ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HỒ THỊ HUYỀN TRÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HỒ THỊ HUYỀN TRÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Đà Nẵng – Năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Hồ Thị Huyền Trân ii NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM Học viên: Hồ Thị Huyền Trân Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60420201 Khóa: K32 Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHĐN Tóm tắt Cao chiết rễ an xoa chiết xuất dung môi methanol 40% theo phương pháp siêu âm điện cực nhiệt độ 60oC thời gian 50 phút với tần số 25 kHz cho hàm lượng flavonoid cao có giá trị 10,933 mgCE/g ± 0,101a Cao chiết dịch chiết có hoạt tính kháng oxy hóa tốt với giá trị IC50 271,900 µg/mL 302,850 µg/mL Cao chiết rễ có khả kháng khuẩn với vịng kháng khuẩn 20,667 mm ± 1,155a E coli 16,667 mm ± 1,1528a Samonella nồng độ 652 µg/ml An xoa xem nguồn thực vật tự nhiên đầy tiềm hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa kháng khuẩn Từ khóa: An xoa, flavonoid, chiết xuất, kháng oxy hóa, kháng khuẩn EXTRACTION AND DETERMINATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF FLAVONOIDS FROM HELICTERES HIRSUTA LOUR QUANG NAM Abstract The Root of Helicteres hirsuta Lour was extracted with solvent of methanol 40% by electrodeposition ultrasonic at 60oC for 50 minutes with a frequency of 25 kHz show the highest flavonoid content of 10.933 mg/g ± 0.101a Extracts and extract solution have the best antioxidant activity with an IC50 value that are 271,900 μg/mL and 302,850 μg mL The roof extracts had antibacterial activity with zones of inhibition of 20,667mm ± 1,155a against E coli and 16,667mm ± 1,1528a against Samonella at concentration 652 µg/ml Helicteres hirsuta Lour can be regarded as promising candidates for natural plant soures of antioxidant and antibacterial activities Key words: Helicteres hirsuta Lour, flavonoid, extracts, antioxidants, antibacterial iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài .2 Cấu trúc luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) 1.1.1 Phân loại .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái An xoa 1.1.3 Công dụng An xoa 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY AN XOA 1.2.1 Các nghiên cứu giới 1.2.2 Các nghiên cứu nước 1.3 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID .6 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Phân loại hợp chất flavonoid 1.3.3 Phân bố flavonoid thực vật 10 1.3.4 Hoạt tính sinh học hợp chất flavonoid 11 1.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID .13 1.4.1 Khái niệm phương pháp chiết tách .13 1.4.2 Phương pháp chiết tách hợp chất flavonoid 14 1.4.3 Các phương pháp chiết tách dung môi .15 1.4.4 Một số phương pháp chiết tách khác 16 1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH CHIẾT 18 1.5.1 Dung môi 18 1.5.2 Những yếu tố kỹ thuật 18 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.1.1 Nguyên liệu 21 2.1.2 Thiết bị, hóa chất 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Xác định số thành phần hóa học lá, thân rễ An xoa .22 2.2.2 Phương pháp tách chiết xác định hàm lượng flavonoid toàn phần 24 iv CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY AN XOA 33 3.2 PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN CATECHIN 34 3.3 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID TỒN PHẦN CĨ TRONG CÁC BỘ PHẬN KHÁC NHAU CỦA CÂY AN XOA 35 3.4 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT .36 3.5 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT .37 3.6 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG FLAVONOID TỒN PHẦN TRONG Q TRÌNH CHIẾT .38 3.6.1 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng flavonoid tồn phần q trình chiết .38 3.6.2 Ảnh hưởng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi đến hàm lượng flavonoid tồn phần trình chiết 39 3.6.3 Ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid tồn phần trình chiết .40 3.7 TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID TỒN PHẦN TỪ RỄ CÂY AN XOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT RSM 41 3.8 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU 44 3.9 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CÓ TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY AN XOA 45 3.10 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG PHÂN BÀO TỪ CAO CHIẾT CỦA RỄ CÂY AN XOA 48 3.10.1 Đánh giá khả kháng khuẩn từ cao chiết rễ An xoa .48 3.10.2 Đánh giá khả gây độc tế bào 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (BẢN SAO) v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AOAC CE DC DPPH EA HAD80 IC50 MeOH PE OD R/L SRB TCVN V/v : Association of Official Analytical Chemists : Catechin equivalents : Dicloromethane : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl : Ethyl acetate : Sấy nóng khơng khí 800C : Inhibitory concentration 50% : Methanol : Petroleum ether : Optical Density - Mật độ quang : Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi : Sulforhodamine B : Tiêu chuẩn Việt Nam : Thể tích/thể tích vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 1.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Tên bảng Trang Tính chất lý học dung môi Độ nhớt sức căng bề mặt số dung môi thường gặp nhiệt độ 200C (xếp theo thứ tự tăng dần) Nhân tố mức độ bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box- behnken Mơ hình thí nghiệm tác động qua lại nhân tố Một số thành phần hóa học có bột An xoa Nhân tố mức độ bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box- behnken Kết hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ An xoa thu qua thí nghiệm Mức ý nghĩa hệ số hồi quy Phân tích phương sai (ANOVA) phương trình hồi quy cho q trình chiết có hỗ trợ siêu âm điện cực Hàm lượng flavonoid tồn phần có dịch chiết cao chiết Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH dịch chiết rễ An xoa dung mơi methanol 40% có hỗ trợ phương pháp siêu âm điện cực Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH cao chiết rễ An xoa dung mơi methanol 40% có hỗ trợ phương pháp siêu âm điện cực Giá trị IC50 dịch chiết cao chiết từ rễ An xoa dung môi methanol 40% phương pháp siêu âm điện cực điều kiện tối ưu Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Tỷ lệ (%) gây độc tế bào cao chiết dòng tế bào ung thư Gan Hep - G2 nồng độ 100 µg/mL 14 18 27 28 33 41 41 42 43 45 46 47 48 48 50 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Số hiệu hình đồ thị 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 Tên hình đồ thị Trang Hình ảnh An xoa Cấu trúc flavonoid Phân loại flavonoid Cấu trúc anthocyanidin Cấu trúc Catechin Gallocatechin Cấu trúc flavan 3,4-diol Một số chất flavanon có thực vật Cấu trúc flavonol Cấu trúc dihydrochalcon Sơ đồ thực đề tài Mẫu nguyên liệu Sơ đồ tinh cao chiết flavonoid từ An xoa Đồ thị phương trình đường chuẩn catechin A: Dung mơi methanol 40%; B: Dung môi ethanol 40%; C: Dung môi chloroform 40% Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng phận khác An xoa đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng phương pháp chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng dung môi chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần Biểu đồ chu tuyến 3D (A) biểu đồ bề mặt 2D (B) xác định vùng giá trị cho điều kiện Các điều kiện tối ưu trình chiết flavonoid toàn phần từ rễ An xoa phương pháp siêu âm điện cực dung môi methanol 40% 7 8 9 10 20 