Đang tải... (xem toàn văn)
Lúa là cây lương thực quan trọng thứ ba trên thế giới, 90% diện tích trồng lúa và tiêu thụ chủ yếu ở châu Á . Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau ở c
MỞ ĐẦU Lúa lương thực quan trọng thứ ba giới, 90% diện tích trồng lúa tiêu thụ chủ yếu châu Á Hiện lúa trồng điều kiện sinh thái khí hậu khác ba vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới ôn đới tất châu lục [8, 12] Việt Nam nước nông nghiệp với truyền thống trồng lúa nước xếp vào hàng nước xuất gạo hàng đầu giới Sản lượng gạo xuất năm 1999 lên tới 4,3 triệu song hiệu xuất khả cạnh tranh thị trường quốc tế thấp, nguyên nhân chất lượng gạo chưa đáp ứng nhu cầu phẩm chất thị hiếu người tiêu dùng Trong nhiều địa phương nước ta có giống lúa quý Tám Thơm, Tám Ấp Bẹ, Dự Thơm,Tẻ Di Hương hạt trong, cơm dẻo thơm ngon Đây giống có tiềm nâng cao giá trị xuất suất cịn thấp cao, thân mềm chống đổ kém, dài, mỏng rủ, hạt thưa, thời gian sinh trưởng kéo dài, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn [4, 11, 12] Bằng phương pháp chọn dòng tế bào mang biến dị soma Viện Công nghệ sinh học chọn tạo ba giống lúa DR1, DR2 DR3 cho suất cao, ổn định có khả chịu hạn, chịu lạnh tốt so với giống gốc X11 CR203 [14] Sử dụng công nghệ tế bào thực vật, công nghệ gen kết hợp với kỹ thuật gây đột biến tia gamma cho phép cải biến số đặc điểm nơng học cịn hạn chế giống lúa nêu theo hướng hạ thấp chiều cao cây, chống đổ rút ngắn thời gian sinh trưởng Mặt khác để nắm vững đặc điểm giống lúa đặc sản trước hết cần sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá đa dạng di truyền nhóm lúa Tám thu thập địa phương khác Xuất phát từ sở trên, thực đề tài "Đánh giá tính đa hình ADN khả chọn dịng tế bào đột biến số giống lúa đặc sản" Nhằm tìm mối quan hệ di truyền đánh giá khả tạo mô sẹo, tái sinh lúa từ mô sẹo xử lý tia gamma để xác định ngưỡng chiếu xạ thích hợp mơ sẹo số giống lúa đặc sản góp phần vào việc chọn tạo giống lúa Ch¬ng Tỉng quan tµi liƯu 1.1 øng dơng kü tht RAPD - PCR nghiên cứu đa hình ADN 1.1.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) Phơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Mullis CS phát minh năm 1985 Thực chất phơng pháp tạo dòng in vitro, không cần diện tế bào Điều kiện phản ứng PCR: ADN khuôn, đoạn mồi (mỗi mồi dài từ 18 24 nucleotit), Taq polymeraza (là enzym chịu nhiệt), bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), dung dịch đệm ion Mg++ [21] Trớc phản ứng PCR thêng dïng ADN polymeraza I cđa E.coli vµ T4 ADN polymeraza Các enzym bị bất hoạt nhiệt độ cao nên qua chu kỳ phản ứng phải phổ sung thêm enzym Việc phát loại ADN polymeraza bỊn nhiƯt (Vert ADN polymeraza, Pfu ADN polymeraza, Taq ADN polymeraza ) đà cho phép trình nhân đợc thực tự động hoá Ngoài độ bền nhiệt enzym khác khả kéo dài chuỗi ADN cần nhân Thông dụng Taq ADN polymeraza đợc tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus, sèng ë nguån níc nãng 940C- 1000C Enzym hoạt động tốt 700C - 800C Trọng lợng phân tử Taq ADN polymeraza 94 KD, gen tổng hợp dài 2499 cặp bazơ nitơ, mà hoá cho 832 axit amin [34] Năm 1988, Saiki đà hoạt tính Taq polymeraza giảm 50% sau 130 ë 92,50C; sau 40 ë 950C vµ sau 5-6 phút 970C Mặt khác, nồng độ ion Mg++ dNTP hỗn hợp phản ứng ảnh hởng nhiều đến hoạt tính Taq polymeraza [23, 34] Đoạn mồi đoạn oligonucleotit đợc thiết kế bổ sung với mạch ADN khuôn Để gắn mồi cách đặc hiệu, đoạn mồi thờng đợc tổng hợp dài tõ 18 - 24 nucleotit Ph¶n øng PCR dïng mét cặp mồi gồm mồi xuôi (forward) môi ngợc (reverse), mồi gắn với ADN khuôn theo chiều từ - ADN polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp đầu Nhìn chung, trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi nồng độ mồi phản ứng PCR nhân tố định thành công phản ứng Phản ứng PCR chuổi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn sau: - Giai đoạn 1: biến tính ADN (denaturing), nhiệt độ khoảng từ 94 0C - 950C, thời gian ngắn từ 30 giây - phút, để tách sợi ADN kép thành sợi ADN đơn - Giai đoạn 2: giai đoạn gắn mồi (annealing), nhiệt độ 400C - 600C, hai đoạn mồi gắn vào ADN khuôn vị trí mà tơng đồng theo nguyên tắc bổ sung hai đầu đoạn ADN cần nhân Nhiệt độ bớc gắn mồi tuỳ thuộc vào loại mồi cụ thể, đợc tính toán dựa nhiệt độ nóng chảy (Tm) đoạn mồi Vì giai đoạn định tính đặc hiệu phản ứng PCR Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) đoạn mồi: Tm =81.5 + 16.6 (log10{J+}) + 0.41 (%G + C) - (600/I) - 0.63 (%FA) [23] {J+} : nồng độ cation hoá trị I Trong đó: FA : chất dùng để gây biÕn tÝnh ADN I : chiỊu dµi cđa måi - Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài (extension) nhiệt độ 72 0C, ADN Taq polymeraza hoạt động tổng hợp, kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu Geifand White (1990) đà thông báo tốc độ tổng hợp Taq là: 150 nucleotit/giây 750C - 800C; >60 nucleotit/giây 700C; 24 nucleotit/gi©y ë 550C; 1,5 nucleotit/gi©y ë 370C; 0,25 nucleotit/gi©y ë 220C [23] Sau mét chu kú gåm ba giai đoạn nh trên, từ phân tử ADN khuôn đợc nhân lên thành hai, đoạn ADN vừa nhân chu kỳ lại làm khuôn cho chu kỳ nhân đầu tận sản phẩm bổ sung với mồi Do sau chu kỳ tổng hợp đựơc lợng ADN gấp đôi nh sau n chu kỳ nhân tạo 2n ADN khuôn ban đầu [13] Công thức: Trong đó: Y = x.2n Y: tổng số ADN x: số khuôn ADN ban đầu n: số chu kỳ PCR công cụ hữu hiệu cho việc phân tích genom động vật thực vật có khả tạo lợng lớn trình tự đặc hiệu ứng dụng PCR vào nhiều mục đích khác nhau, bao gồm xác định trình tự ADN đợc nhân bản, nhân quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định trình tự đặc hiệu từ cADN hay th viện gen, xác định sinh vật chuyển gen, phân tích tiến hoá, phân tích đa dạng di truyền mức độ ADN quần thể Hiện PCR đợc xem phơng pháp nhanh tơng đối đơn giản để đánh giá đợc chuyển gen [1, 26] 1.1.2 Kỹ thuật RAPD ứng dụng Để thực phản ứng PCR cần phải xác định trình tự nucleotit hai đầu đoạn gen cần nhân bản, để thiết kế đoạn mồi Trớc xuất máy đọc trình tự ADN tự động vấn đề gây nhiều khó khăn cho công tác nghiên cứu Do đó, nhà nghiên cứu nhanh chóng ủng hộ kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi có trình tự ngẫu nhiên Đợc sử dụng rộng rÃi kỹ thuật ®ã lµ kü thuËt RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA = Tính đa hình đoạn ADN đợc nhân ngẫu nhiên) Kỹ thuật đợc hai nhóm nghiên cứu (Williams CS, 1990) [37], (Welsh CS, 1990) [36] đồng thời xây dựng cách độc lập Nó kỹ cho phép phát tính đa hình đoạn ADN đợc nhân ngẫu nhiên việc dùng mồi đơn chứa trật tự nucleotit ngẫu nhiên Thờng mồi chứa từ đến 12 nucleotit tối thiểu nucleotit Có hàng ngàn loại mồi chứa khoảng 10 nucleotit nhng số lợng mồi đợc dùng nghiên cứu số hạn chế Trong phản ứng RAPD, mồi đơn gắn vào hai điểm khác hai mạch đơn đối diện đoạn ADN khuôn Nếu điểm bắn mồi nằm khoảng cách nhân đợc (thờng từ 200 đến 2000 nucleotit) đoạn ADN đợc nhân lên Sự có mặt sản phẩm chứng tỏ đà có tơng đồng hoàn toàn hay phần ADN genom với mồi oligonucleotit Từ nghiên cứu này, ngày kỹ thuật RAPD đà đợc thống theo phơng pháp Williams CS (1990) [37] sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên có chiều dài 10 nucleotit với thành phần G + C cao (60%) để bám chặt vào ADN khuôn Điểm khác RAPD so với PCR sử dụng mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit, trình nhân ADN ngẫu nhiên Đoạn mồi bám vào vị trí genom tìm đợc vị trí bổ sung Với chiều dài ngắn nên khả đoạn mồi tìm đợc đoạn tơng đồng mạch đơn ADN genom không khó khăn Vì RAPD phơng pháp có hiệu để xác định tính đa hình trật tự nucleotit cá thể Tùy vào nhóm loại thực vật hay vi sinh vật cụ thể mà đoạn mồi ngẫu nhiên đợc thiết kế đặc dụng Theo lý thuyết, số lợng đoạn ADN đợc nhân phụ thuộc vào độ dài vị trí gắn đoạn mồi, kích thớc mức độ phức tạp cấu trúc genom Kết sau điện di sản phẩm RAPD xuất nhiều phân đoạn khác Sự khác gọi tính đa hình Sự đa hình sản phẩm RAPD mức độ tơng đồng trình tự ADN genom với trình tự mồi kích thớc genom Độ tơng đồng cao phân đoạn nhiều Kỹ thuật RAPD giống PCR gồm ba giai đoạn nhng điểm khác giai đoạn gắn mồi RAPD có nhiệt độ bắt mồi thấp (từ 350C - 450C) Đây nguyên nhân dẫn đến có nhiều phân đoạn ADN đợc nhân ngẫu nhiên [2] RAPD phơng pháp có hiệu việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập đồ di truyền Kỹ thuật RAPD đợc sử dụng để nhận biết phân loại giống trồng khác nhau, đa dạng di truyền kiểu gen lúa nớc lúa nơng, đa dạng di truyền lúa Indica Japonica, xác định đa hình giống Yang Quiros đà sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự 10 nucleotit để nghiên cứu khác biệt 23 giống cần tây đợc chia làm ba nhóm Kết thu đợc trùng hợp sử dụng thị protein để phân loại giống cần tây (Yang Quiros, 1993) [38] Tơng tự nh nhiều tác giả đà sử dụng RAPD để lập chủng loại phát sinh loài nh: ngô, lúa gạo, lúa mì, [24, 29, 32] Orozco CS, (1994) [31] đà ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền tiến hoá giống cà phê đợc tai tạo từ loài bố, mẹ vùng sinh thái khác làm sở cho việc ghép cặp lai với mục đích tạo lai có đặc điểm quý để lai tạo giống cà phê Bùi Mạnh Cêng vµ CS, (2000) [6] cịng cho biÕt sư dụng kỹ thuật RAPD đà phân biệt đợc hai giống đậu Vetch lentil, giống hình thái (trọng lợng1000 hạt, màu sắc, kích thớc ) Điều có ý