Đang tải... (xem toàn văn)
Nhân giống vô tính cây saintpaulia bằng phương pháp in-vitro
Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005 KHOA HỌC SỰ SỐNG Trang Tuyển tập báo cáo NCCB KHTN NGHIÊN CỨU CÁC VẤN ĐỀ SINH HỌC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC HIỆN ĐẠI Mã số đề tài: 642801 Chủ nghiệm đề tài: PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC Cơ quan công tác: Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM Địa liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q 5, TP.HCM, Điện thoại: 08-8307079 Email:tlthuoc@hcmuns.edu.vn, tlthuoc@hcmc.netnam.vn Thành viên tham gia: - Nguyễn Tiến Dũng - Nguyễn Đức Hoàng - Đặng Thị Phương Thảo - Lê Văn Bình - Đỗ Anh Tuấn - Chu Thị Thu Trang - Nguyễn Thanh Thùy Nhiên - Nguyễn Thị Bạch Huệ - Nguyễn Quỳnh Anh - Huỳnh Ngọc Vi ca Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu vấn đề: Xây dựng qui trình PCR (polymerase chain reaction) chẩn đốn nhanh số vi khuẩn gây bệnh thường kiểm soát thực phẩm (Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli, E coli O157:H7); Phân biệt Salmonella gây bệnh không gây bệnh môi trường nước thực phẩm; Phát triển công nghệ gen công nghệ bề mặt tế bào phục vụ mục đích nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng Kết nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đạt 1) Xây dựng thành cơng qui trình PCR phát vi sinh vật gây bệnh thường kiểm soát mẫu thực phẩm sau đây: (i) Qui trình phát tác nhân gây bệnh Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli, E coli O157:H7; (ii) Qui trình phát đồng thời tác tác nhân gây bệnh Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli Về mặt khoa học, nội dung mang ý nghĩa ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR để tạo qui trình chẩn đốn cho phép phát vi sinh vật gây bệnh mẫu thực phẩm nhanh nhạy so với phương pháp vi sinh vật truyền thống Trang Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005 2) Nghiên cứu phân biệt Salmonella gây bệnh không gây bệnh môi trường nước thực phẩm kỹ thuật sinh học phân tử Trong nội dung này, tiến hành kiểm chứng diện gen fimA, invA, iagAB, spvC 114 chủng Salmonella spp phân lập từ nước, thực phẩm; hình thành quy trình phát phân biệt giống Salmonella với nhóm S enterica I gây bệnh ứng dụng kết phát phân biệt Salmonella gây bệnh không gây bệnh môi trường nước nuôi tôm Về mặt khoa học, nghiên cứu giới Việt Nam việc dùng PCR gen gây bệnh khác để phát phân biệt Salmonella nói chung Salmonella gây bệnh 3) Tạo dòng biểu gen mã hóa protein vỏ VP19, VP28 virút gây hội chứng đốm trắng WSSV tôm sú Về mặt khoa học, nội dung nghiên cứu đóng góp trình tự nucleotide hai gen quan trọng tính gây bệnh WSSV, thu nhận sản phẩm kháng nguyên tái tổ hợp 4) Nghiên cứu phát triển hệ thống biểu định vị sản phẩm gen ngoại lai tế bào sử dụng mơ hình nấm men Saccharomyces cerevisiae bao gồm: (i) Thiết lập hệ thống biểu sản phẩm gen ngoại lai (protein phát huỳnh quang lục GFP, protein phát quang aequorin, enzyme glucoamylase, α-amylase) lên bề mặt tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae; (ii) Thiết lập hệ thống biểu sản phẩm gen ngoại lai (protein phát huỳnh quang lục GFP dạng đột biến EYFP, ECFP) lên màng tế bào S cerevisiae Về mặt khoa học, nội dung nghiên cứu góp phần hình thành cơng cụ sau cho khoa học: (i) Phương pháp cố định protein ngoại lai bề mặt tế bào nấm men S cerevisiae; (ii) Hệ thống gen thị công nghệ bề mặt tế bào nấm men S cerevisiae; (iii) Công cụ nghiên cứu vai trò protein màng hệ thống truyền thông tin nội bào Ý nghĩa thực tiễn hiệu ứng dụng thực tiễn 1) Tạo sở để phát triển KIT để phân tích nhanh tác nhân gây bệnh mẫu thực phẩm phục vụ: (i) công tác giám sát, quản lý chất lượng sản xuất, chế biến thực phẩm; (ii) xác định nguyên nhân gây ngộ thực phẩm dịch bệnh; (iii) giám sát lan truyền vi khuẩn gây bệnh cộng đồng 2) Các kết phân biệt Salmonella gây bệnh không gây bệnh kỹ thuật sinh học phân tử chứng minh xây dựng tiêu chuẩn để kiểm soát diện Salmonella thủy hải sản xuất dựa nhóm Salmonella gây bệnh thay Salmonella nói chung (hiện diện phổ biến mơi trường nước khó tránh bị nhiễm), tạo tiêu chuẩn đầu tốt cho thủy hải sản xuất 3) Tế bào nấm men với protein chức enzyme, kháng nguyên bổ sung bề mặt sử dụng dạng enzyme bất động sản xuất chế biến thực phẩm làm vắc xin phòng chống bệnh cho vật nuôi Kết đào tạo sau đại học Thạc sĩ: 04; số bảo vệ: 04; số hướng dẫn: Tiến sĩ: 01; số bảo vệ: 0; số hướng dẫn: 01 Các sản phẩm khoa học hồn thành 5.1 Các cơng trình cơng bố tạp chí khoa học Trang Tuyển tập báo cáo NCCB KHTN [1] Phát đồng thời E coli, Salmonella spp Vibrio cholerae multiplex PCR, Tạp chí Di truyền ứng dụng, số 2, 29 - 35, 2002 [2] Phát E coli O157:H7 mẫu thực phẩm phản ứng multiplex PCR, Tạp chí Di truyền ứng dụng, số 2, 23 - 29, 2002 [3] Thiết kế plasmid biểu protein phát huỳnh quang ECFP mặt màng tế bào nấm men S cerevisiae, Tạp chí Di truyền ứng dụng, số 3, 52 - 58, 2002 [4] Thiết kế plasmid biểu protein EYFP tế bào chất nấm men S cerevisiae nhờ cảm ứng glucose, Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ ĐH Quốc gia TP.HCM, tập 5, số 7, 51 - 58, 2002 [5] Tạo dòng nấm men S cerevisiae tái tổ hợp biểu gen mã hóa glucoamylase, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ ĐH Quốc gia TP.HCM, tập 5, số 7, 36 - 43, 2002 [6] Khảo sát diện plasmid spv (Salmonella virulence plasmid) Samonella phân lập từ nước thực phẩm thủy sản, Tạp chí Di truyền ứng dụng, 2, 35-41, 2003 [7] Quan sát biểu protein ngoại lai tế bào nấm men nhờ protein phát huỳnh quang ECFP, Tạp chí Sinh học, 26, 30-34, 2004 5.2 Các báo cáo khoa học hội nghị, hội thảo khoa học [1] Nghiên cứu phát phân biệt Salmonella spp S enterica I thực phẩm phản ứng PCR, Hội nghị toàn quốc lần II, Nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học, Huế, 865-868, 2003 [2] Tạo plasmid với thị protein phát huỳnh quang phục vụ nghiên cứu tương tác giừa protein nội bào nấm men S cerevisiae, Hội nghị toàn quốc lần II, Nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học - Huế, 906-909, 2003 [3] Nghiên cứu hệ thống biểu protein ngoại lai bề mặt tế bào nấm men S cerevisiae, Hội nghị toàn quốc lần II, Nghiên cứu sinh học, nông nghiệp, y học - Huế, 1016-1019, 2003 5.3 Sách chuyên khảo xuất Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm, mỹ phẩm, NXB Giáo dục, Chi nhánh t5i TP.HCM, 8/2002) Đánh giá kiến nghị Hoàn thành mục tiêu nộidung đề tài: có nhiều cơng trình cơng bố (07 báo khoa học, 03 báo cáo khoa học tồn quốc), đào tạo 04 thạc sỹ, có 01 sách Ngoài ra, số kết đề tài có giá trị thực tiễn lớn phát triển thành đề tài khoa học công nghệ để ứng dụng vào đời sống sản xuất Trang Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005 STUDIES ON BIOLOGICAL ISSUES BY MODERN BIOLOGICAL TECHNIQUES ABSTRACT Application of molecular biological techniques in studying on the following issues: (i) Establishment of PCR (polymerase chain reaction) protocols for rapid detection