Đang tải... (xem toàn văn)
Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN MƠN HỌC CHUN NGÀNH TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ_FISH (FLORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION) TRÊN VI SINH VẬT GVHD : Th.s NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN SVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠT MSSV : 60604096 TPHCM, tháng 6/2010 LỜI CẢM ƠN Với tất thành kính, tơi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Huyền – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực đồ án Các thầy cô môn Công Nghệ Sinh Học truyền đạt cho kiến thức quý báu có liên quan đến đề tài Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – học tập, trao đổi kinh nghiệm giúp đỡ tơi suốt q trình làm việc http://www.ebook.edu.vn ii TÓM TẮT NỘI DUNG Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ_ FISH (fluorescence in situ hydridization) đời từ năm 1989 đến xem công cụ mạnh nghiên cứu nhiều ngành khoa học, bật sinh thái học, mơi trường học, chẩn đốn phát sinh lồi Bằng bước xử lý bản: chuẩn bị mẫu đầu dò, cố định mẫu, lai, rửa mẫu, quan sát ta thu thơng tin xác hình thái, số lượng, khơng gian phân bố hay thành phần môi trường đối tượng nghiên cứu Trên giới ứng dụng FISH nhiều lĩnh vực, tương lai FISH sử dụng để tăng cường hiệu biểu nhiều công cụ nghiên cứu khác Ở Việt Nam nghiên cứu sử dụng FISH hạn chế, chủ yếu ứng dụng chẩn đốn bệnh di truyền Do việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật nước ta tương lai mở bước tiến việc nghiên cứu chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển http://www.ebook.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT NỘI DUNG iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH HÌNH VẼ vi DANH SÁCH BẢNG BIỂU vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH 3.1 Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH 3.2 Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang 3.3 Chuẩn bị mẫu xử lý sơ 10 3.4 Lai đầu dị trình tự đích đặc hiệu 11 3.5 Quan sát xử lý tín hiệu 11 CHƯƠNG NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH 14 4.1 Kết khơng xác 14 4.1.1 Các chất tự phát huỳnh quang 14 4.1.2 Đầu dị thiếu tính đặc hiệu 15 4.2 Kết âm tính 16 4.2.1 Số lượng đầu dò 16 4.2.2 Những cấu trúc phức tạp đầu dò hay trình tự đích 17 4.2.3 Hàm lượng rRNA thấp 17 http://www.ebook.edu.vn iv 4.2.4 Ảnh chụp bị màu 18 4.3 Biện pháp khắc phục 18 CHƯƠNG ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT FISH 19 5.1 Sự đa dạng vi sinh vật 19 5.2 Hệ vi sinh vật nước thải 22 5.3 Vi khuẩn cộng sinh 23 5.4 FISH y học 24 5.4.1 Các quần thể vi khuẩn phức tạp 24 5.4.2 Phát mầm bệnh mô cấy dụng cụ vô trùng 29 5.4.3 Nấm 30 5.4.4 Thuốc thú y 31 5.4.5 Các mầm bệnh thực vật 31 5.4.6 Phát mầm bệnh phương pháp lai không sử dụng chất huỳnh quang 32 CHƯƠNG TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH 33 6.1 Trên giới 33 6.2 Tại Việt Nam 36 CHƯƠNG TỔNG KẾT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 http://www.ebook.edu.vn v DANH SÁCH HÌNH VẼ Hình 1: Các bước phương pháp FISH .4 Hình 2: Các cách đánh dấu đầu dò Hình 3: Kính hiển vi quét laze đồng tiêu 11 Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang Paraformaldehyde tế bào Candida albicans 12 Hình 5: Kết hiển thị cho trình lai để phát vi khuẩn Bacillus ribotype DA001 với ba chất nhuộm khác mẫu đất 19 Hình 6: Nhuộm huỳnh quang lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm 22 Hình 7: FISH quan sát màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 TRE I .23 DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1: Một số thuốc nhuộm sử dụng để dị tìm vi sinh vật phương pháp FISH http://www.ebook.edu.vn vi DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ISH : In Situ Hybridization FISH : Florescence In Situ Hybridization rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid DNA : Deoxyribonucleic Acid PCR : Polymerase Chain Reaction CCD : Charged Coupled Device CLSM : Confocal Laser Scanning Microscope TSA : Tyramid Signal Amplification http://www.ebook.edu.vn vii CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG MỞ ĐẦU Việc nhận biết có mặt vi sinh vật môi trường tự nhiên chủ yếu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy cổ điển phương pháp cấy chuyền kết hợp với lựa chọn môi trường đặc hiệu gặp khó khăn nghiên cứu lồi vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng chậm chưa phân lập Một nhược điểm tốn nhiều thời gian có tính chọn lọc cao Hơn nữa, kỹ thuật không phản ánh mối tương quan đối tượng nghiên cứu với môi trường xung quanh [9] Từ thực tế trên, nhiều kỹ thuật đại đời PCR, lai liên tiếp, lai trình tự, nhiên khơng khắc phục hồn tồn nhược điểm kể kỹ thuật nuôi cấy cổ điển Nguyên nhân để thực kỹ thuật địi hỏi phải có lượng mẫu lớn, điều nghĩa phải qua giai đoạn cấy chuyền nhiều thời gian; quan trọng phương pháp đại chứng minh