nghĩa lớn việc xác định độ di truyền nh mức độ lẫn tạp giới loại giống trồng Trong trình thiết lập mối quan hệ loài hay nhóm loài (Apostol CS, 1993) đà xây dựng kỹ thuật phân nhóm thông qua biểu đồ RAPD Thực chất kỹ thuật gồm ba bớc: Bớc 1: So sánh cặp đối tợng nghiên cứu cách tính toán khoảng cách quan hệ chúng Bớc 2: Lập ma trận gồm tất giá trị tính đợc trớc Bớc 3: Giải ma trận biểu diễn thành biểu đồ đặc trng Các giá trị biểu diễn khoảng cách cá thể đợc thiết lập theo hệ số tơng đồng Nei Li (1985) 2N S= AB NA + NB Trong ®ã NAB số băng có mặt hai loài A B; N A số băng có loài A; NB số băng có loài B Ngày nay, nhà nghiên cứu đà thiết lập đợc phần mềm máy tính để tự động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền đối tợng nghiên cứu sau nhập liệu băng nhân cá thĨ NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) lµ tên trơng trình thuộc kiểu để tạo biểu đồ hình Biểu đồ thu đợc thể mức độ gần cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di truyền cá thể đợc nghiên cứu Chơng trình cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu có độ xác cao nên phần mềm có hiệu việc phân tích kỹ thuật RAPD 1.2 Đặc điểm giống lúa Đặc sản miền Bắc Việt Nam nớc ta lúa giữ vị trí trọng yếu hệ thống lơng thực Ngày suất lúa gạo đà đáp ứng đủ nhu cầu nớc có d để xuất ngời ta quan tâm nhiều đến chất lợng gạo Các giống lúa đợc sản xuất diện tích lớn mặc suất cao nhng chất lợng cha đáp ứng đợc nhu cầu thị trờng đòi hỏi Vì vị trí giống lúa đặc sản ngày quan trọng việc nâng cao chất lợng gạo Việt Nam Các giống lúa đặc sản có chất gạo tốt có mùi thơm ngon thuộc nhóm lúa mùa vụ Đa số giống lúa ®ỵc trång ë mét sè tØnh thc khu vùc miỊn Bắc nớc ta (Thái Bình, Nam Định, Hà Tây, Hải Dơng, Hải Phòng ), nh Tám Xoan Hải Hậu, Tám ấp Bẹ Xuân Đài, Tám Cổ Ngỗng Nam Định, Dự Thơm, Tẻ Di Hơng Là giống lúa có tiềm xuất đáp ứng nhu cầu thiết thực nớc [12] Nhng giống lúa có diện tích gieo trồng ít, suất thấp không ổn định, có nhiều đặc điểm yếu nh c©y cao (tõ 145 -170 cm), th©n mỊm u, chèng đổ kém, dài rủ, hạt tha, cổ dài, chịu phân, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn có thời gian sinh trởng dài (từ 155-170 ngày) cần khắc phục nhợc điểm nói cho phù hợp với điều kiện canh tác vùng [11, 12] Vì việc nghiên cứu tạo đột biến thực nghiệm kết hợp với chọn dòng tế bào nhằm chọn tạo giống lúa chất lợng suất cao từ giống lúa địa phơng có ý nghĩa lớn không lúa mà giống trồng khác 1.3 nuôi cấy mô sẹo sở chọn dòng biến dị soma Năm 1898, lần đầu tiên, nhà thực vật học ngời Đức tên Haberlandt đà nhận xét: "Mỗi tế bào lấy từ thể thực vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Đó tính toàn tế bào" [1] Bất kỳ phận (mầm, rễ, thân, lá, nhị ), tạo nên hoàn chỉnh thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Mô sẹo (callus) khối tế bào mô mềm, có mức độ cấu trúc thấp, cha phân hoá, có khả phân bào liên tục thờng có tính biến động di truyền cao Trong nuôi cấy in vitro mô sẹo đợc tạo từ nuôi cấy quan thực vật (thân, lá, rễ, hạt, nhị ) môi trờng nuôi cấy thích hợp có chứa chất điều khiển sinh trởng cần thiết nh (auxin, cytokinin) điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm ) tối u Mô sẹo đợc trì môi trờng nuôi cấy cách cấy chuyển định kỳ, nhiên thực nghiƯm cho thÊy r»ng: m« sĐo qua cÊy chun nhiỊu lần khả tái sinh giảm rõ rệt tăng tính biến động di truyền mô [1, 9, 15] Các tế bào mô sẹo có tính ổn định di truyền thấp Vậy muốn nhân nhanh trì tính đồng di truyền thông qua mô sẹo số loài thực vật cần sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh hoàn chỉnh Những tái sinh từ mô sẹo thờng có biến đổi di truyền phong phú (dị bội, đa bội) biến đổi di truyền khác, điều có ý nghĩa chọn giống (Lê Trần Bình CS, 1998) [2], (Oono, 1983) [30] Bằng cách nhiều tác giả đà thông báo thu đợc giống trồng [3, 15, 20, 33] Thuật ngữ biến dị soma đợc Larkin Scowcroft (1982) [27] dùng để tất biến dị xảy trình nuôi cấy mô tế bào Biểu biến dị soma đợc quan sát thấy kiểu hình tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo Nguyên lý chung việc chọn dòng mang biến di soma tế bào nuôi cấy in vitro tần suất biến ®éng di trun dao ®éng tõ 10-5- 10-8 m«i trờng nuôi cấy bình thờng không xử lý đột biến, kết hợp với xử lý đột biến chất hoá học (EMS, BU ) loại xạ (tia UV, tia gamma ) tần số đột biến tăng lên gấp 10 - 100 lần, chọn cá thể đột biến nhanh có hiệu so với biện pháp chọn giống thông thờng khác áp dụng cho nguyên vẹn mức độ tế bào, tế bào đơn bội hầu nh đặc điểm đột biến đợc thể Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho phép giảm bớt đáng kể thời gian cần thiết