of some commonly regulated bacterial pathogens (Salmonella spp., Vibrio cholerae, Escherichia coli, E coli O157:H7) in food; (ii) Differentiation of pathogenic and non-pathogenic Salmonella in natural water, food; (iii) Development of gene technology and cell surface engineering for basic and applied studies Trang Tuyển tập báo cáo NCCB KHTN NGHIÊN CỨU CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN GEN TRONG E coli ĐỂ SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP Mã số đề tài: 643204 Chủ nghiệm đề tài: PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC Cơ quan công tác: Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM Địa liên lạc: 227 Nguyễn Văn Cừ, Q 5, TP.HCM, Điện thoại: 08-8307079 Email: tlthuoc@hcmuns.edu.vn, tlthuoc@hcmc.netnam.vn Thành viên tham gia: - Nguyễn Đức Hoàng - Phan Thị Phượng Trang - Hoàng Văn Quốc Chương - Nguyễn Thanh Thùy Nhiên - Nguyễn Quỳnh Anh - Phạm Hồng Ánh - Chu Kỳ Nam - Nguyễn Văn Nhung Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Đề tài nhằm so sánh hệ thống biểu gen khác tế bào E coli thương mại hóa, đề xuất quy tắc chọn lựa hệ thống để phù hợp với protein mục tiêu công đoạn lên men, sau lên men Kết đề tài tạo sở cho việc phát triển nghiên cứu công nghệ sản xuất tinh chế protein tái tổ hợp phục vụ chẩn đốn, điều trị phịng ngừa bệnh người, vật nuôi, trồng Kết nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đạt 2.1 Kết nghiên cứu 1) Đã tạo thành cơng 03 dịng E coli để biểu gen mã hóa protein vỏ VP28 vi rút gây hội chứng đốm trắng tôm sú (WSSV) ba hệ thống biểu khác pET, pGEX, pQE; khảo sát mức độ biểu chủng chủ khác nhau; biểu gen chứng minh biểu gen diện protein tái tổ hợp SDS-PAGE, Western blot; định lượng so sánh mức biểu 2) Khảo sát ảnh hưởng hệ vector (pET, pGEX, pQE), chủng chủ E coli (BL21, BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, M15[pREP4], SG13009[pREP4], nhiệt độ, thời gian nồng độ chất cảm ứng lên hiệu suất biểu protein tái tổ hợp (VP28 virút gây hội chứng đốm trắng WSSV) E coli Kết cho thấy: - Chủng M15[pREP4] thích hợp cho việc biểu protein tái tổ hợp vector pQE30 Chủng SG13009[pREP4] sử dụng hiệu biểu thấp Trang Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005 - Chủng BL21 thích hợp cho việc biểu protein tái tổ hợp vector pGEX-2TK, chủng BL21(DE3) - Chủng BL21(DE3) thích hợp cho việc biểu protein tái tổ hợp vector pET43.1a, chủng BL21(DE3)pLysS - Như lập kế hoạch tạo dòng gen tổng hợp protein tái tổ hợp E coli hệ thống pQE, pGEX, pET nên ưu tiên sử dụng chủng chủ tương ứng M15[pREP4], BL21, BL21(DE3) 3) Khảo sát ảnh hưởng protein thioredoxin (Trx), glutathione-Stransferase (GST), protein gắn maltose (MBP) NusA dạng dung hợp (tag) lên tính tan protein tái tổ hợp biểu E coli Gen mã hóa cho protein khơng cấu trúc NS1 virút viêm não Nhật Bản JEV (Japanese Encephalitis Virus) chọn làm mơ hình khảo sát Gen mã hóa NS1 tạo dòng vào vector pTrx, pGST, pMBP pNusA để NS1 biểu dạng protein dung hợp (fused protein) với Trx (Trx-NS1), GST (GST-NS1), MBP (MBP-NS1) NusA (NusANS1) Hàm lượng protein dung hợp pha tan không tan sau đồng tế bào định lượng SDS-PAGE phần mềm Quantity One (BioRad) Kết cho thấy protein dung hợp tạo thành MBP- NS1 có khả tan cao (44,47% tổng MBP-NS1 pha tan không tan), NusA-NS1 (20,03%) GST-NS1 (13,05%) Trx-NS1 khơng tan 4) Đã tạo dịng biểu mini-proinsulin tái tổ hợp E coli khảo sát điều kiện lên men tổng hợp mini-proinsulin tái tổ hợp qui mô pilot Kết cho thấy xác định điều