có mặt đối tượng nghiên cứu mà khơng cung cấp xác thơng tin hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường sống vi sinh vật Kỹ thuật lai chỗ ISH (in situ hydridization) đời từ năm 1961 hai nhóm nghiên cứu độc lập Pardue, Gall John đề xuất khắc phục tất vấn đề kể Tuy nhiên tính khơng an tồn người, mơi trường phức tạp thao tác mà kỹ thuật ISH cải tiến thành FISH Lai huỳnh quang chỗ FISH (fluorescence in situ hydridization) từ đời trở thành công cụ mạnh nghiên cứu nhiều ngành khoa học, bật sinh thái học, mơi trường học, chẩn đốn phát sinh loài FISH kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê định vị tế bào vi khuẩn FISH không cho phép nhận vi sinh vật quen thuộc, biết môi trường ni cấy đặc hiệu mà cịn xác định vi sinh vật lạ, chưa biết rõ điều kiện mơi trường ni cấy, FISH giúp biết rõ hệ thống phức tạp quần thể vi sinh vật FISH kết hợp xác kỹ http://www.ebook.edu.vn CHƯƠNG MỞ ĐẦU thuật di truyền phân tử quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình dung nhận biết tế bào vi khuẩn môi trường tự nhiên hay mô bệnh Độ nhạy tốc độ thực đặc điểm bật giúp FISH trở thành công cụ nghiên cứu hữu hiệu Trên giới, FISH sử dụng việc mô tả quần thể vi sinh vật môi trường tự nhiên, bật hệ vi sinh vật trầm tích biển Wadden [88], vịnh hẹp Na-uy [115], sinh vật phù du sông biển [6,52,73,82], tuyết hồ núi cao [155], đất [37] bề mặt rễ thực vật [92] FISH đặc biệt phổ biến y học, mục đích xác định mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh đường hơ hấp, tiêu hóa, bệnh lây qua đường máu, ung thư…) FISH sử dụng để chẩn đoán thường qui bất thường cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh sau sinh) thai nhi Ở Việt Nam nghiên cứu sử dụng FISH hạn chế, chủ yếu ứng dụng chẩn đoán bệnh di truyền Do việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật nước ta tương lai mở bước tiến việc nghiên cứu chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp ni cấy cổ điển Nhận thức vai trị, tầm quan trọng triển vọng phát triển FISH nghiên cứu giới vi sinh vật, tiến hành vào tìm hiểu kỹ thuật khn khổ báo cáo đồ án môn học http://www.ebook.edu.vn CHƯƠNG LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU CHƯƠNG LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH Năm 1969 : kỹ thuật lai chỗ ISH (in situ hydridization) đời hai nhóm nhà khoa học độc lập Pardue, Gall John Trong phương pháp này, DNA 28S-RNA có đánh dấu phóng xạ đem lai với DNA có nỗn bào chủng vi khuẩn Xenopus, sau dị tìm kỹ thuật phóng xạ tự ghi Kỹ thuật cho phép chuỗi acid nucleic xâm nhập vào tế bào mà không làm chết tế bào, làm thay đổi đến hình thái tế bào hay tính toàn vẹn phận bên tế bào Khi phân tích cấp độ đơn bào phương pháp lai chỗ cung cấp tranh chi tiết vi sinh vật so với lai dot blot Nó khơng xác định hình thái tế bào loài vi sinh vật chưa ni cấy mà cịn phân tích phân bố không gian chúng Xác định số lượng tín hiệu phát oligonucleotide rRNA đích cho phép ước tính tỷ lệ tăng trưởng tế bào riêng lẻ Từ đời, ISH không ngừng cải tiến nhằm nghiên cứu tiến hóa nhiễm sắc thể, phân tích nhiễm sắc thể khối u, tế bào ung thư bạch cầu nghiên cứu di truyền học tế bào loài Cuối vào năm 1988, Giovanoni cộng áp dụng thành công phương pháp vi khuẩn, họ người sử dụng đầu dò oligonucleotide rRNA đánh dấu đồng vị phóng xạ để phát vi khuẩn thơng qua kính hiển vi Những năm sau đó, với phát triển chất dán nhãn huỳnh quang [76,109,110], kỹ thuật đánh dấu đồng vị phóng xạ thay thuốc nhuộm huỳnh quang Năm 1989, DeLong lần sử dụng oligonucleotide đánh dấu chất huỳnh quang để dị tìm vi sinh vật đơn bào So với đầu dị phóng xạ, đầu dị huỳnh quang sử dụng an tồn hơn, gây hại môi trường sức khỏe người, kết thu xác khơng cần phải thực bước dị tìm (vì http://www.ebook.edu.vn ... CỦA KỸ THUẬT FISH 19 5.1 Sự đa dạng vi sinh vật 19 5.2 Hệ vi sinh vật nước thải 22 5.3 Vi khuẩn cộng sinh 23 5.4 FISH y học 24 5.4.1 Các quần thể vi. .. phát sinh loài FISH kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê định vị tế bào vi khuẩn FISH không cho phép nhận vi sinh vật quen thuộc, biết môi trường ni cấy đặc hiệu mà cịn xác định vi sinh. .. tin hình thái hay phân bố khơng gian vi sinh vật, thực phát huy hết khả phân tích định lượng tự động, phân tích vi khuẩn dịch huyền phù hay hỗn hợp vi sinh vật phù du thực đối tượng vi sinh vật
![của viêm răng [24]. Số lượng lớn các vi khuẩn hình xoắn và sự đa dạng hình thái của chúng - Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật](https://media.store123doc.com/figures/001/126/viem-luong-khuan-hinh-xoan-dang-hinh-chung-1126330.png)
![đã được phát hiện thông qua FISH trên các vết bẩn của mảng bám răng (hình 7) [100]. Hơn nữa, cấu tạo và phân bố không gian của các xoắn khuẩn trong khoang - Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật](https://media.store123doc.com/figures/001/126/phat-hien-thong-mang-phan-xoan-khuan-khoang-1126332.png)