để chọn đợc tính trạng theo ý muốn [22] Shepart CS (1980) qua nuôi cấy tế bào trần khoai tây đà chọn lọc đà thu đợc giống khoai tây có thời gian sinh trởng ngắn, củ đều, hình dạng đẹp chống chịu đợc điều kiện bất lợi môi trờng tốt so với giống gốc [trích dÉn tõ 1] Larkin vµ CS (1982) [27], Barwale vµ CS (1987) [19] cịng cho r»ng biÕn dÞ soma thêng xuất tái sinh đợc sau nuôi cấy tế bào qua giai đoạn mô sẹo Có nhiều kiểu đột biến nh: đột biến nhân, đột biến tế bào chất, đa bội thể bất thờng khác nhiễm sắc thể Trong nghiên cứu thực nghiệm Maliga (1984) [28] đà tiến hành xử lý tia cực tím tế bào trần thuốc xử lý tia gamma Co 60 với tế bào thuốc cho thấy tần số đột biến tăng lên 10 lần so với đối chứng Những tái sinh từ mô sẹo xử lý đột biến dễ mang biến động di truyền nhiễm sắc thể (di bội, đa bội) biến đổi di truyền khác.Vấn đề đà më mét triĨn väng lín viƯc c¶i tiÕn di truyền giống trồng có ý nghĩa kinh tế, tạo giống cho suất cao, chống chịu đợc điều kiện ngoại cảnh bất lợi, chất lợng tốt ổn định Nhiều công trình nghiên cứu đà thành công việc chọn dòng mang biến di soma đối tợng trồng khác đặc biệt lơng thực Theo Lê Trần Bình CS (1997) [1] chất chế biến dị soma liên quan mật thiết đến thay đổi genom tế bào nuôi cấy Do nhiều nguyên nhân nh tác động hoocmôn sinh trởng thời gian dài yếu tố khác làm cho nhiễm sắc thể tế bào nuôi cấy tăng lên tạo dạng đa bội lệch mức bội thể cao Nhiều trờng hợp khác, đoạn nhiễm sắc thể bị chuyển đổi đảo ngợc Cấu trúc phân tử ADN bị thay đổi dẫn đến thay đổi kiểu hình thực Adkins CS (1995) [18] thông báo đà chọn đợc dòng lúa chịu hạn tõ m« sĐo gièng lóa Khao Dawk Mali 105 b»ng việc bổ sung vào môi trờng nuôi cấy PEG 8000 Các tính trạng nông sinh học quan trọng khả chịu hạn đà trì ổn định hệ R2 Tơng tự số tác giả thu đợc dòng chịu nớc nh anh đào, cao lơng Sử dụng công nghệ tế bào thực vật kết hợp với kỹ thuật thổi khô mô sẹo (Đinh Thi Phòng CS, 2001) [15] đà chọn tạo thành công ba giống lúa DR1, DR2 DR3 ba giống lúa thấp cây, ngắn ngày, chịu nóng hạn, chịu lạnh khá, chống đổ, đẻ nhánh sinh trởng khoẻ, cho suất vợt giống gốc CR 203 Trong DR2 đà đợc công nhËn lµ gièng lóa Qc gia 1998 vµ hiƯn DR2 không đợc gieo trồng 12 tỉnh miền núi phía Bắc mà miền Trung (Kontum) Giống lúa DR3 đà qua ba vụ khảo nghiệm đợc triển khai mở rộng sản xuất vùng sinh thái khó khăn Tơng tự nh Viện lúa đồng Bằng sông Cửu Long đà chọn tạo thành công dòng lúa Khao 105 có tính ứng dụng dòng chịu muối triển vọng tõ gièng lóa Mét Bơi (Bïi B¸ Bỉng, 1997) [3] giống Khao 105 đà đợc công nhận giống Quốc gia Phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đà chọn tạo thành công giống lúa BR12 kháng bệnh đạo ôn, có nguồn gốc từ giống lúa CR203 Việc chọn đợc dòng tế bào kháng nấm bệnh, kháng chất diệt cỏ, kháng kháng sinh, kháng kim loại nặng, thích nghi tốt với yếu tố bất lợi môi trờng (nóng, lạnh, khô, hạn, chua, mặn ), nhiều đối tợng trồng khác có ý nghĩa to lớn nông nghiệp 1.4 Đột biến thực nghiệm ứng dụng chọn tạo giống trồng Vật chất di truyền đợc trì ổn định từ hệ sang hệ khác, nhng tuyệt đối, bị biến đổi tác nhân tự nhiên gây tạo nh tác nhân gây đột biến vật lý hoá học Ngời ta gọi biến đổi dù nhỏ cấu trúc gen nhiễm sắc thể đột biến [16] Trong chọn giống cổ điển để chọn đợc giống tốt, ổn định ngời ta phải cần từ đến 10 hệ đột biến tự nhiên suất với tần số thấp Trong phơng pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm), cần từ đến hệ, chí cá biệt có trờng hợp cần 2-3 hệ (Nguyễn Hữu Đống, 2000) [10] Với phơng pháp đột biến nhân tạo, sử dụng tác nhân gây đột biến lý hoá làm tăng nguồn đa dạng di truyền quần thể Trong hàng loạt đột biến xuất hiện, đột biến có lợi nhân trực tiếp thành giống đợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn giống Trong nhiều tác nhân gây đột biến tác nhân vật lý (tia Rơnghen, tia gamma, xạ nơtron ) tác nhân gây đột biến có hiệu quả, giúp chọn tạo giống trồng có tính trạng tốt (chịu hạn, kháng nấm, suất cao, chất lợng tốt, thời sinh trởng ngắn ) Nhiều tác giả xử dụng phơng pháp gây đột biến thực nghiệm tia gamma đà chọn tạo đợc nhiều giống trồng mới, đặc biệt lơng thực §èi víi chiÕu x¹ tia gamma tõ ngn Co 60 Cs137 có hoạt tính phóng xạ, tuỳ trờng hợp cụ thể sử dụng hai cách chiếu xạ: chiếu xạ thời gian ngắn với liều lợng cao chiếu xạ thời gian dài với liều lợng thấp [7] Bức xạ ion hoá gồm tia Rơnghen (tia X), tia gamma (tia ) hạt xạ nguyên tố phóng xạ giải phóng (các hạt , , proton, nơtron) Thuật ngữ ion hoá hàm ý muốn nói lợng chúng lớn tới mức phân tử nớc phân tử khác bi tác dụng bị phá vỡ thành phân tử tích điện Mọi dạng xạ ion