21 30 35 36 37 38 38 39 40 44 44 viii Số hiệu hình đồ thị 3.10 3.11 3.12 3.13 Tên hình đồ thị Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự DPPH hàm lượng flavonoid khác có dịch chiết từ rễ An xoa Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự DPPH hàm lượng flavonoid khác có cao chiết từ rễ An xoa Ảnh thực phản ứng khử gốc tự DPPH nồng độ flavonoid toàn phần khác Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Trang 46 47 48 49 2-Way Interaction 0.15764 4.98% 0.15764 0.05255 0.314 Thời gian*Cường độ SSA 0.00000 0.00% 0.00000 0.00000 0.00 1.000 Thời gian*Tỷ lệ NL/DM 0.15764 4.98% 0.15764 0.15764 4.62 0.084 Cường độ SSA*Tỷ lệ NL/DM 0.00000 0.00% 0.00000 0.00000 0.00 1.000 Error 0.17073 5.40% 0.17073 0.03415 Lack-of-Fit 0.15764 4.98% 0.15764 0.05255 8.03 0.113 Pure Error 0.01309 0.41% 0.01309 0.00654 Total 14 3.16285 100.00% Model Summary S R-sq R-sq(adj) PRESS R-sq(pred) 0.184784 94.60% 84.89% 2.55166 19.32% Coded Coefficients Term Effect Coef SE Coef 95% CI TValue P-Value Constant 10.602 0.107 ( 10.328, 10.876) 99.38 0.000 Thời gian 0.3615 0.1807 0.0653 ( 0.0128, 0.3487) 2.77 0.040 Cường độ SSA -0.3185 -0.1593 0.0653 (-0.3272, 0.0087) 2.44 0.059 Tỷ lệ NL/DM 0.4474 0.2237 0.0653 ( 0.0558, 0.3916) 3.42 0.019 Thời gian*Thời gian -0.8790 -0.4395 0.0962 (-0.6867, -0.1923) 4.57 0.006 Cường độ SSA*Cường độ SSA -1.0701 -0.5351 0.0962 (-0.7823, -0.2879) 5.56 0.003 Tỷ lệ NL/DM*Tỷ lệ NL/DM -0.7279 -0.3640 0.0962 (-0.6111, -0.1168) 3.78 0.013 Thời gian*Cường độ SSA 0.0000 0.0000 0.0924 (-0.2375, 0.2375) 0.00 1.000 Thời gian*Tỷ lệ NL/DM 0.3970 0.1985 0.0924 (-0.0390, 0.4360) 2.15 0.084 Cường độ SSA*Tỷ lệ NL/DM 0.0000 0.0000 0.0924 (-0.2375, 0.2375) 0.00 1.000 Term VIF Constant Thời gian 1.00 Cường độ SSA 1.00 Tỷ lệ NL/DM 1.00 Thời gian*Thời gian 1.01 Cường độ SSA*Cường độ SSA 1.01 Tỷ lệ NL/DM*Tỷ lệ NL/DM 1.01 Thời gian*Cường độ SSA 1.00 Thời gian*Tỷ lệ NL/DM 1.00 Cường độ SSA*Tỷ lệ NL/DM 1.00 Regression Equation in Uncoded Units Catechin = -11.81 + 0.0991 Thời gian + 3.131 Cường độ SSA + 0.01183 Tỷ lệ NL/DM - 0.001099 Thời gian*Thời gian - 0.1338 Cường độ SSA*Cường độ SSA - 0.000036 Tỷ lệ NL/DM*Tỷ lệ NL/DM + 0.00000 Thời gian*Cường độ SSA + 0.000099 Thời gian*Tỷ lệ NL/DM 0.000000 Cường độ SSA*Tỷ lệ NL/DM 1.54 Fits and Diagnostics for Unusual Observations Obs Catechin Fit SE Fit 95% CI HI Cook’s D 9.791 9.593 0.160 (9.181, 10.004) 0.75 1.39 10.203 10.401 0.160 (9.990, 10.813) 0.75 1.39 Obs DFITS 12.0228 R -12.0228 R R Large residual Resid Std Resid Del Resid 0.199 2.15 6.94 -0.199 -2.15 -6.94 Residual Plots for Catechin Contour Plots of Catechin Surface Plots of Catechin Response Optimization: Catechin Parameters Response Goal Catechin Maximum Solution Lower 9.18815 Target 10.6889 Upper Weight Importance Cường Catechin Composite Solution Thời gian độ SSA Tỷ lệ NL/DM Fit Desirability 55.8586 11.6970 239.394 10.6836 0.996480 Multiple Response Prediction Variable Setting Thời gian 55.8586 Cường độ SSA 11.6970 Tỷ lệ NL/DM 239.394 Response Fit SE Fit 95% CI 95% PI Catechin 10.6836 0.0999 (10.4267, 10.9405) (10.1436, 11.2236) Optimization Plot Hình Hình ảnh xây dựng phương trình tối ưu Minitab 17 ... Trân ii NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM Học viên: Hồ Thị Huyền Trân Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã...ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HỒ THỊ HUYỀN TRÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM Chuyên... ứng dụng vào dược phẩm loại thực phẩm chức định chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu chiết tách xác định hoạt tính sinh học flavonoid từ An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Quảng Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xây