kiện lên men thích hợp sử dụng mơi trường chứa glucose 0,5%, cao nấm men 0,5% NaCl 0,5% làm môi trường để lên men pilot thay cho môi trường LB đắc tiền (trypton 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%), sử dụng lactose để cảm ứng biểu gen thay cho chất cảm ứng tổng hợp đắc tiền IPTG để lên men tổng hợp mini-proinsulin tái tổ hợp qui mơ 30 lít Hiệu suất biểu 6,1% thấp qui mơ phịng thí nghiệm (11,7%) Tuy nhiên hiệu suất biểu tiếp tục cải thiện phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men sau 5) Ngồi ra, đề tài cịn thực thành cơng việc tạo dịng biểu gen mã hóa kháng nguyên khác VP281, VP19 WSSV E coli 2.2 Ý nghĩa khoa học Kết đề tài có đóng góp khoa học sau đây: - So sánh hệ thống biểu gen khác tế bào E coli thương mại hóa, tạo sở khoa học cho việc đề xuất quy tắc chọn lựa hệ thống biểu thích hợp để sản xuất protein tái tổ hợp - So sánh đề xuất việc chọn lọc dung hợp (tag) để cải thiện tính tan protein tái tổ hợp E coli - Bước đầu xác định điều kiện cho phép lên men E coli qui mô pilot để sản xuất protein tái tổ hợp với chi phí thấp - Tạo kháng nguyên tái tổ hợp khác WSSV làm sở cho việc chọn lọc kháng nguyên hữu hiệu dùng chẩn đoán WSSV phương pháp miễn dịch - Tạo sở bước đầu để xây dựng công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp VN Trang Tuyển tập báo cáo NCCB KHTN Ý nghĩa thực tiễn hiệu ứng dụng thực tiễn - Các protein vỏ VP28, VP281, VP19, tái tổ hợp tạo thành nguyên liệu kháng nguyên để phát triển kháng thể xét nghiêm nhanh bệnh đốm trắng tôm sú phương pháp miễn dịch (ELISA…) - Insulin tái tổ hợp thuốc đặc trị để điều trị bệnh tiểu đường typ nước ta phải nhập Việc sản xuất thành công insulin tái tổ hợp cơng nghệ gen góp phần tạo thuốc đặc trị cần thiết thay thuốc ngoại nhập Kết đào tạo sau đại học Thạc sĩ: 05; số bảo vệ: 02; Tiến sĩ: 01; số bảo vệ: 0; số hướng dẫn: 03 số hướng dẫn: 01 Các sản phẩm khoa học hồn thành 5.1 Các cơng trình cơng bố tạp chí khoa học [1] Tạo dịng biểu gen mã hóa protein vỏ VP28 virus gây hội chứng đốm trắng WSSV tôm sú E coli, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1, 47-56, 2003 [2] Tạo dòng biểu gen mã hóa protein vỏ VP19 vi rút WSSV gây hội chứng đốm trắng tôm sú E coli , Tạp chí Di truyền ứng dụng, 4, 49-55, 2003 [3] Sử dụng vector pQE để biểu tinh chế protein vỏ VP28 virus gây hội chứng đốm trắng tơm sú, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1, 299307, 2003 [4] Tạo dòng biểu gen mã hóa protein vỏ VP281 virus gây hội chứng đốm trắng White Spot Syndrome Virus) tôm sú (Penaeus monodon), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, 49-56, 2004 [5] Tạo dòng biểu mini-proinsulin tái tổ hợp E coli, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 2, 155-160, 2005 5.2 Các báo cáo khoa học hội nghị, hội thảo khoa học [1] Nghiên cứu thành phần môi trường điều kiện nuôi cấy để tổng hợp miniproinsulin tái tổ hợp E coli qui mơ pilot, Báo cáo Khoa học Hội nghị tồn quốc Nghiên cứu khoa học sống, Trường ĐH Y Hà Nội, 1157-1159, 11/2005 [2] Ảnh hưởng vector chủng chủ lên biểu protein tái tổ hợp E coli: trường hợp protein VP28 virus gây hội chứng đốm trắng WSSV, Hội nghị toàn quốc Nghiên cứu khoa học sống, Trường ĐH Y Hà Nội, 1325-1328, 2005, 11/2005 [3] Ảnh hưởng protein "tag" lên tính tan protein dung hợp tái tổ hợp: trường hợp protein NS1 virus viêm não Nhật Bản, Hội nghị toàn quốc Nghiên cứu khoa học sống, Trường ĐH Y Hà Nội, 1343-1346, 2005, 11/2005 Trang Hội nghị tổng kết NCCB KHTN khu