hoá có hiệu ứng gây chết ®ét biÕn cho mäi tÕ bµo vµ virut Khi cã mặt ôxy, xạ ion hoá sản sinh gốc hydro peroxit nhiều chất có phản ứng mạnh Các chất tác động trực tiếp đến phân tử sinh học gây tổn thơng chúng, đặc biệt tác động lên genom làm biến đổi vật chất di truyền, tạo đột biến gen đột biến nhiễm sắc thể, đợc di truyền lại cho hệ sau [17] Các phân tử sinh học nh ADN dới tác dụng xạ ion hoá bị ba dạng tổn thơng sau: đứt gÃy mạch đơn (đứt gÃy khung đờng - photphat), đứt gÃy mạch kép thay bazơ nucleotit, ảnh hởng đến qua trình chép ADN - ARN tổng hợp protein Cần nhấn mạnh cần sai lệch nhỏ phân tử axít nucleic dẫn đến thay đổi lớn chế hoá sinh tế bào khuếch đại lên cách đáng kể Nhiễm sắc thể bị biến đổi cấu trúc (mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn), thay đổi số lợng nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) Khi chiếu xạ tia gamma từ nguồn Co60 lên tế bào mô phân tử sinh học chịu tác dụng trực tiếp gián tiếp xạ ion hoá: - Tác dụng trực tiếp: xạ trực tiếp ion hóa kích thích phân tử sinh học làm tổn thơng phân tử - Tác dụng gián tiếp: xạ ion hoá tác dụng lên phân tử nớc (chiếm 85 95% trọng lợng tế bào) với ion H+, OH-, tạo gốc tự OHã , Hã sản phẩm oxy hoá mạnh nh H2O2 chúng có khả hoạt động mạnh mặt hoá học, công phá phân tử sinh học làm thay đổi cấu trúc chức 10 11 GB1048 Tám Xoan Hải Hậu 12 GB1252 Tám Chiêm Hà Nam 13 GB1253 Tám Thơm 14 GB1254 Tám Ngọc Vạch 15 GB1381 Tám Thơm Hồng Quảng B 16 GB2365 T¸m Xoan 17 GB2373 T¸m xoan 18 GB2375 T¸m Thơm ấp Bẹ 19 GB5117 Tám Xuân Đài 20 GB5118 Tám Tiêu 2.2 phơng pháp nghiên cứu Phơng pháp nghiên cứu theo sơ đồ thí nghiệm tổng quát sau: Hạt giống lúa Tạo thu Tạo mô sẹo Tách ADN Xử lý đột biến Đánh giá đa hình ADN kỹ thuật RAPD Tái sinh xác định ngưỡng xử lý đột biến 14 Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2.1 Nghiên cứu tính đa hình ADN 20 giống lúa Tám 2.2.1.1 Kỹ thuật thu bảo quản Hạt lúa đợc bóc vỏ trấu, chọn hạt cho vào lọ thủy tinh có nút nhám khử trùng hạt theo trình tự sau: lắc nhẹ cồn 70% khoảng phút, 15 20 níc javen 60%, rưa s¹ch b»ng nớc cất vô trùng lần Sau chuyển hạt lên đĩa petri có giấy lọc vô trùng Hạt gạo đà khử trùng đợc cấy lên môi trờng MS b¶n, cã bỉ sung 1% saccharoza + 0.8% agaroza, pH = 5,8 Mật độ cấy 10-15 hạt/bình Nuôi ánh sáng đèn phòng cấy với cờng độ 2000 lux, thời gian chiếu sánh 10/24 giờ, nhiệt độ nuôi cấy 250C Sau tuần cắt thu lấy dùng bảo quản tủ lạnh sâu - 200C Thu non non có sản phẩm trao đổi chất gây trở ngại cho khả hoà tan ADN thu đợc 2.2.1.2 Tách ADN tổng số từ lúa Quy trình tách chiết ADN tổng số từ lúa dựa theo phơng pháp tách ADN cđa Egnin, 1998 a) Ho¸ chÊt sư dơng: 1M Tris-HCl, pH = 8.0; 5M NaCl; 0.5 EDTANa2; PVP; 5% SDS (Sodium dodecyl sulfate); RnazaA 10 mg/ml; 3M CH3C00Na, pH 5,3 or pH 7.0; TE (10 mM Tris, pH=8.0 + 1mM EDTA, pH=8.0); isopropanol; Phenol: Chlorofom: Isoamyl (25:24:1) vµ Cån 80% b) Pha đệm tách ADN: Bảng 3: Nồng độ hoá chất tách ADN tổng số Nồng độ chuẩn Nồng ®é cÇn pha Trong 50 ml 1M Tris - HCl, pH = 8.0 50mM 2.5ml 5M NaCl 300Mm 3ml 0.5M EDTA 20Mm 2ml 15 Polyvinyl pyrolydine 2% 1g 10% Muèi natri ascobat 0,1% 0,5ml 20% Saccrosin 1,5% 3,75ml 1% 0.5g Metabisulfit H2O cất 38,5 ml c) Quy trình tách ADN tỉng sè: - Thu 1-2 gam l¸ lóa non, nghiỊn nhanh nitơ lỏng cối chày sứ Bớc nghiền phải làm nhanh để thu đợc ADN có phân tử lợng lớn Nghiền nitơ lỏng đảm bảo mẫu đợc nghiền triệt để, ADN thu đợc có dạng sứa, có phân tử lợng cao, không đứt đoạn - Chuyển nhanh sản phẩm nghiền vào ống eppendorf, đá cho vào tủ lạnh sâu -20 cần dùng - Thêm 9-12 ml dung dịch đệm tách ADN trộn cách đảo ngợc nhẹ Nếu dùng ống eppendorf ml thêm 500 àl - 1ml đệm A trộn - Giữ đá 2-5 phút, Thêm ml dung dÞch (Phenol: Chlorofom: Iso amin) (25: 24: 1) đảo có màu trắng sữa, cho vào đá - Ly tâm với tốc độ 10.000 - 12.000 vßng/phót, ë 40C 15 - Chun dịch sang ống eppendorf mới, có chứa 9ml dung dịch Iso propanol (nhẹ nhàng không khuấy cặn) Dịch lọc qua màng lọc vô trùng trớc thêm Iso propanol - Đảo để nhiệt độ 40C, 10-30 phút (hoặc cho kết tủa qua đêm nhiệt độ 0C) - Ly tâm với tốc độ 8.000 vòng/phút, 40C 3-5 phút ADN lớn thấy lơ lửng, không ly tâm số vòng lớn 10.000 vòng/phút phút - Loại bỏ phần dịch trên, làm khô phần kết tủa (không làm khô lâu) máy Speed-Vac - Hoà tan kết tủa 500 àl TE, vật liệu ban đầu dùng ít, để C qua đêm cho cục kết tủa hết ADN không bị gÃy - Thêm -7 àl enzym RnazaA, trộn đ ë 370C 30 16 - Ly t©m 14.000 vòng/phút chuyển dịch sang ống 1,5ml cẩn thận không bị khuấy cặn - Thêm 100àl CH3C00Na, lắc thêm 1ml Isopropanol để kết tủa lại - Ly tâm 10.000 vòng/phút