Đang tải... (xem toàn văn)
kỹ thuật lai huỳnh quang
TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRÊN VI SINH VẬTSVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠTMSSV : 60604096GVHD : NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN MỤC ĐÍCH Cung cấp chính xác thông tin về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống của vi sinh vật. 1. Quy trình thực hiện•Chuẩn bị mẫu và đầu dò.•Trộn mẫu với đầu dò.•Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào.•Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai.•Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang trực tiếp).•Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả. 1. Quy trình thực hiệnĐầu dò- Đầu dò: Là những oligonucleotide dài từ 15 đến 30 bp, có trình tự bổ sung với các rRNA 16S của tế bào vi sinh vật. 1. Quy trình thực hiệnĐánh dấu huỳnh quang lên đầu dòCó 2 cách cơ bản: - Đánh dấu trực tiếp: không cần bước dò tìm sau quá trình lai. - Đánh dấu gián tiếp: đánh dấu bằng một số hợp chất chỉ thị trung gian, đồng thời phải tiến hành dò tìm sau quá trình lai. 1. Quy trình thực hiện 1. Quy trình thực hiệnThuốc nhuộm huỳnh quangĐặc điểm quan trọng: các chất huỳnh quang có các mức năng lượng kích thích và phát xạ khác nhau.Cho phép phát hiện đồng thời hai hay nhiều vi sinh vật khi chỉ lai một lần duy nhất. 1. Quy trình thực hiệnThuốc nhuộm huỳnh quangTên thuốc nhuộmBước sóngMàuKích thích (nm)Phát xạ (nm)AMCA 351 450 Xanh dươngFITC* 492 528 Xanh lá câyFluoXE** 488 520 Xanh lá câyTRITC*** 557 576 ĐỏTexas Red 578 600 ĐỏCy3 550 570 Cam/ĐỏCy5 651 674 Hồng ngoại 1. Quy trình thực hiệnChuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộMục đích: đưa được số lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích RNA, đồng thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng.Hình thức: ngâm mẫu trong các dung dịch hoặc xử lý bằng enzym. [...]... thể chưa rõ nguồn gốc Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư 4 Triển vọng của FISH Tại Việt Nam Việc phát triển kỹ thuật FISH ở Việt Nam trong tương lai có nhiều triển vọng vì đầu tư cho kỹ thuật này phù hợp với điều kiện kinh tế và khoa học kỹ thuật của nước ta Cám ơn sự lắng nghe của quý thầy cô và tất cả các bạn! ...1 Quy trình thực hiện Lai Yêu cầu: Kết hợp chính xác các đầu dò đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ sung với chúng với số lượng lớn nhất 1 Quy trình thực hiện Lai Điều kiện: Môi trường tối ẩm Nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ 1 Quy trình thực hiện Quan... tử với tín hiệu màu đỏ Đầu dò REX72 gắn nhãn huỳnh quang với các ribotype DA001 của Bacillus 3 Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật Dò tìm vi khuẩn bacillus mang gen DA001 sử dụng ba chất nhuộm khác nhau trên cùng một mẫu đất 3 Ứng dụng của FISH Hệ vi sinh vật trong nước thải FISH sử dụng các đầu dò oligonucleotideđược tạo ra bằng những kỹ thuật phân tử như PCR để nghiên cứu các quần... xử lý tín hiệu Kính hiển vi có trang bị dải lọc nhiều tần (hoặc kính hiển vi laze quét đồng tiêu) Máy ảnh CCD Phần mềm xử lý ảnh kỹ thuật số 1 Quy trình thực hiện Kính hiển vi laze quét đồng tiêu 2 Trở ngại của FISH Kết quả không chính xác Các chất tự phát huỳnh quang Đầu dò thiếu tính đặc hiệu 2 Trở ngại của FISH Không thu được kết quả Số lượng đầu dò quá ít Cấu trúc của đầu dò hay trình... Thực hiện hoàn toàn tự động, nhanh chóng chẩn đoán chính xác vi sinh vật - Kết hợp FISH với đánh dấu miễn dịch, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế gây bệnh của vi khuẩn 4 Triển vọng của FISH Trên thế giới - Kỹ thuật FISH với độ nhạy cao, sử dụng được đối với mRNA, một trình tự không ổn định và có số lượng bản sao thấp - Sử dụng đầu dò acid nucleic peptide trung hòa điện thay cho oligonucleotide 4 Triển vọng... các đầu dò oligonucleotideđược tạo ra bằng những kỹ thuật phân tử như PCR để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn trong nước thải, bùn hoạt tính 3 Ứng dụng của FISH Vi sinh vật cộng sinh Khi sử kỹ thuật FISH với các trình tự rRNA 16S, các vi khuẩn cộng sinh có thể được phát hiện, từ đó tiến hành định danh và phân cấp phát sinh loài 3 Ứng dụng của FISH Ứng dụng vào y học Nghiên cứu các quần... dụng FISH để phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus trong đất đồng cỏ tại Hà Lan Đây là một loại vi khuẩn hình que, có chứa ribotype DA001 16S rRNA 3 Ứng dụng của FISH Sự đa dạng của vi sinh vật Quá trình lai được thực hiện trong dung dịch bao gồm: Dung dịch đệm (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2) Formamide 20% Đầu dò oligonucleotide REX72 (5’TGGGAGCAAG CTCCCAAAG-3’) . TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRÊN VI SINH VẬTSVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠTMSSV : 60604096GVHD. dò tìm sau quá trình lai. 1. Quy trình thực hiện 1. Quy trình thực hiệnThuốc nhuộm huỳnh quang ặc điểm quan trọng: các chất huỳnh quang có các mức năng