vực phía Nam năm 2005 Đánh giá kiến nghị Đề tài tiến hành nội dung đăng ký, có kết tốt, có 05 báo khoa học tạp chí nước, 03 báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc, đào tạo 02 thạc sĩ bảo vệ thành công 01 nghiên cứu sinh Đề tài tạo số sở khoa học thực tiễn cần cho việc ứng dụng công nghệ gen để sản xuất protein tái tổ hợp Việt Nam, đặc biệt kháng nguyên tái tổ hợp để chẩn đốn virút gây bệnh đốm trắng tơm sú insulin tái tổ hợp dùng để điều trị bệnh tiểu đường STUDY ON GENE EXPRESSION SYSTEMS IN E coli FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEIN ABSTRACT The research is to compare different commercially available expression systems in E coli and to suggest categories for the selection of a system which is most suitable for a targeted protein as well for fermentation and downstream step Results of this research provide the base for the process development in production and purification of recombinant protein for diagnosis, treatment and prevention of disease in human being, animals and plants Trang Tuyển tập báo cáo NCCB KHTN NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG KHÁNG UNG THƯ, CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY THUỐC VIỆT NAM BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ Mã số : 822004 Người chủ trì : PGS.TS HỒ HUỲNH THÙY DƯƠNG Cơ quan : Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên – ĐHQG Tp HCM Địa : 227, Nguyễn Văn Cừ, Q.5, Tp HCM Điện thoại : 304 924 Thành viên tham gia : 09 Tóm tắt mục đích, nội dung nghiên cứu Mục tiêu dài hạn đề tài góp phần đánh giá nguồn lợi thuốc Việt Nam nhằm có hướng khai thác bảo tồn hợp lý Mục tiêu ngắn hạn xây dựng hệ thống phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào kháng oxy hố thuốc Việt Nam sử dụng phương pháp để sàng lọc thuốc có hoạt tính mong muốn Nội dung nghiên cứu bao gồm - Xây dựng phương pháp xác định tác động gây apoptosis hoạt chất (khảo sát hàm lượng DNA toàn phần DNA phân tử lượng thấp, kính hiển vi huỳnh quang) - Xây dựng quy trình thử nghiệm dựa phương pháp flow cytometry để xác định hoạt tính kháng ung thư giai đoạn tác động hoạt chất - Áp dụng quy trình xây dựng để sàng lọc thu nhận hoạt chất từ chất chiết thực vật Kết nghiên cứu, ý nghĩa khoa học đạt 2.1 Kết nghiên cứu 2.1.1 Nghiên cứu đặc điểm, chế hình thành quy trình nhận biết apoptosis phương pháp - Thử nghiệm MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) - 2,5-diphenyltetrazolium bromide) - Thử nghiệm Trypan Blue - Phương pháp tách chiết DNA toàn phần điện di (thang DNA – DNA laddering) - Phương pháp tách chiết DNA phân tử lượng thấp điện di - Phương pháp nhuộm quan sát tế bào kính hiển vi phát huỳnh quang - Phương pháp Flow Cytometry (FC) với quy trình: (1) khảo sát thể tích tế bào độ đặc, (2) khảo sát nguyên vẹn màng sinh chất, (3) xác định mức độ Trang 10 ... thống phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng phân bào kháng oxy hoá thuốc Việt Nam sử dụng phương pháp để sàng lọc thuốc có hoạt tính mong muốn Nội dung nghiên cứu bao gồm - Xây dựng phương pháp. .. dựng phương pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn kháng phân bào thuốc Việt Nam sử dụng phương pháp để sàng lọc thuốc có hoạt tính mong muốn Nội dung nghiên cứu bao gồm : - Xây dựng phương pháp. .. quy trình nhận biết tác động kháng phân bào Các phương pháp sử dụng nuôi cấy Phương pháp bỏ đói (serum starvation) để đồng hố dịng tế bào - Phương pháp flow Cytometry nhận biết hàm lượng DNA với