phút 40C, loại bỏ dịch thêm 1ml cồn 80% - Ly tâm14.000 vòng/phút, bỏ dịch cồn làm khô máy Speed-Vac (ADN phải khô hoà tan hoàn toàn TE) - Hoà tan lại 50 - 100 àl TE, để qua đêm , bảo quản ADN -200C 2.2.1.3 Phơng pháp xác định hàm lợng độ ADN a) Điện di trªn gel agaroza: - Pha agaroza 0.8% TBE 0.5X, đun nóng, để nguội khoảng 600C đổ vào khuôn gel 30ml có cài lợc - Sau 30 phút tháo lợc ra, đổ đệm chạy điện di TBE 0.5X ngập bảng gel 1mm - LÊy 2µl DNA mÉu + 1µl Thuèc nhuộm 10X + 7àl H2O trộn Dùng pipet cho vào giếng - Chạy điện di: 60V, 70 phút - Nhuém gel: nhuém gel b»ng Ethidium bromid 0.5 µg/ml 10 phút, rửa nớc - Soi gel đèn UV chụp ảnh b) Đo máy đo quang phổ hấp thụ: - Đo máy đo quang phổ có chơng trình xử lý máy vi tính - Vùng đo bớc sóng 260nm-280nm - Chỉnh cân máy: dùng nớc cất vô trùng để làm chuẩn - Kiểm tra máy: đo mẫu ADN chuẩn đà biết trớc nồng độ - Đo mẫu: cho 995àl nớc cÊt vµ 5µl ADN mÉu vµo cuvet (hƯ sè pha loÃng 200 lần), lắc đặt vào máy đo - Sau lần đo phải rửa cuvet - In kết đo đợc Tính toán hàm lợng độ ADN: 17 Hàm lợng ADN (ng/àl) = 50 ì HSPLìOD260 Độ ADN = OD260/OD280 HSPL: hệ số pha loÃng 50: số OD260: số đo đợc bớc sóng 260nm OD280: số đo đợc bớc sóng 280nm Nếu độ ADN = 1,8 - 2,0 mẫu đợc coi mẫu 2.2.1.4 So sánh RAPD a) Đoạn mồi Đoạn mồi ngẫu nhiên sử dụng cho việc phân tích genom đợc tổng hợp máy Gene assembler (Pharmacia) Viện Công nghệ Sinh học Trình tự đoạn mồi dài 10 nucleotit đợc thiết kế dựa tài liệu Monna CS (1994) Các đoạn mồi có ký hiệu trình tự là: Måi RA31: 5’ AACCGACGGG 3’ Måi RA46: 5’ CCAGACCCTG 3’ Måi RA32: 5’ TGCCCTGCCT 3’ Måi RA50: 5’ GCTGTGCAGC 3’ Måi RA36: 5’ GGGGGTCGTT3’ Måi RA142: 5’ CAATCGCCGT 3’ Måi RA40: 5’ GGCGGACTGT 3’ Måi RA143: 5’ TCGGCGATAG 3’ Måi RA45: 5’ TACCACCCCG 3’ 10 Måi RA159: 5’ GTCCACACGG 3’ b) Phản ứng PCR-RAPD - Mỗi ống phản ứng PCR có 25 àl dung dịch chứa: 1X đệm PCR; 2.5 mM MgCl2; 100 àM 4dNTP; 200 nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymeraza 50 100 ng ADN khuôn - Trộn hỗn hợp thu đợc (thao tác đá để đảm bảo hoá chất không hoạt tính) - Tiến hành nhân máy PCR-Thermal Cycler PTC100 theo chÕ ®é: 18 Bíc 1: 940C phót; bíc 2: 920C phót; bíc 3: 350C phót; bíc 4: 720 phót; bíc 5: 72 0C 10 phót; bớc 6: lu giữ 40C Từ bớc đến bớc lặp lại 45 chu kỳ b) Điện di sản phẩm RAPD Pha agaroza 1,5% TBE 0,5X đun nóng, để nguội khoảng 600C đổ vào khuôn gel có cài lợc, sau 30 phút tháo lợc ra, đổ đệm chạy điện di TBE 0,5X ngập gel mm Lấy 2,5 àl thuốc nhuộm 10X cho vào ống sản phẩm, trộn Dùng pipet cho hỗn hợp vào giếng chạy điện di: 80V, 150 phút Nhuộm gel b»ng Ethidium bromid 0,5 µg/ml 10 phót, rưa nớc, soi gel đèn UV chụp ảnh c) Phân tích số liệu RAPD Dựa xuất hay không xuất phân đoạn ADN điện di sản phẩm RAPD với đoạn mồi ngẫu nhiên 20 giống lúa Tám để làm sở cho việc phân tích số liệu Tiêu chuẩn hoá sản phẩm RAPD theo qui ớc: Số 1: xuất phân đoạn ADN Số 0: không xuất phân đoạn ADN Các số liệu đợc xử lý máy vi tính theo chơng trình NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) để lập biểu đồ so sánh hệ số tơng đồng di truyền 20 giống lúa Tám mức độ phân tử 2.2.2 Phơng pháp chọn dòng đột biến nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2.1 Tạo mô sẹo a) Các loại môi trờng dïng nu«i cÊy: - M«i trêng C1: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 0,1 mg/l NAA + 0,2 mg/l BAP + mg/l 2,4D - M«i trêng C2: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + mg/l 2,4D - M«i trêng R: MS + 3% saccharoza + 0,8% agaroza + 0,2 mg/l NAA + mg/l BAP, pH = 5,8 b) Kỹ thuật tạo mô sẹo lúa: 19 Hạt lúa chín đợc bóc vỏ trấu, chọn hạt cho vào lọ thuỷ tinh có nút nhám khử trùng theo trình tự sau: khử trùng cån 70 thêi gian phót, javen 60% thời gian từ 15 - 20 phút (lắc đều), sau rửa nớc cất vô trùng - lần Đặt hạt lên đĩa petri, có lót giấy thấm vô trùng, để hạt khô, hạt lúa đà đợc khử trùng đem cấy vào môi trờng tạo mô sẹo C1 C2 khoảng 15 - 20 hạt/bình tam giác 250 ml, ®Ĩ bng tèi ë nhiƯt ®é 250C, sau tuần để ánh sáng với cờng độ 2000 Lux, thêi gian chiÕu 10 giê/ngµy, ë 250C Sau -3 tuần khối mô sẹo đợc tạo thành tiến hành đánh giá khả tạo mô sẹo 2.2.2.2 Xư lý m« sĐo b»ng tia gamma tõ ngn Co60 Mô sẹo đợc tạo sau tuần, chọn lọc mô đẹp, đợc cắt nhỏ khoảng - mm cấy vào môi trờng nhân mô sẹo tiến hành xử lý chiếu xạ tia gamma từ nguồn Co60 Chiếu xạ mô sẹo với liều lợng là: 3Krad, 5Krad, 7Krad, 9Krad, 11Krad 13Krad Mô sẹo đà xử lý chiếu xạ đợc nuôi cấy lên môi trờng tái sinh (R) sau tuần đánh giá tû lƯ sèng chÕt cđa m« sĐo tõng liỊu chiÕu 2.2.2.3 Tái sinh từ mô sẹo sau xử lý đột biến Mô sẹo sau xử lý đột biến đợc cấy