Cloning: a Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 39 Samuel, G., J G Bald, and H A Pittman(1930),“Investigations on spotted witl of tomatoes” Australian Counc Sci Indus Res Bull No 44 64 pp 40 Shinichiro K, Atsuko M, Masamichi N, and Yutaka T (2007), “Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing” Plant cell report 1283-1288 49 41 Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson A O (1993),“Control of Plant virus diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants”,Plant Physiol 102: 7-12 42 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse P M (2000),“Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs”,Nature 407: 319-20 43 Stanley, W.M (1935),“Isolation of a crystalline protein possessing the properties of tobacco mosaic virus”,Science 81:644-645 44 Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004),“RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants”, Virus Res 102(1): 85-96 45 Topping J F (1998),“Tobacco transformation” In Foster GD, Taylor SC (ed.), Plant virology protocols, from virus isolation to transgenic resistance Humana Press, Totowa, NJ 81: 365-485 46 Wahyuni, W.S., Dietzegen, R G., Hanada, K., and Francki, R.I.B (1992),“Seorological and biological variatinon bwtwwen and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus”, Plant Pathol 41: 282297 47 Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998),“Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA”, Proct Natl Acad Sci USA 95(23): 1395913964 48.Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007),“Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus”, Transgenic Res 16(3): 385-98 Nguồn Internet 49 http://www.apsnets.org/online/common/names/tobacco.asp 50 50 http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-vat-hoc/44070_Cay-bien-doigene-phat-trien-khong-ngung.aspx 51 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết nêu trọng luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình nghiên cứu khác Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2015 Tác giả Nguyễn Trung Hiếu i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Văn Sơn, Phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS Chu Hồng Hà, ThS Phạm Thị Vân, KS Nguyễn Thị Thu Hiền, KS Nguyễn Văn Đoài, tập thể cán bộ, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên Phịng cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu suôt trình hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn TS Lê Hồng Điệp thầy cô giáo Khoa sinh học – Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè người ln bên tơi, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập thực khóa luận Hà Nội, ngày 30 tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Trung Hiếu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU,CÁC TỪ VIẾT TẮT viii MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1.1.Lịch sử phát triển thuốc 1.1.2.Phân loa ̣i nguồn gốc 1.1.3.Giá trị kinh tế giá trị khoa học thuốc 1.2.MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1.Bệnh virus thuốc .5 1.2.2.Sơ lƣợc TMV, CMV, TYLCV, TSVV gây bệnh thuốc 1.2.2.1.Virus khảm thuốc (Tobacco mosaic virus - TMV) .7 1.2.2.2.Virus khảm dƣa leo (Cucumber mosaic virus, CMV) .8 1.2.2.3.Virus héo đốm cà chua (Tomato spotted wilt virus, TSWV) gây bệnh xoăn đọt héo thuốc 10 1.2.2.4.Virus gây bệnh xoăn vàng cà chua (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 11 1.2.3.Biện pháp phòng chống bệnh virus 13 1.2.3.1.Sử dụng giống bệnh 13 1.2.3.2.Sử dụng giống kháng bệnh phƣơng pháp lai tạo 13 1.2.3.3.Các biện pháp canh tác 14 1.2.3.4.Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học 14 1.3.KỸ THUẬT RNA INTERFERENCE – CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 16 iii 1.3.1.Khái niệm RNA interference 16 1.3.2.Cơ chế hoạt động RNAi 16 1.4 NGHIÊN CỨU TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GENE KHÁNG VIRUS TẠI VIỆT NAM 18 Chƣơng - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.1.1.Nguồn gene CP virus 21 2.1.2.Chủng vi khuẩn 21 2.1.3.Nguồn thực vật 21 2.1.4.Hóa chất 21 2.1.5.Thiết bị 21 2.2.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1.Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn 22 2.2.2.Thiết kế vector RNAi 23 2.2.2.1 Thiết kế vector RNAi tiếp nhận mang gene chọn lọc manA .23 2.2.2.2 Chuyển cấu trúc TCYS từ vector cho pENTR/TCYS vào vector tiếp nhận pK7M kỹ thuật Gateway 26 2.2.3 Biến nạp sản phẩm vào tế bào vi khuẩn .27 2.2.3.1 Biến nạp vào tế bào E coli 27 2.2.4 Kỹ thuật PCR colony-PCR 29 2.2.5 Phƣơng pháp tạo thuốc chuyển gene mang cấu trúc TCYS 30 2.2.5.1 Xác định nồng động mannose sử dụng môi trƣờng chọn lọc 30 2.2.5.2 Chuyển gene vào thuốc thông qua A tumefaciens .31 2.2.5.3 Phân tích khả kháng virus chuyển gene phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo 32 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1.Kết thiết kế cấu trúc gene đa đoạn TCYS 33 iv 3.2 Kết thiết kế vector chuyển gene RNAi mang cấu trúc gene đa đoạn TCYS 34 3.2.1 Kết thiết kế vector RNAi mang gene chọn lọc đƣờng mannose 35 3.2.2 Kết thiết kế vector chuyển gene RNAi mang cấu trúc đa đoạn TCYS chọn lọc đƣờng mannose 36 3.2.3 Kết tạo dòng A.tumerfaciens mang vector tái tổ hợp pK7M/TCYS 38 3.3 Kết tạo chuyển gene mang cấu trúc RNAi TCYS 39 3.3.1 Kết xác định nồng độ mannose sử dụng chọn lọc chuyển gene 39 3.3.2 Kết chuyển cấu trúc RNAi TCYS vào giống thuốc C9-1 K326 thông qua A tumefaciens 41 3.3.3 Kết phân tích chuyển gene 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Bệnh virus thƣờng gặp thuốc [49] Bảng 2.1 Danh sách mồi 22 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) enzyme SphI 25 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng T4 DNA Polymerase 25 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt enzyme HindIII 25 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng cắt pNOV-gusplus HindIII PmeI 26 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng ghép nối nhờ enzyme T4 ligase 26 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng cắt enzyme hạn chế 28 Bảng 2.8: Thành phần phản ứng PCR 30 Bảng 2.9: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 30 Bảng 2.10: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy 31 Bảng 3.1: Ảnh hƣởng mannose tới khả tái sinh mảnh thuốc lá39 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng mannose tới khả rễ chồi thuốc 40 Bảng 3.3: Kết biến nạp cấu trúc RNAi TCYS vào thuốc 42 Bảng 3.4: Kết lây nhiễm virus dòng thuốc chuyển gene TCYS hệ T0 WT 43 vi DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Bệnh khảm thuốc virus TMV gây Hình 1.2 Sơ đồ cấu trúc genome TMV Hình 1.3 Cây thuốc bị bệnh khảm virus CMV gây Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc hệ gene virus CMV 10 Hình 1.5: Ảnh thuốc bị bệnh héo đốm virus TSWV gây 10 Hình 1.6 Sơ đồ cấu trúc genome TSWV 11 Hình 1.7 Cây thuốc bị nhiễm bệnh xoăn vàng thuốc 12 Hình 1.8 Tổ chức gene TYLCV Khung mở đọc đƣợc định V (định hƣớng virus) C (định hƣớng ý nghĩa bổ sung) 12 Hình 1.9 Mô tả đƣờng tạo thành RNAi a: siRNA; b: miRNA 18 Hình 3.1: Ảnh điện di sản phẩm ghép nối cấu trúc đoạn gene TCYS 33 Hình 3.2: Trình tự đoạn gene TCYS vị trí mồi 34 Hình 3.3 Ảnh điện di kết thiết kế vector mang cấu trúc RNAi gene manA 35 Hình 3.4: Sơ đồ cấu trúc vector pK7M/TCYS 37 Hình 3.5: Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M/TCYS enzyme XbaI/HindIII (A) PCR mồi đặc hiệu TMV-Fi-2/TSWV-Ri1(B) 38 Hình 3.6: Ảnh điện di sản phẩm colony -PCR mồi đặc hiệu TMV-Fi2/TSWV-Ri-1 38 Hình 3.7: Hình ảnh qua bƣớc nghiên cứu thí nghiệm 42 Hình 3.8: Hình ảnh thuốc lây nhiễm TMV CMV sau 30 ngày44 Hình 3.9: Kết PCR kiểm tra có mặt gene TCYS thuốc K326 C9-1bằng mồi đặc hiệu TMV-Fi-2/TSWV-Ri-1 44 vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT A.tumefaciens bp CP DNA pK7 pK7M dNTP E coli EDTA EtBr et al Kb kDa LB MS PCR Agrobacterium tumefaciens Base pair Coat protein (protein vỏ) Deoxyribonucleic acid pK7GWIWG2(II) pK7 chọn lọc mannose Deoxyribonucleotide triphosphate Escherichia coli Ethylene Diamine tetra-acetate acid Ethidium Bromide Đồng tác giả Kilobase Kilodalton Luria and Bertani Murashige Skoog Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid RNAi RNase TAE RNA interference Ribonuclease Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TMV CMV TYLCV TSWV TCYS v/p Tobacco mosaic virus Cucumber mosaic virus Tomato yellow leaf curve virus Tomato spotted wilt virus Cấu trúc gene đa đoạn chứa gene CP loại virus TMV, CMV, TYLCV, TSWV vòng/phút HLKH&CN Hàn Lâm Khoa học Công nghệ viii ... ? ?Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng thuốc công nghệ RNAi? ??  MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Thiết kế đƣợc cấu trúc gene đa đoạn nhiều loài virus gây bệnh hại thuốc - Thiết kế vector RNAi chuyển. .. vật, vector chuyển gene mang gene chọn lọc mannose thay cho gene kháng kháng sinh nhƣ đƣợc sử dụng trƣớc Kết có bƣớc: - Thiết kế vector RNAi mang gene chọn lọc mannose (pK7M) - Thiết kế vector. .. đoạn TCYS thiết kế ban đầu, chứng tỏ thuốc có mang cấu trúc gene cần chuyển 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã thiết kế thành công vector chuyển geneRNAimang gene chọn lọc mannose đoạn gene vỏ