lên môi trờng tái sinh, nhiệt độ phòng 250C, dới ánh sáng đèn neon với cờng độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày Sau tuần nuôi cấy đánh giá chọn lọc mô tái sinh, số tái sinh Các dòng tái sinh đợc cấy chuyển sang môi trờg MS có bỉ sung 2% saccharoza + 0,8% agaroza C¸c chåi lóa tái sinh đợc tách thành dòng cấy lên môi trờng tạo hoàn chỉnh (MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA), nuôi cấy điều kiện nh Trớc đa ruộng, phải đợc cấy chuyển vài lần để khoẻ có khả thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên 2.2.2.4 Phơng pháp tính toán số liệu Các phép tính toán đợc sử dụng chơng trình phần mềm excel a) Xác định tỷ lệ tạo mô sẹo (Ci) CI = Ncf ì100% Nt CI:: tỷ lệ mô sẹo tính theo % Ncf: số hạt tạo mô sẹo Nt: tổng số hạt nuôi cấy 20 b) Xác định tỷ lƯ sèng sãt cđa m« sĐo (SV) SV = Nsv ×100% Nt SV: tû lƯ m« sèng sãt (%) NSV: sè m« sèng sãt Nt: tỉng sè m« xư lý c) Xác định tỷ lệ tái sinh ( RC) RC = Nr ì100% Nsv RC: tỉ lệ tái sinh (%) Nr : số mô tái sinh NSV: số mô sống sót Chơng Kết thảo luận 3.1 Phân tích tính đa hình ADN giống lúa tám 3.1.1 kết tách chiết ADN tổng số Để thực đợc phản ứng RAPD ADN sạch, không bị đứt gÃy nguyên liệu định đến thành công cho trình nghiên cứu Kết kiểm tra chất lợng xác định nồng độ ADN cho thấy mẫu ADN thu đợc có chất lợng tốt Cụ thể điện di gel agaroza cho thấy ADN tập trung băng chính, không bị đứt gÃy (hình 1) đo OD ë bíc sãng 260 nm 280 nm th× phỉ hÊp thụ có đỉnh hấp phụ 260 nm (hình 2) Các mẫu ADN thu đợc có độ tinh cao cụ thể số tû lƯ OD260/OD280 thÊp nhÊt lµ 1,800 ë hai gièng GB0315, GB0319 vµ cao nhÊt lµ 1,913 ë gièng GB2375 (bảng 4) Nh vậy, kết tách chiết ADN từ lúa đà thu đợc mẫu ADN có trọng lợng phân tử lớn, đủ tiêu chuẩn để tiến hành phản ứng RAPD Bảng 4: hàm lợng độ tinh mẫu ADN Tên mẫu Hàm lợng Độ tinh ADN AND (ng/àl) Tên mẫu Hàm lợng Độ tinh ADN (ng/àl) ADN 21 GB0310 GB0311 GB0312 GB0313 GB0314 GB0315 GB0316 GB0317 GB0318 GB0319 1066,8 2280,7 1135,6 2279,5 1062,9 1935,6 1327,0 618.33 671,5 1209,7 1,882 1,880 1,868 1,882 1,803 1,800 1,856 1,823 1,812 1,800 GB1048 GB1252 GB1253 GB1254 GB1381 GB2365 GB2373 GB2375 GB5117 GB5118 978,63 673,23 825,47 1056,7 315,73 1438,8 373,23 1711,17 494,27 920,6 1,863 1,856 1,828 1,889 1,832 1,902 1,808 1,913 1,812 1,904 ảnh Hình 2: Kết điện di kiểm tra ADN tỉng sè t¸ch tõ c¸c gièng lóa 22 Hình 3: Phổ hấp phụ ADN tách từ giống lúa 3.1.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD Trong nghiên cứu sử dụng 10 måi ngÉu nhiªn (ký hiƯu RA31; RA32; RA36; RA40; RA45; RA46; RA50; RA142; RA143 RA159) có độ dài 10 nucleotit để phân tích tính mức độ khác di truyền 20 giống lúa Tám Kết nhận đợc 10 mồi biểu tính đa hình nhng có 6/10 mồi cho thấy tính đa rõ mồi: RA31, RA36, RA45, RA46, RA142 RA159 Điện di sản phẩm RAPD với 10 mồi 20 giống lúa Tám thu đợc 889 phân đoạn ADN Dới kết phân tích RAPD víi måi RA36, RA46 vµ RA142: a) Måi RA36 ảnh 23 : xuất phân đoạn ADN; không xuất phân đoạn ADN Hình 4: Kết điện di s¶n phÈm RAPD cđa 20 gièng lóa víi måi RA31 (thứ tự giống nh bảng 5) M: Thang ADN chuÈn (ADN λ c¾t b»ng Hind II + Ecol RI) Ghi chó: Sè 1: GB0310, 2: GB0311, 3: GB0312, 4: GB0313, 5: GB0314, 6: GB0315, 7: GB0316, 8: GB0317, 9: GB0318, 10: GB0319, 11: GB1048, 12: GB1252, 13: GB1253, 14: GB1254, 15: GB1381, 16: GB2365, 17: GB2373, 18: GB2375, 19: GB5117 20: GB5118 Kết điện di sản phÈm RAPD cđa c¸c gièng víi måi RA36 cã tõ đến 12 phân đoạn ADN genom lúa đợc nhân ngẫu nhiên (bảng 5) Kích thớc phân đoạn có chiều dài ớc tình từ 0,46Kb đến 2,5Kb Đây loại mồi tạo đa hình phong phú (hình 4) Trong giống GB0313 (cột 4) GB0316 (cột 7) có số phân ADN đợc nhân ban nhiều 12 phân đoạn, giống GB1381(cột 15) có phân đoạn đợc nhân Bảng 5: Các phân đoạn ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng RAPD với mồi RA36 CDƯT (Kb) Đ Số thứ tự giống* ĐN 1 1 1 1 1 2 2.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2.0 0 0 0 0 0 0 0 1 1.62 1 1 1 1 1 0 1 1 1.5 0 0 0 0 0 0 1 1.4 0 0 1 0 0 0 0 0 1.3 0 1 1 0 0 0 0 0 1.2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0.95 1 1 1 1 1 0 1 1 0.9 10 11 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 12 13 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 14 15 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 16 17 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 7 12 11 10 12 10 11 5 11 10 0.85 0.8 0.75 0.7 0.6 0.55 0,46 TPĐ Ghi chú: * số thứ tự giống nh hình 4; CDƯT: chiều dài ớc tính; ĐĐN: Đoạn đợc nhân; TPĐ: Tổng phân đoạn; Số 1: phân đoạn ADN đợc nhân; số phân đoạn ADN không đợc nhân Tính đa hình đợc thể xuất hay không xuất phân đoạn ADN so sánh giống với Trong 20 giống lúa tám nghiên cứu có giống GB2373 (cột số 17) xuất phân đoạn ADN vị trí 0,46Kb 1,0Kb (mũi tên) hay vị trÝ 0,7Kb cét sè gièng GB0316 xt hiƯn ph©n đoạn ADN Ngợc lại vị trí 2,5Kb ba giống GB2373 (cét sè 17), GB1381 (cét sè 15) vµ GB0318 (cột số 9) phân đoạn ADN đợc nhân vị trí 1,2 Kb cho thấy giống GB0312 (cột số 3) không xuất phân đoạn AND Từ kết phân tích cho phép nhận xét giống lúa Tám nghiên cứu đà có sai khác di truyền b) Mồi RA46 Điện di sản phÈm RAPD víi måi RA46 cđa c¸c gièng lóa chóng nhận đợc kết tơng tự nh mồi RA36 Xuất từ đến 11 phân đoạn AND đợc nhân ngẫu nhiên giống có kích thớc ớc lợng khoảng từ 0,5Kb đến 2,5Kb so với thang ADN chuẩn (bảng 6) Ví dụ: vị trí 0,6Kb cã hai gièng GB0314 (cét sè 5) vµ gièng GB1254 (cột số 14) phân đoạn ADN đà không đợc nhân bản, tơng tự vị trí 1,4Kb hai giống GB0318 (cột số 9) GB0319 (cột số 10) phân đoạn không đợc nhân (hình 5) Trong 20 giống lúa nghiên cứu có giống GB5117 (cột số 19) xuất phân đoạn ADN vị trí 0,8Kb Tại nhiều vị trí khác cho thấy số giống có phân đoạn ADN đợc nhân bản, số giống khác 25 phân đoạn ADN không đợc nhân Phân tích RAPD giống lúa Tám với mồi RA46 đà sai khác di truyền giống ảnh : xuất phân đoạn ADN; không xuất phân đoạn ADN Hình 5: Kết điện di sản phẩm RAPD 20 giống lúa víi måi RA46 ( thø tù c¸c gièng nh hình 4) M: Thang ADN chuẩn (ADN cắt Hind II + Ecol RI) Bảng 6: Các phân đoạn ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng RAPD với mồi RA46 CDƯT Đ (Kb) Số thứ tự gièng* § N 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2.5 0 0 1 0 1 1 1 1 2.1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1.95 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1.7 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1.6 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1.4 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1.25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 26 1.15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.9 10 1 0 1 1 1 1 1 1 0.8 11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.75 12 0 1 0 0 0 0 0 0.65 13 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0.6 14 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.5 15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 10 9 8 10 10 10 10 11 10 11 11 TPĐ Ghi chú: * số thứ tự giống nh hình 4; CDƯT: chiều dài ớc tính; ĐĐN: Đoạn đợc nhân; TPĐ: Tổng phân đoạn, Số 1: phân đoạn ADN đợc nhân; số phân đoạn ADN không đợc nhân c) Mồi RA142 Hình 6: Kết điện di sản phẩm RAPD 20 gièng lóa víi måi RA142 (thø tù c¸c gièng nh hình 4) M: Thang ADN chuẩn (ADN cắt b»ng Hind II + Ecol RI) 27 : xuÊt hiÖn phân đoạn ADN; không xuất phân đoạn ADN Bảng hình cho thấy kết điện di sản phẩm RAPD với mồi RA142 có từ đến phân đoạn ADN giống đợc nhân Các phân đoạn ADN nhân có chiều dài ớc tính từ 0,5Kb đến 1,8Kb Mặc dù số phân đoạn ADN nhân không nhiều nhng tính đa hình ADN 20 giống nghiên cứu Ví du: vị trí 1,6Kb; 1,65Kb 1,8Kb có hai giống GB0312 (cét sè 3) vµ GB1381 (cét sè 15) cã phân đoạn ADN xuất Tại vị trí 0,7Kb giống GB1254 (cột số 14) phân đoạn AND đà không đợc nhân so với giống khác Kết nhận đợc cho phép khẳng định có hệ số sai khác di truyền 20 giống lúa Tám Bảng 7: Các phân đoạn ADN đợc nhân ngẫu nhiên phản ứng RAPD với mồi RA142 CDƯT Đ (Kb) Số thứ tự giống* Đ 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 N 1.8 0 0 0 0 0 0 0 0 1.65 0 0 0 0 0 0 0 0 1.6 0 0 0 0 0 0 0 0 1.1 1 1 1 0 1 1 0 1 0.9 1 1 1 1 0 0 1 1 0.8 1 0 0 0 0 0 0 0 0.7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.65 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 4 4 3 3 4 TPĐ Ghi chú: * số thứ tự giống nh hình 4; CDƯT: chiều dài ớc tính; ĐĐN: Đoạn đợc nhân; TPĐ: Tổng phân đoạn, Số 1: phân đoạn ADN đợc nhân; số phân đoạn ADN không đợc nhân Kết điện di sản phẩm RAPD 20 giống lúa tám với 10 ngẫu nhiện đà thu đợc 889 phân đoạn ADN (bảng 8) Bình quân giống xuất 44,5 phân 28 ... Hạt giống lúa Tạo thu Tạo mô sẹo Tách ADN Xử lý đột biến Đánh giá đa hình ADN kỹ thuật RAPD Tái sinh xác định ngưỡng xử lý đột biến 14 Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2.1 Nghiên cứu tính đa. .. nghiên cứu tính đa hình ADN 20 giống lúa Tám có nguồn gốc khác đợc trình bày bảng 2 Đối tợng dùng nghiên cứu chọn dòng đột biến giống lúa: Tám Xoan, Tám ấp Bẹ, Dự Thơm Tẻ Di Hơng Tất giống lúa đợc... tần số đột biến tăng lên gấp 10 - 100 lần, chọn cá thể đột biến nhanh có hiệu so với biện pháp chọn giống thông thờng khác áp dụng cho nguyên vẹn mức độ tế bào, tế bào đơn bội hầu nh đặc điểm đột